蒲公英葉斑病病原分離鑒定與生物學特性研究

張自強 李繼平 鄭果 許彬彬 翟艷青 惠娜娜 王立 馬婭楠

摘 要 為明確甘肅省定西市渭源縣等地蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz）葉斑病病原菌及其生物學特性。采用組織分離法對病原菌進行分離，通過觀察病原菌形態特征、柯赫氏法則致病性測定，并基于ITS、? TEF1、? rpb2基因序列分析，對病原菌進行鑒定。引起蒲公英葉斑病的病原真菌為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima），其在 PSA培養基上長勢最好；最佳生長碳源為葡萄糖，可溶性淀粉最適合產孢；最佳生長氮源為有機氮源蛋白胨；最適生長的 pH為 8；最適生長溫度為 25 ℃。

關鍵詞 蒲公英；葉斑?。患殬O鏈格孢；生物學特性

蒲公英（Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.）別名黃花地丁、婆婆丁、華花郎等。菊科多年生草本植物[1]。

蒲公英可藥食兩用，是中國國家中藥保護植物之一，主要分布在中國西南及華北等地[2-3]。因其具有易栽培、生長迅速等特點在中國甘肅等地果園中常將其當做綠肥。

近幾年隨著蒲公英在食用、醫藥以及農業領域受重視程度不斷增加，市場對其質量要求也愈發嚴格。明確蒲公英各種病害，提升其質量成為切實需要解決的問題。

2022年6月，在甘肅省定西市渭源縣發現一種蒲公英葉部病害。受侵染的植株葉片出現褐色斑點，形狀圓形或近圓形，嚴重影響蒲公英的產量和質量。

據報道，蒲公英病害有銹病[4]、莖腐病[5]，但筆者未見國內外有關蒲公英葉斑病的詳細報道。因此，本研究對甘肅省渭源縣田間蒲公英病葉上分離到的病原菌，進行形態學鑒定、致病性測定以及基于? ITS、? TEF1、? rpb2基因序列分子生物學鑒定，同時測定其生物學特性，旨在明確其病原種類和發生規律，進而為蒲公英葉斑病的田間診斷和防治提供理論基礎和參考依據。

1 材料與方法

1.1 蒲公英葉斑病病原菌的分離和純化

蒲公英葉斑病樣本采自甘肅省定西市渭源縣。采用組織分離法[6]，對癥狀典型的葉片，用無菌水沖洗干凈后，在超凈工作臺內晾干，用滅菌后的解刨刀在蒲公英葉片病健交界處切取5 mm×5 mm大小的組織塊，用75%的酒精消毒30 s后，浸入5% NaClO中1～2 min，最后在無菌水中浸泡3次，晾干后接入PDA平板中，25 ℃恒溫培養5 d，得到分離菌株。將得到的菌株連續純化3次，得到的純化菌株于4 ℃保存，備用。

1.2 病原鑒定

1.2.1 形態學鑒定 將接有病原菌的PDA平板放于25 ℃培養箱中5 d后，觀察并記錄菌落顏色、大小、輪廓形狀，挑取菌絲制作玻片，在光學顯微鏡下觀察病原菌菌絲以及孢子形態，參考真菌鑒定手冊進行病原鑒定。

1.2.2 病原菌的致病性測定 根據柯赫氏法則[7]，采用離體葉片菌餅接種與孢子懸浮液噴灑進行測定。摘取健康的蒲公英葉片，用75%酒精表面擦拭消毒，用滅菌水沖洗干凈待表面水分晾干，備用。

菌餅接種：用5 mm的打孔器在純化好的菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種于蒲公英葉片一側，另一側接無菌PDA作為對照，不進行刺傷處理。將處理過的葉片放入滅菌后的托盤中，用保鮮膜密封保濕，每天觀察發病情況。出現病斑后進行重新分離純化，與原菌株一致的為致病菌株。

孢子懸浮液接種：將純化后的菌株培養7 d后，刮取菌落用無菌水稀釋，后使用血球計數板統計孢子數量，配置成1×107 mL-1孢子懸浮液，并將其均勻噴灑在準備好的葉片上。將處理過的葉片放入滅菌后的托盤中，用保鮮膜密封保濕，每天觀察發病情況。對出現的病斑進行重新分離純化，與原菌株一致的為致病菌株。

1.2.3 分子生物學鑒定 將PDA培養基上? 25 ℃恒溫培養7 d左右的待測菌，用無菌接種刀刮取菌絲體于1.5 mL離心管中晾干，將晾干后的菌絲用液氮冷凍并研磨成粉末，-20 ℃冷凍保存，備用。DNA提取按照北京索萊寶科技有限公司生產的真菌基因組DNA提取試劑盒（Fungi Genomic DNA Extraction Kit）進行，將提取出的DNA于-20 ℃冷凍保存。

用ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）/ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）、TEF1-728F（CATCGAGAAGTTCGAGAAGG）/TEF1- 986R（ACTTGAAGGAACCCTTACC）、RPB2-5F（GAYGAYMGWGATCAYTTYGG）/fRPB2-7CR（CCCATRGCTTGYTTRCCCAT）[8-10] 3種引物對病原菌基因組進行PCR擴增，擴增體系為? 25? μL：Taq Master Mix聚合酶12.5 μL，上、下游引物各? 1 μL，DNA模板1.0 μL，無菌超純水補充至? 25 μL。PCR程序：94? ℃預變性5 min，?? 94? ℃變性40 s，58? ℃退火40 s，72? ℃延伸30 s，共35個循環，72? ℃延伸10 min，4? ℃保存。擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，將測序結果在NCBI中比對，選擇相關屬種序列利用MEGAX構建系統發育樹。

1.3 病原菌生物學特性

1.3.1培養基對病原菌生長的影響 選用PDA、PSA、WA、OA、黑麥、蒲公英煎葉6種培養基。

菌絲生長測定：將分離純化后得到的菌株在PDA培養基上培養7 d，在菌落邊緣用直徑為? 5 mm的打孔器打取菌餅，分別將菌餅接到制備好的培養基中，每皿接種1塊，置于25 ℃恒溫培養箱中培養，7 d后用十字交叉法測量菌落直徑，菌落直徑減去菌餅直徑5 mm則為菌落生長直徑。每處理5次重復[11]。

產孢量測定：將分離純化后得到的菌株在PDA培養基上培養7 d，在菌落邊緣用直徑為? 5 mm的打孔器打取菌餅，分別將菌餅接到制備好的培養基中，每皿接種1塊，置于25 ℃恒溫培養箱中，培養7 d后用20 mL無菌水洗脫孢子，用血球計數板測出產孢量，每處理重復5次。培養基配方見表1。

1.3.2 碳源對病原菌生長的影響 以Czapek培養基[6]為基礎培養基，用等量的葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、甘露醇代替其中的碳源，對照為不加碳源平板。數據測量方法同“1.3.1”。

1.3.3 氮源對病原菌生長的影響 以Czapek培養基[6]為基礎培養基，分別用蛋白胨、甘氨酸、硫酸銨、牛肉浸膏等量替換察氏培養基中的氮源，對照為不加氮源平板。數據測量方法同“1.3.1”。

1.3.4 不同pH對菌落生長的影響 分別設置pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，7個梯度。數據測量方法同“1.3.1”。

1.3.5 不同溫度對菌落生長的影響 以5 ℃為一個梯度，設置區間5 ℃～30 ℃內6種溫度條件。數據測量方法同“1.3.1”。

2 結果與分析

2.1 田間癥狀與致病性測定

通過對甘肅省定西市渭源縣等地的蒲公英葉片上的病害進行調查，蒲公英葉斑病典型癥狀為：葉片病害早期為針尖大小黃褐色斑點，后期病斑逐漸擴大，病斑內部顏色變淺，外部顏色變深為褐色，病灶內部凹陷，病斑大多為近圓形和橢圓形，病斑最外圍有環狀隆起。根據柯赫氏法則，采用菌餅接種和孢子懸浮液噴灑接種法，將分離出的病原菌接種于健康蒲公英葉片5? d后，出現的病斑與田間癥狀基本一致，重新分離出的病原菌與接種病原菌一致（圖1）。

2.2 病原菌的形態特征

將保存的病原菌轉接于制備好的PDA平板上，放入25 ℃恒溫培養箱培養5 d，菌落初期為白色，隨時間推移顏色逐漸變深呈墨綠色，氣生菌絲白色，菌絲發達，菌落形狀規則呈近圓形，邊緣白色，后期有輪紋出現。鏡檢結果顯示：病原菌菌絲為透明狀，分生孢子梗分枝少，分生孢子頂生，呈長橢圓形或倒棒狀，表面光滑，通常有1～6個橫隔，0～3個縱膈膜，分隔處隘縮，頂端有短喙，孢子長18.3～47.6 μm、寬4.7～13.5 μm（圖2）。

2.3 病原菌分子生物技術鑒定

用引物ITS、TEF1、rpb2對蒲公英葉斑病病原菌進行PCR擴增，并將產物送測后分別得到519 bp（ITS）、255 bp（TEF1）、960 bp（rpb2） 3條DNA片段。Blastn分析結果顯示，菌株PHB與Alternaria tenmissima同源性為98%～99%（圖3～5）。結合致病性與形態學特征，確定該病原菌為細極鏈格孢（Alternaria tenmissima）。

2.4 病原菌的生物學特性

2.4.1 培養基對病原菌生長的影響 細極鏈格孢在不同的培養基上，菌落生長速度有明顯的差異。在PSA培養基上，細極鏈格孢菌落生長最快，平均菌落直徑為52.05 mm，菌絲發達致密，菌落呈墨綠色，邊緣整齊。相比之下，在蒲公英煎葉培養基和OA上，細極鏈格孢菌落的生長速度稍慢，平均直徑較小，平均菌落直徑分別為50.48 mm、51.69 mm，但仍然比其他培養基要大。在黑麥培養基上，細極鏈格孢菌落的生長情況最差。菌落呈灰綠色，直徑在所有處理中最小，為23.82 mm。

除了生長速度和形態的差異外，細極鏈格孢在不同培養基上的產孢量也存在較大的差異。細極鏈格孢在PSA培養基上產孢量最大，可達? 10.50×106mL-1。蒲公英煎葉培養基和OA產孢量次之，其他3種培養基上產孢量相對較少（圖6）。

2.4.2 碳源對病原菌生長的影響 由圖7可見，選取的供試碳源中，致病菌對葡萄糖的利用效果最好。經過7 d的培養后，觀察到葡萄糖處理的平均菌落直徑為79.36 mm，顯著大于其他處理。此外，葡萄糖處理的菌絲濃密，菌落長勢良好。最差的是甘露醇，其平均菌落直徑僅為39.96 mm，顯著低于其他碳源處理。

在供試碳源中，可溶性淀粉處理的產孢效果最好，達到了2.60×106 mL-1。其次是甘露醇和葡萄糖，它們的產孢效果稍遜于可溶性淀粉。蔗糖和乳糖的產孢效果較差。

2.4.3 氮源對病原菌生長的影響 由圖8可見，試驗選取的氮源對菌絲的生長均有一定程度的促進作用。其中，蛋白胨是5種氮源中促進菌絲生長效果最佳的一種。使用蛋白胨作為氮源時，菌落的長勢良好，促進效果明顯，菌落直徑可達到72.82 mm。牛肉膏的促進效果稍弱，菌落直徑為71.26 mm。甘氨酸和硝酸鈉的促進效果次之，菌落直徑分別為49.68 mm和48.99 mm。而以硫酸銨作為氮源的培養基，菌落的長勢最差，菌落直徑僅為26.27 mm。

蛋白胨和牛肉膏也對病原菌的產孢有著明顯的促進作用。在使用蛋白胨和牛肉膏作為氮源時，病原菌的孢子數分別為2.77×106 mL-1和2.57×106 mL-1。而硝酸鈉和甘氨酸的產孢效果較差，硫酸銨則完全不產孢。

2.4.4 pH對病原菌生長的影響 圖9表明：一定程度上的pH波動對病原菌的生長影響不大，經過多次嘗試之后發現，pH低于5時PDA的凝固效果較差，所以設置5、6、7、8、9、10、11，7個pH梯度。通過測定菌落直徑發現，當pH為8時菌落長勢最好，菌落直徑為74.80 mm，當pH為5時，菌落長勢最差，直徑為50.31 mm；試驗所選的pH中，病原菌在pH為8時產孢量最大，為? 1.54×106? mL-1，其余處理之間差異不顯著。

2.4.5 溫度對病原菌生長的影響 試驗證明細極鏈格孢在5～30 ℃的溫度條件下均可以生長，其生長最適溫度為20～30 ℃。在試驗設置的6個溫度梯度中，細極鏈格孢在25 ℃時長勢最好，菌絲致密，菌落形狀規則，菌落直徑為45.20 mm，顯著大于其他處理；試驗設置的溫度梯度中產孢最多的溫度條件為30 ℃，孢子量為6.50×106 mL-1，其余隨溫度降低逐漸減少（圖10）。

3 結論與討論

本試驗通過組織分離法，從蒲公英葉斑病病葉上分離出病原菌，通過柯赫氏法則驗證、病原菌形態特征觀察以及分子生物學鑒定，明確了其病原為細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）。據報道Alternaria tenuissima可侵染蔬菜、水果、花卉等植物葉部，引起病害。如樹莓細極鏈格孢葉斑病[12]、辣椒枯萎病[13]、三葉木通葉斑病[14]、大豆紋枯病[15]、黃芩葉斑病[16]、洋金花葉斑病[17]、番瀉葉枯病[18]等均由細極鏈格孢引起，但目前尚未見針對蒲公英葉斑病分離鑒定的報道。在致病性試驗中，該菌可在不刺傷供試葉片的情況下快速侵染葉片，說明其致病能力較強，侵染速度快。因此，對該病害應以預防為主，在病害初發期應迅速采取防治措施。由于蒲公英在甘肅省也作為主要的果園綠肥植物種植，所以對于該病原菌是否可以侵染果樹及可侵染果樹的種類仍需要進一步探究。

對病原菌生物學特性的深入研究，將有助于更好地理解該病害的發生機制，為其有效控制和預防提供科學依據。在本試驗中，菌絲生長與產孢最佳的培養基為PSA，與袁蒲英等[19]的研究結果相似。本研究表明，病原菌的最適生長溫度為20～30 ℃，pH為7.0～9.0時有利于病菌生長，這與6月份當地溫度及土壤條件相符；本試驗所選碳源中，病原菌利用效果最好的碳源是葡萄糖，產孢量最大的碳源為可溶性淀粉。而尚曉靜等[12]的研究結果顯示，細極鏈格孢的最適生長碳源為淀粉，產孢量最高的碳源為乳糖。其研究結果與本試驗研究結果有一定區別，原因可能是由于寄主與地域環境的差異使細極鏈格孢的適生條件發生了一定變化；供試氮源中有機氮源蛋白胨最適宜病原菌的生長，而銨鹽氮源培養的菌落長勢較差，產孢量也較低，所以在生產中有機氮肥與銨態氮肥的靈活使用有可能降低蒲公英葉斑病發生概率。

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Pathogen? Identification and Biological Characteristics of Dandelion Leaf Spot Disease

ZHANG Ziqiang1，LI Jiping1，2，ZHENG Guo1，2，XU Binbin1，

ZHAI Yanqing1，HUI Nana2，WANG Li2 and MA Yanan1

（1.College of Plant Protection， Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China;

2.Institute of Plant Protection， Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou 730070，China）

Abstract? To identify the pathogens and? investigate the biological characteristics of Taraxacum mongolicum? Hand? leaf spot disease in Weiyuan County， Dingxi City， Gansu Province，the pathogenic bacteria were isolated using tissue separation method. The morphological characteristics of the original bacteria were observed，and the pathogenicity was determined according to Kochs? postulates.The pathogenic bacteria were identified through? ITS，? TEF1 and? rpb2 gene sequence analysis.The results showed that Alternaria tenuissima was the pathogen of dandelion leaf spot， with optimal mycelium growth observed on PSA medium.The glucose was identified as the best carbon source for its growth， and preptone was the optimal organic nitrogen source.The pathogen exhibited optimal growth at a pH of 8 and a temperature of 25 ℃. This study elucidated the pathogenic bacteria?? responsible for dandelion leaf spot and characterized their biological traits，providing a theoretical foundation for the future prevention and management strategies.

Key words Taraxacummongolicum? Hand;Leaf spot;Alternariatenuissima;Biological characteristics

Received? 2023-09-14??? Returned 2024-01-02

Foundation item National Natural Science Foundation of China（No.31560487）.

First author ZHANG Ziqiang，male， master?? student.Research area：plant diseases and integrated prevention.E-mail：1430160731@qq.com

Corresponding?? author LI Jiping，male，research fellow， master supervisor.Research area：plant diseases and integrated prevention. E-mail：gsljp@163.com

ZHENG Guo，male，research fellow， master supervisor.Research area：plant diseases and integrated prevention.E-mail：zhengguo@gsagr.ac.cn

（責任編輯：郭柏壽 Responsible editor：GUO Baishou）