夏枯草體外對呼吸道合胞病毒的抑制作用

黃筱鈞

(湖北民族學院醫學院，湖北　恩施　445000)

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夏枯草體外對呼吸道合胞病毒的抑制作用

黃筱鈞

(湖北民族學院醫學院，湖北恩施445000)

〔摘要〕目的探究夏枯草在細胞水平對呼吸道合胞病毒(RSV)的抑制作用及機制。方法采用細胞培養技術，以利巴韋林為對照，通過觀察細胞病變效應(CPE)，測定細胞半數中毒濃度(TC50)、藥物半數抑制濃度(IC50)和抗病毒指數(TI)，評判夏枯草抗RSV效果。結果夏枯草對RSV有抑制作用，濃度在0.4～51.2 mg/ml呈量效關系，TC50= 3.39 mg/ml、IC50= 0.379 mg/ml、TI=8.94。利巴韋林TC50=0.33 mg/ml、IC50=0.041 mg/ml、TI=8.05。夏枯草對細胞的毒性比利巴韋林小，TI比利巴韋林大，安全范圍大。結論夏枯草在Hep-2細胞中對RSV有明顯的抑制作用，既能抑制RSV的吸附和生物合成，又能直接殺死病毒，抗RSV作用與利巴韋林相當。

〔關鍵詞〕夏枯草；呼吸道合胞病毒；抗病毒作用

呼吸道合胞病毒(RSV)感染是免疫功能低下的成年人特別是老年人呼吸道感染和死亡的重要原因。目前公認利巴韋林(ribavirin)為抗RSV有效藥物，但其具有較強的毒副作用，也出現了耐藥株。夏枯草(Prunella vulgaris)俗稱牛對頭，主要含有三萜類、甾醇類、黃酮類、香豆素、有機酸、揮發油及糖類等成分，具有降壓、降糖、抗菌、抗炎、抗過敏等作用〔1，2〕。現代藥理學研究發現夏枯草也能對流感病毒、單純皰疹病毒、HIV等產生抑制作用。含有夏枯草的多種中藥復方制劑已用于臨床治療呼吸道病毒感染性疾病，但夏枯草單方抗RSV作用的研究尚未見報道。本實驗以人咽喉癌上皮細胞Hep-2為細胞模型，在體外細胞水平對夏枯草抗RSV作用進行研究。

1材料與方法

1.1材料RSV Long株、Hep-2細胞由四川大學華西醫學中心提供。細胞生長液為10%FBS MEM液，細胞維持液為2%FBS MEM液。夏枯草購于恩施藥材公司，為恩施道地藥材。

1.2夏枯草水提液的制備稱取一定量的夏枯草，加10倍體積的蒸餾水過夜，加熱回流提取3次，每次1 h，合并3次提取液，水浴濃縮至1.0 g/ml，4℃冷藏備用。

1.3RSV細胞毒性測定用2%FBS MEM將RSV作10倍系列稀釋，將不同稀釋度的RSV(0.1 ml/孔)接種于已呈單層生長的Hep-2細胞，每一稀釋度設立4個復孔，同時設陰性對照孔，37℃、5%CO2孵育2 h，更換細胞維持液。每天觀察細胞病變效應(CPE)，至CPE不再進展，測定RSV的50%組織細胞感染量(TCID50)。

1.4夏枯草細胞毒性測定將已稀釋成不同濃度的夏枯草分別加入Hep-2單層細胞中，每一稀釋濃度重復4孔，同時設陰性對照孔和陽性對照孔，37℃、5%CO2培養箱內連續培養3 d，觀察Hep-2細胞的形態學變化，記錄CPE，測定570 nm波長下的吸光度(A值)。

1.5夏枯草體外對RSV的抑制作用實驗分3組：①直接殺傷作用組：將不同濃度的夏枯草液與100 TCID50RSV等量混合37℃作用1 h，再將混合液接種于Hep-2細胞。②影響RSV吸附組：0.1 ml 100 TCID50RSV與單層Hep-2細胞37℃、5%CO2吸附2 h，再加入不同濃度的夏枯草液。③影響RSV生物合成組：不同濃度的夏枯草液與單層Hep-2細胞37℃作用2 h，再加入100 TCID50RSV。實驗均在96孔板中進行，加樣處理后37℃、5%CO2孵育，每日觀察記錄CPE，連續5 d。同時設細胞對照孔、病毒對照孔、陽性藥物對照孔，每個藥物濃度設4個重復孔。將病毒對照組CPE達75%以上確定為MTT法測定的最佳時間。

1.6統計學方法采用SAS9.13 統計軟件進行分析，按照Reed-Muench法〔3〕、MTT法〔4〕測定。

2結果

2.1RSV對Hep-2細胞的毒性作用用顯微鏡觀察細胞形態，與正常Hep-2細胞比較，RSV感染后的Hep-2細胞皺縮、變圓，分布不均，細胞壁增厚，胞質內顆粒增多，最終細胞脫落、碎裂(見圖1)。采用Reed-Muench法計算RSV致Hep-2細胞TCID50為10-8/0.1 ml。本實驗病毒攻擊量為100 TCID50。

2.2夏枯草對Hep-2細胞的毒性作用夏枯草對Hep-2細胞的毒性作用表現為細胞粘連，增殖減慢，胞質顆粒增多，形態由梭形變為圓形或橢圓形，折光性增強，吸光度值明顯下降。隨著夏枯草濃度的增加，對Hep-2細胞的毒性增強，死亡細胞數增加，細胞存活率下降(見圖2)。MTT比色法測定其半數中毒濃度(TC50)為3.39 mg/ml，利巴韋林注射液的TC50為0.33 mg/ml。

2.3夏枯草對RSV的直接殺傷作用夏枯草濃度在3.2 mg/ml以上時細胞生長良好，呈梭形，排列整齊，細胞間隔清晰，胞質均一。隨著夏枯草濃度增加，病毒細胞毒性降低，細胞存活率增加(見圖3)。病毒對照組CPE達到“”時，細胞變大，細胞內顆粒物增多、脫落，說明夏枯草對RSV具有直接殺傷作用。

圖1　RSV致Hep-2細胞的CPE(×200)

圖2　夏枯草不同濃度下Hep-2細胞存活率

2.4夏枯草阻斷RSV的吸附作用夏枯草濃度為6.4 mg/ml時Hep-2細胞CPE達到50%，25.6 mg/ml時25%細胞出現CPE，隨著夏枯草濃度增加，細胞存活率增加(見圖3)，說明夏枯草能抑制RSV的吸附作用，能阻斷RSV感染。

2.5夏枯草對RSV生物合成的抑制作用夏枯草實驗組CPE程度均低于病毒對照組，表現為細胞形態改變、融合、壞死、脫落等CPE特征逐漸減弱。隨著夏枯草濃度的增加，Hep-2細胞的存活率升高，并呈量效關系(見表1)。夏枯草抑制RSV的藥物半數抑制濃度(IC50)=0.379 mg/ml，比TC50值小，說明夏枯草使用安全，抗病毒指數(TI)為8.94(3.39/0.379)。利巴韋林注射液IC50=0.041 mg/ml，TI為8.05(0.33/0.041)。夏枯草與利巴韋林抗RSV作用無顯著差異(P>0.05)，安全性相當。

圖3　夏枯草對RSV直接殺傷和吸附抑制作用(n=4)

夏枯草濃度(mg/ml)CPE細胞存活率(%)利巴韋林濃度(mg/ml)CPE細胞存活率(%)0.22.170.0259.120.48.970.0519.780.820.890.129.541.637.610.239.123.247.870.453.466.459.910.864.8612.8+71.351.6+80.1225.6±90.983.2-96.34

-：無細胞病變；±：10%以下細胞病變；+：25%以上細胞病變；：25%～50%細胞病變；：50%～75%細胞病變；：75%以上的細胞病變

3討論

RSV是單負鏈RNA病毒，屬于副黏病毒科肺炎病毒屬，主要通過飛沫傳播，也可經接觸污染的手或物品傳播，傳染性強，是引起嬰幼兒和兒童下呼吸道感染最主要病原體，在1歲以下嬰兒的細支氣管炎和肺炎中，RSV位居所有病原體之首，嚴重威脅著嬰幼兒的健康。目前尚無特效抗RSV的藥物，疫苗研究也無突破性進展。研究發現多種中藥單方和復方對RSV有良好的抑制作用〔5〕。Tabba等〔6〕從夏枯草中提取了一種三萜類物質——夏枯草皂苷，發現其具有初步的抗HIV活性。孟勝男等〔7〕研究證實夏枯草提取物無論體內還是體外對單純皰疹病毒性角膜炎均有顯著療效。

本實驗通過體外細胞培養技術觀察了夏枯草的抗RSV效果，結果證實夏枯草在細胞水平有抑制RSV感染作用。體外毒性測定發現，夏枯草對細胞的毒性較低，使用安全范圍廣。夏枯草不僅能直接殺傷RSV，在RSV吸附細胞階段和細胞內生物合成階段都有較強的抑制作用。同劑量的夏枯草直接殺傷作用>抑制生物合成作用>抑制吸附作用。夏枯草在抑制RSV細胞內增殖方面與利巴韋林相當。李濤等〔8〕提出RSV感染與TLR3、TLR4關系密切，中藥能負性調節TLRS信號轉導通路，起到抗RSV作用。夏枯草也具有抗感染、抗過敏和免疫調節作用，是否有利于其體內抗病毒作用的發揮，有待于動物實驗證實。

4參考文獻

1竇景云，于俊生.夏枯草藥理作用及臨床應用研究進展〔J〕.現代醫藥衛生，2013;29(7)：1039-41.

2夏伯候，劉菊妍，李春，等.夏枯草水提液及水提醇沉上清液降血壓藥效評價〔J〕.中國實驗方劑學雜志，2014;20(2)：113-6.

3傅繼華.病毒學實用實驗技術〔M〕.濟南：山東科學技術出版社，2001:17-31.

4劉釗，楊占秋，肖紅，等.MTT法在抗病毒藥物篩選中的應用〔J〕.武漢大學學報(醫學版)，2004;25(3)：332-4.

5孫經夢，劉駿，李炯，等.桑葉提取物對小鼠感染甲型流感病毒FM1的預防與治療作用研究〔J〕.中藥材,2013;36(11)：1837-42.

6Tabba HD，Chang RS，Smiths KM.Isolation，purification and partial characterization of prunellin，an anti-HIV compound from aqueous extracts of Prunella vulgaris〔J〕.Antiviral Res，1989;11(56)：263-73.

7孟勝男，王欣，邢俊家，等.夏枯草提取物對HSV-Ⅰ及單純皰疹病毒性角膜炎的作用〔J〕.沈陽藥科大學學報，2010;27(3)：36-9.

8李濤，戴啟剛，汪受傳.呼吸道合胞病毒與TLR3、TLR4的關系及其中醫藥研究進展〔J〕.中華中醫藥雜志，2014;29(1)：211-3.

〔2015-10-11修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：國家自然科學基金資助(81360654)；湖北民族學院教學研究項目資助(2012JY028)；高等學校博士學科點專項科研基金(20120141110075)

〔中圖分類號〕R373.1；R285.5

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)12-2840-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.12.005

第一作者：黃筱鈞(1979-)，男，講師，在讀博士，主要從事分子病毒學和抗病毒中藥研究。