松樹赤枯病玫瑰擬盤多毛孢菌的鑒定及生物學特性研究

生長pH值為6.0，最適光照條件為24 h光照。該研究結果可為松樹赤枯病的防治提供理論依據(jù)。

關鍵詞：松樹赤枯病；分離純化；病原鑒定；生物學特性

中圖分類號：S763.1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0113-07

松樹為高大喬木，四季常青，能夠起到良好的防風、固沙、吸塵的作用，是優(yōu)質(zhì)用材樹以及荒山綠化先鋒樹種。隨著松樹栽植面積的增加以及在人們生產(chǎn)、生活中應用范圍的逐步擴大，其觀賞價值、經(jīng)濟價值、工業(yè)價值日益突出。因受自然條件、栽培條件、病蟲害等不良因素的影響，松樹連片枯萎現(xiàn)象嚴重，在國內(nèi)涉及10余個樹種，影響松樹的正常生長。其中，松材線蟲對我國松林造成危害及威脅重大。松材線蟲病俗稱“松樹癌癥”，在松樹枯萎癥狀研究中常作為主要研究方向。目前，對其相關病原菌的研究較少，當非松材線蟲病引起松樹枯萎現(xiàn)象發(fā)生時，若不能及時對癥下藥進行病害防治，會明顯加大損失。

本試驗對采自山東威海市雙島林場的松樹枯萎病害樣本進行病原菌分離，并對病原菌進行培養(yǎng)、純化、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析及生物學特性測定，以便為松樹赤枯病的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

干枯的松樹枝干、枝條及松針，采自山東省威海市雙島林場，松樹品種為黑松。

1.2病原菌分離及單孢培養(yǎng)

采用組織分離法。將采集的感病松針與枝干用流水沖洗、晾干，并將枝干剪成5cm左右小段；置于超凈工作臺上，用3%的NaClO溶液浸泡消毒60 s，無菌水漂洗3次，每次3～4 min，用無菌濾紙吸干水分，隨后將其剪成長約5 mm的小段并接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4～5 d。每培養(yǎng)皿中放入3個小段組織，每組織部位平行測定3次，采用稀釋法進行單孢純化。挑取單個菌落轉移至新的PDA平板上，28℃培養(yǎng)5d。培養(yǎng)結束后移至斜面試管中，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3菌株致病性測定

選取山東省濟南市燕山林場黑松的健康松針，用流水清洗，晾干后置于超凈工作臺，用滅菌后的手術刀劃傷針葉制造微傷口。將單孢純化培養(yǎng)好的菌株用直徑5 mm的打孔器打出菌餅，接種在健康松針傷口處，以空白PDA為對照，重復6次，在28℃、12 h黑白交替的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；保濕48 h后撤掉菌餅和PDA圓餅，7d后觀察發(fā)病情況。

1.4菌株形態(tài)學鑒定

1.4.1菌落形態(tài)觀察 將純化后的菌株接種在PDA平板上培養(yǎng)5d后，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長速率，記錄菌落正面和背面顏色、菌落邊緣形狀、均勻度、菌落質(zhì)地、氣生菌絲的有無及多少。

1.4.2菌株分生孢子及產(chǎn)孢特征顯微觀察 將純化后的菌株接種到PDA平板上，置于SPX智能型人工氣候箱內(nèi)25℃黑暗培養(yǎng)，待長出子實體后，用挑針挑取少許，制作臨時玻片。利用Nikon 50i顯微鏡（Nikon Eclipse 50i，日本）觀察分生孢子和分生孢子盤的形態(tài)并測量其大小，利用Qim-aging相機（加拿大）拍照，利用cellSens軟件測量分生孢子和附著胞的大小。

1.5菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

用CTAB法提取純化培養(yǎng)菌體的DNA，加入20μL TE Buffer溶解，終濃度約為900 ng/μL。利用PCR技術擴增保守基因序列，引物序列見表1。委托上海派森諾生物科技有限公司對PCR產(chǎn)物進行雙向測定。將ITS、TUB2、TEF1序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進行比對。運行MEGA 7.0軟件中的Align建立DNA sequence alignment，使用Clust-al W對基因序列比對、校對。利用Fasta align-ment joiner軟件通過首尾相連的方法，將ITS、TUB2、TEF1等基因連接起來。利用PhyloSu-ite（1.2.2）及FigTree（1.4.3）軟件，構建最大似然法和貝葉斯法系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6菌株生物學特性測定

1.6.1不同培養(yǎng)基對病原菌菌絲生長的影響 在無菌條件下，利用打孔器打出直徑為7 mm的菌餅，分別接種到PDA、PSA、PMA、OA、CMA、Martin 6種培養(yǎng)基平板中央，重復3次，25℃恒溫培養(yǎng)箱中分別黑暗培養(yǎng)3、5、7d，每天16：00采用十字交叉法測量并記錄菌落直徑。待有1個處理的3次重復中菌絲全部長滿平板，停止觀察，計算菌絲生長速率。菌絲生長速率（mm/d）=（菌落直徑一菌餅直徑）／天數(shù)。

1.6.2不同溫度對病原菌菌絲生長的影響 以PDA培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，在無菌條件下將直徑為7 mm的菌餅接種到PDA平板，在10、15、20、25、30、35℃6個溫度條件下恒溫、黑暗培養(yǎng)3、5、7d，每處理重復3次。測量記錄方法同1.6.1。

1.6.3不同pH值對病原菌菌絲生長的影響 以PDA為基礎培養(yǎng)基，用1 mol/L HCl溶液和1mol/L NaOH溶液分別將培養(yǎng)基pH值調(diào)制為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，共7個處理。無菌條件下取直徑7 mm的菌餅分別接種至不同pH值的PDA平板培養(yǎng)基，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3、5、7d，每處理重復3次。測量記錄方法同1.6.1。

1.6.4不同光照對病原菌菌絲生長的影響 無菌條件下，取直徑7mm的單孢菌餅接種至PDA培養(yǎng)基，在其他培養(yǎng)條件一致的情況下，設置光照24 h、黑白交替12 h、黑夜24h 3個光照處理，28℃恒溫培養(yǎng)3、5、7d，每處理重復3次。測量記錄方法同1.6.1。

1.7數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，差異顯著性分析采用Duncan's法多重比較。

2結果與分析

2.1菌株病原菌致病性測定

獲得的純化單孢菌株編號為RCBHL，將其對健康黑松松針進行室內(nèi)離體接種，7d后出現(xiàn)癥狀。經(jīng)致病性測定，純化單孢菌株RCBHL可侵染黑松，發(fā)病率為100%。發(fā)病初期，松針出現(xiàn)黃褐色病斑，病斑中心發(fā)白，邊緣暗褐色，有輪紋層次感（圖1A、B）；后期，松針呈現(xiàn)干枯狀態(tài)，產(chǎn)生灰色霉層并附著大量的黑色小點（圖1C）。這與山東威海市雙島林場黑松植株發(fā)病癥狀一致（圖1D）。將接種后發(fā)病的松針再次進行病原分離，分離物與接種菌株一致。

2.2菌株形態(tài)特征

將純化的RCBHL菌株接種至PDA培養(yǎng)基，25℃黑暗培養(yǎng)5d后觀察形態(tài)發(fā)現(xiàn)：菌落近圓形，正面白色、背面淡黃色，輪紋較明顯；培養(yǎng)15 d后，菌落表面形成黑色黏液，即為分生孢子堆，排列不規(guī)則（圖2）。

如圖3所示，分生孢子散生，黑褐色，紡錘形或長棱形，數(shù)量較多。分生孢子平均大小為20.30×7.57μm（n=50），共有5個細胞、4個隔膜，分隔處不明顯，頂端與基部細胞顏色較淡、多數(shù)透明，中間的3個細胞顏色較深、大多黃褐色。孢子頂端有2～3根不分支的無色透明附著絲，平均長度分別為14.66、14.01、15.38μm（n=50）。基部細胞具有小柄，平均長度為2.92μm（n=50）。分生孢子梗平均長度為2.97μm。根據(jù)以上形態(tài)學特征，將菌株RCBHL鑒定為擬盤多毛孢屬真菌（Pestalotiopsis sp.）。

2.3菌株多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

以ITS、TUB2、TEF1三種基因序列為參比序列，以P.hawaiiensis（菌株編號為CBS 114491）作為外圍菌株，將獲得的RCBHL菌株與20株參考菌株的序列構建多基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結果（圖4）顯示，菌株RCBHL與P.rosea聚在同一分支上（BP=84，PP=0.99）。根據(jù)形態(tài)學與系統(tǒng)發(fā)育分析結果，RCBHL鑒定為玫瑰擬盤多毛孢菌（Pesta-lotiopsis rosea）。

2.4菌株生物學特性

2.4.1培養(yǎng)基對菌絲生長的影響 由表2可知，RCBHL菌株在不同培養(yǎng)基上菌絲生長速率不同，但無極顯著差異。它在PDA培養(yǎng)基上生長最好，菌絲生長速率為8.267 mm/d;Martin培養(yǎng)基最不適宜RCBHL菌株生長，菌絲生長速率僅為5.989mm/d，顯著低于PDA培養(yǎng)基。

2.4.2溫度對菌絲生長的影響 由表3可以看出，溫度對RCBHL菌絲生長速率有極顯著差異，溫度在20、25℃時菌絲生長速率最快，分別可達6.633、7.656mm/d；溫度為15℃和30℃時，菌株生長速率極顯著降低：溫度低于15℃或高于30℃時，菌株生長緩慢或停止生長。

2.4.3 pH值對菌絲生長的影響 由表4可知，RCBHL菌絲適宜生長pH值范圍較廣，在pH值5.0～10.0范圍內(nèi)均能生長。在pH值6.0條件下菌絲生長速率最快，可達10.778 mm/d，顯著或極顯著高于其他pH值處理；在pH值4.0條件下，菌絲生長受到抑制，生長速率僅為0.878 mm/d;pH值在8.0～10.0之間時，菌絲生長速率為8.967～9.533mm/d，相互之間差異不顯著。

2.4.4光照對菌絲生長的影響 由表5可知，RCBHL菌絲在24 h光照條件下生長速率最高，與24h黑暗下無顯著差異，顯著高于12h光照黑暗交替的表現(xiàn)。

3討論與結論

松樹枯萎病是當今全球性的病害，導致很多國家的松樹出現(xiàn)大面積枯萎死亡，森林覆蓋面積減少，土地荒漠化問題突出，給人類生存環(huán)境帶來極大威脅。引起松樹枯萎病的因子既有生物因子也有環(huán)境因子。環(huán)境因子主要包括土壤因素、大氣污染、極端天氣，生物因子有病原線蟲、病原菌、害蟲等，最主要的是松材線蟲。松材線蟲病可以引起松林大面積死亡，是松樹疫情，為目前松樹枯萎病的重點考慮因素。除此之外，鐮刀菌屬真菌中有多個種均可侵染松樹造成松樹死亡。

擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis spp.）是常見的真菌類群，常以病原菌、內(nèi)生菌或腐生菌的形式存在，為人類發(fā)現(xiàn)的重要植物病原菌之一，可侵染多種植物造成多種類型的病害，嚴重影響作物或林木的品質(zhì)和產(chǎn)量，造成重大的經(jīng)濟損失。本試驗從山東省威海市雙島林場采集感病松樹，分離培養(yǎng)得到單孢菌株RCBHL.通過對菌株的ITS、TUB2、TEF1多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，結合培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征，以及致病性測定，確定分離獲得的菌株為玫瑰擬盤多毛孢菌（P.rosea）。

由枯斑擬盤多毛孢（P.funerea）引起的赤枯病是松樹常見的病害，尤其是在幼齡林中常見，分布廣，危害重，在特定區(qū)域成為針葉林木主要病害。最近的研究表明，檸檬擬盤多毛孢（P.cit-rina）侵染樟子松，江蘇擬盤多毛孢（P.jiang-suensis）侵染馬尾松，引起赤枯病。本研究發(fā)現(xiàn)，玫瑰擬盤多毛孢菌（P.rosea）可以侵染黑松引起赤枯病。明確致病因子是控制病害的重要前提，溫度、光照和pH值是影響菌株生長的重要環(huán)境因子。本研究測定了溫度、光照以及pH值對玫瑰擬盤多毛孢菌RCBHL菌絲生長速率的影響，表明菌絲生長的最適溫度為20～25℃，低于15℃或高于30℃菌絲生長緩慢或停止生長；對酸堿度具有廣泛的適應性，在pH值為6.0條件下生長速率最高，在pH值5.0～10.0范圍內(nèi)均可生長：在所有光照條件下均可生長，24 h光照條件下生長速率最高，與24 h黑暗下無顯著差異，顯著高于12 h光照黑暗交替的表現(xiàn)。

病害在林間的擴展蔓延與致病菌自身的生物學特性緊密相關，摸清其生物學特性，對病害的預測預報及有效防控具有重要意義。本研究結果為威海市松樹異常枯萎病因診斷分析及針對性防控提供了重要的基礎數(shù)據(jù)，下一步，將通過室內(nèi)和田間試驗，篩選出對玫瑰擬盤多毛孢菌有良好防治效果的藥劑，為黑松赤枯病的防治提供參考。