雞傳染性喉氣管炎病毒SYBR Green Ⅰ實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

關鍵詞：雞喉氣管炎病毒；TK基因；實時熒光定量PCR；特異性；敏感性；重復性

中圖分類號：S858.31 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）06-0128-05

雞傳染性喉氣管炎是由喉氣管炎病毒（Infec-tious laryngotracheitis virus，ILTV）引起的一種急性、接觸性呼吸道傳染病，主要侵染雞的喉頭和氣管上皮細胞，同時也對雞鼻竇、氣囊和肺組織產生影響，被世界衛生組織（OIE）列為必須通報的疾病。ILTV首次于20世紀30年代報道自美國，屬于皰疹病毒科α-皰疹病毒亞科，病毒粒子為直徑85～105nm的正20面體立體對稱結構，有囊膜，是危害雞集約化養殖的主要病毒性呼吸道傳染病致病菌之一。近年來，在山東、江蘇、河北等部分地區，雞傳染性喉氣管炎的發病率不僅在蛋雞中增高，在蛋種雞和商品肉雞中也呈增加趨勢。

ILTV只有一個血清型，臨床病變有嚴重和輕微兩種形式，嚴重者表現出呼吸困難、氣喘、咳出帶血分泌物等主要癥狀，發病率和致死率高達70%。該病易與其他呼吸道疾病，如新城疫、傳染性支氣管炎等混淆，因此建立一種快速有效的診斷方法對ILTV的監測具有重要意義。

ILTV的基因組有79個開放閱讀框，編碼多種結構蛋白和致病性蛋白，其中，TK基因編碼胸腺嘧啶激酶，在核酸代謝中起主要作用，是病毒的主要毒力基因，也是構建基因缺失疫苗的主要靶標。本研究對ILTV的TK基因保守區域進行分析，利用Primer 5軟件設計了1對熒光定量PCR引物，建立了ILTV的實時熒光定量PCR檢測方法，為ILTV的監測與診斷提供技術支持。

1材料與方法

1.1病毒與臨床病料

ILTV、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、禽流感H5（AIV-H5）、H9亞型滅活毒株（AIV-H9）、新城疫病毒（NDV）均由山東省禽病診斷與免疫重點實驗室鑒定并保存。臨床樣本為2022年1月一2023年1月該實驗室接收的病料組織，-80℃保存。

1.2主要試劑

SimplyP病毒DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、18-T載體連接試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司；SYBR Green Premix Taq^TM

1.3引物的設計與合成

根據GenBank已公布的ILTV的TK基因保守序列，利用軟件Primer 5.0分別設計1對普通PCR引物和1對熒光定量PCR引物（表1），均由北京華大基因科技有限公司合成，離心后用ddH₂O稀釋至10μmol/L，-20℃保存。

1.4病毒核酸提取

將儲存于-80℃的感染ILTV的雞尿囊液按照SimplyP病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書提取病毒DNA，于-80℃保存。

1.5質粒標準品的準備

以ILTV DNA為模板，利用引物TK-P1/P2對TK基因進行PCR擴增。擴增體系為：Taq Mix12.5μL，上、下游引物各1.0μL，模板DNA 2.0μL，加ddH₂O補足至25μL。反應條件為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸30 s，35個循環；72℃延伸7 min;4℃保存。擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用膠回收試劑盒純化回收330 bp處陽性目的片段：使用18-T載體連接試劑盒將純化回收片段與18-T載體16℃連接30 min后，按說明書轉化至DH5α感受態細胞：在氨芐陽性的LB營養瓊脂平板上涂抹培養并篩選陽性克隆，挑取合格單菌落接入含氨芐的液體LB培養基中過夜擴大培養。用質粒提取試劑盒提取重組質粒后基因測序。