SGK3 在小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3（SGK3） 在小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用，初步闡明SGK3在哺乳動物卵母細(xì)胞早期發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制。方法：利用超排卵技術(shù)獲取生發(fā)泡（GV） 期小鼠卵母細(xì)胞，利用顯微注射技術(shù)將表達(dá)質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)錄獲得的SGK3 mRNA注射至 GV 期卵母細(xì)胞， 分為對照組、Tris-EDTA 緩沖液（TE） 組和 SGK3 mRNA 組， 采用Western blotting 法檢測各組小鼠卵母細(xì)胞中SGK3 蛋白表達(dá)水平， 顯微注射SGK3 mRNA 后1、2、3 和4 h 觀察并計算各組卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂（GVBD） 率，采用SGK3 抗體稀釋抑制實驗觀察各組卵母細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)，采用Western blotting 法檢測體外培養(yǎng)不同時間點卵母細(xì)胞中磷酸化SGK3 （pSer48）（SGK3-pSer48） 和磷酸化細(xì)胞分裂周期蛋白2 （CDC2）（pTyr15）（CDC2-pTyr15） 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與對照組和TE組比較，SGK3 mRNA組小鼠卵母細(xì)胞中SGK3蛋白表達(dá)水平升高 （Plt;0. 01），顯微注射后1 和2 h 時GVBD 率升高（Plt;0. 01）。SGK3 抗體稀釋抑制實驗，隨著SGK3 抗體濃度增加，各組小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率呈濃度依賴性降低。過表達(dá)SGK3 后，與對照組比較，SGK3 mRNA組小鼠卵母細(xì)胞中檢測不到CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)的時間至少提前1 h。不同稀釋濃度SGK3 抗體作用后，與對照組比較，隨著SGK3 抗體濃度升高和時間的延長，小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)水平逐漸降低 （Plt;0. 01），SGK3-pSer486 蛋白表達(dá)水平逐漸升高 （Plt;0. 01）。結(jié)論：過表達(dá)SGK3 可以增加小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率，加快CDC2-pTyr15 的脫磷酸化，而CDC2-pTyr15 的脫磷酸化晚于SGK3-Ser486 的磷酸化。SGK3 可能作為CDC2 上游調(diào)節(jié)因子參與調(diào)控小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的恢復(fù)。

［關(guān)鍵詞］ 血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3； 小鼠卵母細(xì)胞； 減數(shù)分裂； 細(xì)胞分裂周期蛋白2； 生發(fā)泡；生發(fā)泡破裂

［中圖分類號］ Q132 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂是哺乳動物生殖過程中至關(guān)重要的步驟，直接關(guān)系到正常的生殖能力和后代的遺傳穩(wěn)定性［1］。減數(shù)分裂的第一次分裂是其中的關(guān)鍵階段， 也是容易受到干擾和損傷的階段之一［2］。第一次減數(shù)分裂的恢復(fù)過程受到多種分子和蛋白的嚴(yán)密調(diào)控［3］。血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3 （serum and glucocorticoid-induced proteinkinase 3，SGK3） 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在真核生物體內(nèi)參與基因快速轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。作為磷脂酰肌醇3- 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K） /磷酸肌醇依賴性激酶1 （phosphoinositidedependentkinase 1，PDK1） /哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2 （mammalian target of rapamycincomplex 2，mTORC2） 信號通路的下游調(diào)節(jié)因子，SGK3 被PDK1 和mTORC2 分別在Thr320 和Ser486 位點磷酸化，激活其功能。細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1） 和細(xì)胞分裂周期蛋白2 （cell divisioncyclin protein 2，CDC2） 是調(diào)節(jié)減數(shù)分裂恢復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞因子。cyclin B1 和CDC2 共同組成成熟促進(jìn)因子（maturation promoting factor，MPF），MPF 的合成、激活和降解是劃分細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的關(guān)鍵［4-5］。當(dāng)CDC2 單獨存在時，不表現(xiàn)出激酶活性，只有當(dāng)CDC2 與其調(diào)節(jié)亞基細(xì)胞周期蛋白（cyclin）結(jié)合后，CDC2 的Tyr15 位點發(fā)生去磷酸化，才具有激酶活性［6-7］。該去磷酸化過程對于卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂的恢復(fù)至關(guān)重要。研究［8-10］ 表明：在海星卵母細(xì)胞中，SGK3 能直接激活細(xì)胞分裂周期蛋白25B （cell division cyclin protein 25B，CDC25B），導(dǎo)致CDC2 的Thr14 和Tyr15 位點脫磷酸化，從而激活細(xì)胞周期蛋白B （cyclin B）-CDC2 復(fù)合物，促進(jìn)細(xì)胞G2/M 期轉(zhuǎn)換和減數(shù)分裂的恢復(fù)。在哺乳動物卵母細(xì)胞中， SGK3 是否通過直接或間接激活CDC2 來促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育尚不明確，關(guān)于SGK3 在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用尚未見相關(guān)報道。本研究旨在探討SGK3 在小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用及其機(jī)制，并進(jìn)一步探索SGK3 與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵因子CDC2 之間的相互作用，為進(jìn)一步研究卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的分子機(jī)制和相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 實驗動物、主要試劑和儀器

昆明系 SPF 級3～4 周齡雌性小鼠6 只，體質(zhì)量15～20 g，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物使用許可證號：SYXK （蒙） 2020-0003。孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotrophin， PMSG）（香港岑氏實業(yè)集團(tuán)）， MB 培養(yǎng)液和二丁酰環(huán)腺苷酸（dibutyryl-cAMP， dbcAMP）（美國Sigma 公司），胚胎培養(yǎng)用礦物油M2460 （南京愛貝生物科技有限公司），SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒和預(yù)染蛋白Marker （北京索萊寶科技有限公司）， RIPA 蛋白解液、 苯甲基磺酰氟 （phenylmethanesulfonylfluoride，PMSF）、 磷酸酶抑制劑、 牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA） 和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline， PBS） Tween20 （上海碧云天生物技術(shù)公司），Tris-EDTA 緩沖液（Tris-EDTA buffer， TE）， 十二烷基硫酸鈉 （sodiumdodecyl sulfate，SDS）、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 蛋白上樣緩沖液（5×）（Bio-Channel）、Tris-base 和甘氨酸（Glycine）（福州飛凈生物科技有限公司），0. 45 μm NC 膜（愛西默科技中國有限公司），SGK3 抗體和CDC2 抗體（美國Proteintech公司）， 磷 酸 化 SGK3 （phosphorylated SGK3，p-SGK3） （pSer486） 抗體和磷酸化CDC2（phosphorylated CDC2，p-CDC2）（pTyr15） 抗體（美國Affinity 公司），β-actin 抗體（圣克魯斯生物技術(shù)上海有限公司），HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體（上海艾博生物科技有限公司）， ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Piece Biotechnology公司）。35和60 mm 胚胎培養(yǎng)皿（南京愛貝生物科技有限公司），體式顯微鏡（日本Nikon 公司），相差顯微鏡（日本Olympus 公司），CO2恒溫培養(yǎng)箱（德國BINDER 公司），超低溫冰箱（青島海爾公司），低溫離心機(jī)和紫外分光光度計（德國Thermo Scientifi 公司），垂直電泳槽和凝膠自動成像儀（美國 Bio-Rad 公司），往復(fù)式脫色搖床（美國 ENVIRO-GENIE 公司），基因擴(kuò)增儀（中國HEMA 公司），電泳儀（中國北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1. 2 小鼠卵母細(xì)胞的采集和培養(yǎng)

取3～4周齡昆明系SPF 級雌性小鼠，腹腔注射PMSG 10 IU，48 h后采用頸椎脫臼法處死小鼠，剖出兩側(cè)卵巢放入生理鹽水液中，在體式顯微鏡下，使用1 mm 注射器刺破并擠壓卵巢中的透明卵泡，使卵母細(xì)胞流出，挑出卵母-卵丘細(xì)胞團(tuán)，去除卵母細(xì)胞周圍附著的卵丘細(xì)胞。挑出胞體呈圓球形、直徑約80～90 μm的卵母細(xì)胞，將生發(fā)泡（germinal vesicle，GV） 期裸卵放入提前加入MB 培養(yǎng)基和礦物油的培養(yǎng)皿中， 置于恒溫和恒濕 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 用于后續(xù)實驗。

1. 3 SGK3 基 因 的 體 外 轉(zhuǎn) 錄

制 備 線 性 SGK3DNA， 配制50 μL 反應(yīng)體系： 10×QuickCutBuffer5 μL， 質(zhì)粒 1 μg， QuickCutApaⅠ 1 μL， ddH2O39 μL。37 ℃ 酶切30 min。室溫靜置5 min。加蛋白酶 K （20 g·L-1） 0. 5 μL，10%SDS 2. 5 μL，加等體積酚/氯仿抽提， 12 000 r·min?1 離心2 min，將上層相轉(zhuǎn)移至EP 管中；加1/10 體積的3 mol·L-1醋酸鈉（pH 5. 2） 和3 倍體積的無水乙醇沉淀，?20℃、15 min；12 000 r·min?1 離心10 min，棄上清后，4 ℃、12 000 r·min?1 離心15 min，用作體外轉(zhuǎn)錄的模板。將線性化的DNA 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，配制 20 μL 轉(zhuǎn)錄體系： 線性化 SGK3 DNA 6 μL，T7 Enzyme Mix 2 μL，T7 Reaction Buffer（ 5×） 4 μL，rNTP 6 μL， RNase Free H2O 2 μL。置于PCR 儀上，設(shè)置孵育程序為37 ℃、3 h。向混合液中加入1 μLDNase Ⅰ，去除DNA 模板，加Poly （A）。反應(yīng)體系100 μL： 上述反應(yīng)混合物20 μL，無核酸酶水30 μL，5×E-PAP緩沖液20 μL，25 mmol·L?1 MnCl2 10 μL，ATP 溶液10 μL， E-PAP 酶4 μL。RNA 產(chǎn)物純化體系100 μL： SGK3 mRNA 21 μL， RNase FreeH2O 67 μL， Purification Assistant A 10 μL，Purification Assistant B 2 μL。將反應(yīng)液輕輕混合均勻，加入預(yù)冷無水乙醇300 μL，混勻后置于－20℃冰箱過夜沉淀； 4 ℃ 、13 000 r·min-1 離心30 min，棄上清，加入 1 mL 預(yù)冷 70% 乙醇，反復(fù)顛倒混勻，4 ℃、13 000 r·min-1離心10 min，棄上清，重復(fù)上一步驟晾干RNA 沉淀至透明。使用Nanodrop 微量分光光度計通過吸光度（A） 值對RNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測，A （260） /A （280） 為1. 8～2. 0 即純化RNA，可用于后續(xù)實驗。

1. 4 顯微注射SGK3 mRNA后計算小鼠卵母細(xì)胞生發(fā)泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）率和 Western blotting 法檢測卵母細(xì)胞中 SGK3蛋白表達(dá)水平

采用 Eppendorf Transferman 顯微操作系統(tǒng)進(jìn)行顯微注射。實驗分為對照組、TE 組和SGK3 mRNA 組， 取 GV 期卵母細(xì)胞放入含200 μmol·L-1 dbcAMP 的MB 培養(yǎng)液中， 按分組方法通過顯微注射將TE 和SGK3 mRNA 分別注入GV 期卵母細(xì)胞質(zhì)， 注射劑量為 5 pL （濃度約為20 μmol·L-1），注射后放在不含抑制劑（dbcAMP）的MB 培養(yǎng)液中培養(yǎng)， 計算卵母細(xì)胞GVBD 率，GVBD 率= 卵裂的卵母細(xì)胞數(shù)/卵母細(xì)胞總數(shù)×100% （n=100）。采用Western blotting 法驗證SGK3 mRNA 過表達(dá)是否成功： 配制裂解液， 取100 μL RIPA 裂解液加入1 μL 蛋白酶裂解液、1 μL磷酸酶裂解液和1 μL PMSF， 顛倒混勻。提取總蛋白，將對照組、TE 組和SGK3 mRNA 組卵母細(xì)胞放于MB 培養(yǎng)液中培養(yǎng) 1 h 后， 將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移全1. 5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r·min-1 離心10 min，棄上清液，加入配制好的裂解液，離心10 min。將蛋白提取液和SDS 上樣緩沖液按2∶1 混合，100 ℃煮沸5 min。與Marker 分別加入SDS-PAGE 孔內(nèi)點樣， 每孔30 μL， 進(jìn)行電泳。在80 V、30 min 和120 V、 60 min 條件下電泳， 結(jié)束后將凝膠取出，4 ℃、90 V、200 mA 恒流濕轉(zhuǎn)2 h，將條帶轉(zhuǎn)移至NC膜，用封閉液室溫封閉NC膜1 h，加入1∶1 000稀釋的抗SGK3和抗β-actin抗體，4 ℃孵育過夜。第2天將NC 膜移入1∶1 000 稀釋的HRP-山羊抗兔IgG 抗體中，室溫孵育2 h。采用TBST 溶液對含有目的條帶的NC 膜進(jìn)行脫色，重復(fù)3 次，每次20 min，按說明書加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，采用Bio-Rad 顯微成像系統(tǒng)， 以 β-actin 作為內(nèi)參蛋白進(jìn)行顯影分析，計算SGK3 蛋白表達(dá)水平。SGK3 蛋白表達(dá)水平=SGK3 蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1. 5 抗體稀釋抑制實驗觀察各組小鼠卵細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

取 4 μL SGK3抗體加入裝有 96 μL LMB 培養(yǎng)液的EP 管中混勻，依次配制成濃度分別為1∶25、1∶50、1∶100 和1∶200 的SGK3 抗體稀釋液，用移液器按照抗體稀釋液濃度由低到高的順序取稀釋液33 μL 加入至35 mm 胚胎專用培養(yǎng)皿，同時設(shè)不加SGK3 抗體的對照組。將取出的GV 期卵母細(xì)胞放入提前預(yù)熱后的培養(yǎng)液中，采用相差顯微鏡在培養(yǎng)1、2、3 和4 h 時觀察卵母細(xì)胞GVBD 情況、卵母細(xì)胞存活情況和各組卵母細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)。

1. 6 Western blotting法檢測不同時間點小鼠卵母細(xì)胞中 SGK3-pSer486 和 CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)水平

將分別培養(yǎng) 1、2、3和 4 h的卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1. 5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄上清，加入100 μL RIPA 裂解液、1 μL 蛋白酶裂解液、1 μL磷酸酶裂解液和1 μL PMSF，離心10 min。上樣、電泳， 4 ℃ 、90 V、200 mA 恒流濕轉(zhuǎn)2 h，將條帶轉(zhuǎn)移至NC 膜， 封閉液室溫封閉1 h； 將封閉處理的NC 膜加入1∶ 1 000 稀釋的SGK3-pSer486 抗體和1∶ 500 稀釋的CDC2-pTyr15 抗體中， 4 ℃孵育過夜。次日將NC 膜移入1∶ 1 000 稀釋 HRP 標(biāo)記IgG 中，室溫孵育2 h，用TBST 溶液對含有目的條帶的NC 膜進(jìn)行脫色，重復(fù)3 次，每次20 min。按說明書加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑， 利用Bio-Rad 顯微成像系統(tǒng)，以β-actin 為內(nèi)參，分析各蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 GraphPad Prism 9. 0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。每組實驗重復(fù)3～4 次。小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率以百分率表示， 組間比較采用χ2 檢驗。卵母細(xì)胞中SGK3、SGK3-pSer486 和CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 各組小鼠卵母細(xì)胞中 SGK3 蛋白表達(dá)水平

與對照組（0. 692±0. 003） 和TE 組（0. 757±0. 010） 比較， SGK3 mRNA 組小鼠卵母細(xì)胞中SGK3 蛋白表達(dá)水平（1. 195±0. 010） 明顯升高（Plt;0. 01）；與對照組比較， TE 組小鼠卵母細(xì)胞中SGK3 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0. 05）。見圖1。

2. 2 各組小鼠卵母細(xì)胞不同時間點GVBD率

顯微注射SGK3 mRNA 后檢測GV 期小鼠卵母細(xì)胞不同時間點GVBD 率， 結(jié)果顯示： 顯微注射后1、2、3 和4 h 各組小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率依次升高。顯微注射后1 和2 h， 與對照組和TE 組比較，SGK3 mRNA 組小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率升高（Plt;0. 01）。見表1。

2. 3 不同時間點各組小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

SGK3-mRNA 注射2 h 后，相差顯微鏡下觀察，對照組和TE 組仍有部分小鼠卵母細(xì)胞未發(fā)生GVBD，但SGK3 mRNA 組在注射2 h 后小鼠卵母細(xì)胞已全部發(fā)生GVBD。見圖2。

2. 4 不同時間點各組小鼠卵母細(xì)胞GVBD率

采SGK3 抗體抑制GV 期卵母細(xì)胞中SGK3 的表達(dá)，檢測經(jīng)不同濃度（1∶200、1∶100、1∶50 和1∶25）SGK3 抗體稀釋液處理后各組卵母細(xì)胞GVBD 率，結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)1、2、3 和4 h 時，隨著SGK3抗體濃度增加GVBD 率呈濃度依賴性降低，與對照組比較，1∶100 SGK3抗體作用2、3和4 h，1∶50 及1∶25 SGK3 抗體作用1、2、3 和4 h 時GVBD 率均降低（Plt;0. 05或Plt;0. 01）。見圖3。

2. 5 各時間點不同濃度 SGK3抗體組小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)

GV期小鼠卵母細(xì)胞在濃度為1∶200、1∶ 100、1∶ 50 和1∶ 25 的SGK3 抗體中體外培養(yǎng)1、2、3 和4 h，相差顯微鏡下觀察并拍照。1 h 時，對照組和1∶200 SGK3 抗體組中超過半數(shù)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD，1∶100 SGK3 抗體組中部分小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD，1∶50 SGK3 抗體僅有少數(shù)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD，1∶25 SGK3 抗體組中小鼠卵母細(xì)胞幾乎未發(fā)生GVBD。4 h 時，對照組和1∶200 SGK3 抗體組中小鼠卵母細(xì)胞幾乎全部發(fā)生GVBD，1∶100 SGK3 抗體組中大部分小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD，1∶50 SGK3 抗體組中部分小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD，1∶25 SGK3 抗體組中少量小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD。不同時間點1∶ 25SGK3 抗體組小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率明顯低于其他各組。見圖4～7。

2. 6 過表達(dá)SGK3后不同時間點各組小鼠卵母細(xì)胞中 CDC2-pTyr15蛋白表達(dá)情況

SGK3 mRNA 組小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)在顯微注射后1 h 已檢測不到， 對照組和TE 組小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)在培養(yǎng)后2 h 完全消失；與對照組比較，SGK3 mRNA 組小鼠卵母細(xì)胞中檢測不到CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)的時間至少提前1 h。見圖8。

2. 7 各時間點不同濃度 SGK3抗體組小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15蛋白表達(dá)情況

與對照組比較，1∶200 SGK3 抗體組小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15完全脫磷酸化時間無差異， 2 h 后已檢測不到CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)； 1 ∶ 100 SGK3 抗體組小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)2 h 后開始減弱，4 h 完全消失；1∶50 和1∶25 SGK3 抗體組小鼠卵母細(xì)胞中1、2、3 和4 h 時均能檢測到CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)。見圖9。

2. 8 體 外 培 養(yǎng) 不 同 時 間 點 小 鼠 卵 母 細(xì) 胞 中SGK3-pSer486 蛋白表達(dá)水平

體外培養(yǎng) 0、30、60、90 和 120 min 時 GV 期小鼠卵母細(xì)胞中SGK3-pSer486 蛋白表達(dá)水平分別為0. 156±0. 003、0. 775±0. 002、0. 858±0. 004、0. 959±0. 005 和0. 981±0. 007。與0 min 時比較， 30 min 后小鼠卵母細(xì)胞中SGK3-pSer486 蛋白表達(dá)水平逐漸升高（Plt;0. 01）， 60～120 min 時仍然維持在較高的水平。見圖10。

2. 9 體外 培 養(yǎng) 不 同 時 間 點 小 鼠 卵 母 細(xì) 胞 中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)水平

體外培養(yǎng) 0、30、60、90 和 120 min 時 GV 期小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)水平分別為0. 956±0. 008、0. 941±0. 015、0. 567±0. 011、0. 477±0. 011 和0. 030±0. 020。體外培養(yǎng)0 和30 min 時小鼠卵母細(xì)胞中 CDC2-Tyr15 蛋白表達(dá)水平較高， 與 0 和30 min 時比較， 60 min 后小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)水平逐漸降低（Plt;0. 01），120 min 時已檢測不到CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)。見圖11。

3 討 論

SGK3 在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。減數(shù)分裂是卵母細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵過程，涉及到細(xì)胞周期的精確調(diào)節(jié)、染色體的對分離和遺傳物質(zhì)的平衡分配［11-12］。SGK3 作為絲氨酸/蘇氨酸激酶在卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂中具有多方面的功能。本研究結(jié)果表明：SGK3 可能與細(xì)胞周期調(diào)控關(guān)鍵因子CDC2 相互作用，并參與調(diào)節(jié)CDC2 的激活。在減數(shù)分裂的恢復(fù)過程中， SGK3 可通過直接激活CDC25B 促使CDC2 的脫磷酸化， 進(jìn)而激活CyclinB-CDC2 復(fù)合物［13-15］。該活化過程是卵母細(xì)胞實現(xiàn)G2/ M 期轉(zhuǎn)換的重要步驟，可促進(jìn)減數(shù)分裂的恢復(fù)［16-17］。卵母細(xì)胞到胚胎的轉(zhuǎn)變過程中，減數(shù)分裂的成功與否決定了卵子的質(zhì)量和胚胎的受精率［18］。因此，卵母細(xì)胞中G2/M 期轉(zhuǎn)換的發(fā)生對于減數(shù)分裂的恢復(fù)至關(guān)重要。有學(xué)者［19-21］ 研究發(fā)現(xiàn)：SGK3 在卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌等生殖系統(tǒng)腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，造成細(xì)胞周期嚴(yán)重紊亂。利用微小RNA （microRNA，miRNA） 靶向抑制SGK3可促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡，從而改善多囊卵巢綜合征的功能失調(diào)［22-24］。但SGK3 在小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)中的作用尚不清楚。

為了進(jìn)一步研究 SGK3 在小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)中的分子調(diào)控機(jī)制，本研究首先通過顯微注射技術(shù)將SGK3-mRNA 注入GV 期小鼠卵母細(xì)胞中， 結(jié)果顯示： 與對照組比較， 注射SGK3-mRNA 后小鼠卵母細(xì)胞GVBD 率明顯升高， 提示過表達(dá)SGK3 能夠加快卵母細(xì)胞GVBD 進(jìn)程； 同時， 過表達(dá)SGK3-mRNA 可以加快卵母細(xì)胞中CDC2-Tyr15 脫磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞發(fā)生G2/M 期轉(zhuǎn)化； 用SGK3 抗體稀釋液處理GV 期卵母細(xì)胞，隨著抗體濃度升高，與對照組比較，在各檢測時間點發(fā)生GVBD 的卵母細(xì)胞數(shù)量減少，GVBD 率降低， 卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD 速度降低，且抑制SGK3 可以延遲CDC2-Tyr15 脫磷酸化，提示抑制SGK3 后卵母細(xì)胞發(fā)生G2/M 期轉(zhuǎn)換阻滯，進(jìn)一步證明SGK3 在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂中起正向調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果顯示：SGK3-mRNA 組小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)在顯微注射后1 h 已檢測不到，對照組CDC2-pTyr15 蛋白表達(dá)在培養(yǎng)后2 h 完全消失； 與對照組比較， 過表達(dá)SGK3 使小鼠卵母細(xì)胞中CDC2-Tyr15 完全脫磷酸化時間至少提前1 h， 說明SGK3 可能是通過縮短CDC2-Tyr15 完全脫磷酸化時間來增加GVBD 率。此外，SGK3 還可能與其他信號通路和調(diào)控因子相互作用， 如與PI3K/PDK1/TORC2 信號通路有關(guān)［25］， 其相互作用可能進(jìn)一步調(diào)控著卵母細(xì)胞減數(shù)分裂的進(jìn)程。本研究結(jié)果顯示：在體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞的過程中，SGK3 的磷酸化開始于30 min，而CDC2 的完全脫磷酸化則發(fā)生在90 min 后，說明在小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)過程中，SGK3 的激活早于CDC2 的激活， SGK3 可能是CDC2 的上游調(diào)控因子，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜合上述，SGK3 是小鼠卵母細(xì)胞第一次減數(shù)分裂恢復(fù)的正性調(diào)節(jié)因子，具有促進(jìn)其減數(shù)分裂的作用。本研究結(jié)果為卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)機(jī)制提供了進(jìn)一步的補(bǔ)充，為不孕癥并發(fā)卵母細(xì)胞成熟障礙患者提供了新的診斷靶點和治療方向，同時有助于更好地認(rèn)識細(xì)胞生長、發(fā)育、凋亡和癌變的深層機(jī)制，也可為今后優(yōu)化動物繁殖、人類體外生殖輔助技術(shù)和腫瘤的靶向治療提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

郭文秀和莊妍參與研究方案的制定、研究實施過程、數(shù)據(jù)采集和論文撰寫，張慧靈和何文寧參與數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)分析和文獻(xiàn)整理，孟峻參與論文修訂和審校。

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