PTMC/PVP 溫控收縮性納米纖維膜與小鼠成纖維細胞的生物相容性及其對大鼠皮膚全層缺損的修復作用

［摘 要］ 目的：探討溫控收縮性聚三亞甲基碳酸酯 （PTMC）/聚乙烯吡咯烷酮 （PVP） 納米纖維膜對小鼠成纖維細胞生物學行為的影響及對大鼠全層皮膚缺損的修復作用，并闡明其可能的作用機制。方法：體外實驗選用小鼠成纖維L929細胞，分為對照組和實驗組（采用PTMC/PVP納米纖維膜處理），CCK-8 法檢測2 組細胞增殖活性，活/死細胞染色實驗觀察2 組細胞中活/死細胞數量，細胞骨架染色實驗觀察2 組細胞形態表現。體內實驗選用12 只6 周齡雄性SD 大鼠，隨機分為對照組和實驗組，每組6 只，建立全層皮膚缺損模型，實驗組大鼠采用PTMC/PVP 納米纖維膜治療，術后拍照觀察，第0、3、6 和12 天時計算2 組大鼠創面愈合率，術后第6 和12 天切取2 組大鼠皮膚創面和周圍組織，采用HE 染色觀察皮膚創面和周圍組織病理形態表現，Masson 三色染色觀察2 組大鼠皮膚創面組織中膠原蛋白沉積情況， CD31 免疫組織化學染色檢測2 組大鼠皮膚創面組織中血管形成數量。結果：CCK-8實驗，實驗組細胞增殖活性在第1、3和5天均呈升高趨勢，與對照組比較差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。活/死細胞染色實驗，與對照組比較，實驗組細胞密度和數量無明顯變化且以活細胞為主。細胞骨架染色實驗，實驗組和對照組細胞均呈梭形且細胞伸展。體內實驗，第3、6 和12 天時，與對照組比較，實驗組大鼠創面愈合率升高（Plt;0. 01），12 d 時實驗組大鼠創面愈合率為95. 45%，創面基本愈合。HE 染色，與對照組比較，第12 天實驗組大鼠創面皮膚結構更接近正常皮膚，有豐富的肉芽組織、規則的表皮結構和新血管生成。Masson 三色染色，與對照組比較，實驗組大鼠創面組織中膠原蛋白沉積量更多。免疫組織化學染色，與對照組比較，實驗組大鼠創面組織中CD31表達增多，表明血管形成數量增加。結論：PTMC/PVP溫控收縮性納米纖維膜具有良好的生物相容性，且能促進大鼠皮膚全層缺損的修復，其作用機制可能與增強基底細胞增殖活性有關。

［關鍵詞］ 傷口敷料； 機械力學； 溫控收縮性； 聚三亞甲基碳酸酯/聚乙烯吡咯烷酮； 納米纖維； 靜電紡絲

［中圖分類號］ R318. 08 ［文獻標志碼］ A

皮膚是人體最大的器官，是身體抵御外界因素入侵的第一道屏障［1］。口腔頜面部的皮膚位于人體突出且暴露的位置，極易受到創傷而導致軟組織缺損［2］。在傷口愈合過程中，慢性或面積較大的傷口很難通過自我收縮閉合，縫合是促進傷口閉合的金標準技術［3］，但其具有留下疤痕或感染的風險，傳統敷料如紗布和繃帶等具有不同程度的吸收性，在去除后會導致損傷和組織生長不全［4］。目前傷口敷料的研究主要著重于材料的生化功能，如在敷料中添加生物活性物質，從而賦予敷料抗菌［5-6］、血管形成［7］ 和抗炎［8］ 等功能，但均存在價格昂貴、制備復雜和不良反應較大等弊端。近年來，胚胎傷口獨特的無創愈合方式逐漸引起生物醫學領域的關注。研究［9］ 表明： 在胚胎傷口的愈合過程中圍繞胚胎傷口邊緣的細胞前緣形成肌動蛋白束，肌動蛋白束收縮并施加力可將傷口邊緣拉在一起，最終實現傷口的完美愈合。受到胚胎傷口無創快速愈合方式的啟發，利用材料的機械收縮性能縮小傷口的面積、促進傷口的閉合和愈合已經成為制備傷口敷料的新的研究方向之一［10-12］。

聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）是一種水溶性高分子化合物，具有良好的生物相容性、吸濕性和粘合性， 被廣泛應用于生物醫療領域［13-14］。聚三亞甲基碳酸酯（polytrimethylenecarbonate，PTMC） 是一種可生物降解的非晶體聚合物， 具有良好的生物相容性和力學性能［15］。在本課題組前期研究［16］ 中，通過靜電紡絲技術成功制備了具有溫控收縮性的PTMC/PVP 納米纖維膜，對其理化性質表征和體外溫控收縮性能進行了研究，結果表明：PTMC/PVP 納米纖維具有周期性分布的多孔紡錘狀結構， 并且當PTMC 與PVP的比例為1∶ 3 時具有最強的收縮性， 其收縮率隨溫度的升高而增大，同時能在30 min 內將大鼠離體皮膚的創傷面積縮小至70% 左右。在此基礎上，本研究通過體外細胞實驗和體內實驗對PTMC/PVP （1∶3） 納米纖維膜進行深入研究，探討其細胞相容性及對大鼠皮膚全層缺損的修復作用，為其進一步臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1. 1 細胞、實驗動物、主要試劑和儀器

小鼠成纖維L929 細胞購自中國科學院上海細胞庫。12 只6 周齡雄性SD 大鼠購自吉林大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK202306061，體質量180～200 g。PTMC （相對分子質量為378 000） 購自濟南岱罡生物工程有限公司， PVP（相對分子質量為630 000） 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司， 二氯甲烷（dichloromethane，DCM） 和N， N- 二甲基甲酰胺（N， Ndimethylformamide，DMF） 購自上海麥克林生化科技股份有限公司，青霉素-鏈霉素溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、DMEM高糖培養基和胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） 購自美國BI 公司，CCK-8 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，活/死細胞染色試劑盒購自上海貝博生物科技有限公司，DAPI 染液和TRITC-Phalloidin 染液購自北京索萊寶科技有限公司，脫毛膏購自中國利潔時家化有限公司，4% 多聚甲醛購自中國白鯊生物科技有限公司。靜電紡絲機購自北京艾博智業有限公司，多功能酶標儀、恒溫細胞培養箱、離心機和旋轉石蠟切片機購自美國ThermoFisher 公司， 倒置熒光顯微鏡和正置光學顯微鏡購自日本Olympus 公司，石蠟包埋機購自湖北泰微醫療科技有限公司，自動脫水機和自動染色機購自德國Leica 公司。

1. 2 PTMC/PVP納米纖維膜的制備

根據本課題組前期研究［16］ 的方法制備PTMC/PVP 納米纖維膜。將PTMC 和PVP （1∶3，W/W） 溶解在DCM 和DMF （3∶ 1， W/W） 混合物中， 室溫攪拌6 h 后制得靜電紡絲前體溶液（3%），將其進行靜電紡絲5 h 制得納米纖維膜，其中電紡參數為電壓15 kV，流速2 mL·h-1，針頭距離接收器的距離20 cm，針頭內徑21 G。將所有制備好的膜置于真空干燥箱中24 h。

1. 3 PTMC/PVP納米纖維膜的細胞相容性檢測

1. 3. 1 細胞培養

將L929 細胞接種于含10%FBS和1% 青霉素-鏈霉素溶液的DMEM 高糖培養基中， 置于37 ℃、5% CO2 恒溫細胞培養箱中培養，當細胞生長密度達80% 時使用胰蛋白酶消化傳代，用于后續實驗。

1. 3. 2 CCK-8 法檢測各組細胞增殖活性

將PTMC/PVP 納米纖維膜經紫外照射殺菌后置于96孔細胞培養板底部，以每孔1. 5×103 個細胞的密度將L929 細胞接種于 96 孔細胞培養板中，每 2 d 更換1 次培養基， 設不含 PTMC/PVP 納米纖維膜的L929 細胞為對照組。 第 1、3 和 5 天更換為含有10% CCK-8 溶 液 的 培 養 基，置于恒溫細胞培養箱中避光孵育2 h，采用酶標儀檢測各組細胞培養上清液在450 nm 波長處的吸光度（A） 值，以A 值代表細胞增殖活性。

1. 3. 3 活/死細胞染色實驗檢測各組活/死細胞數量

將PTMC/PVP 納米纖維膜紫外照射殺菌并置于24 孔細胞培養板底部， 以每孔1×104 個細胞的密度將L929 細胞接種于24 孔細胞培養板中。培養48 h 后棄去培養基， 加入根據說明書配制好的Calcein-AM/PI 染色工作液，置于細胞培養箱中避光孵育15 min 后， 棄去工作液并用PBS 緩沖液沖洗2 次。采用熒光倒置顯微鏡觀察細胞染色情況和數量，活細胞發出綠色熒光，而死細胞發出紅色熒光。設不含PTMC/PVP 納米纖維膜的L929 細胞為對照組。

1. 3. 4 細胞骨架染色實驗檢測各組細胞形態表現

細胞分組和處理方法見“1. 3. 3”。細胞培養48 h 后棄去培養基， PBS 緩沖液沖洗2 次后用4%多聚甲醛固定細胞15 min，再用0. 2%Triton X-100透化處理15 min，PBS 緩沖液沖洗2 次。加入根據說明書配制好的TRITC-Phalloidin 染色工作液室溫避光孵育30 min， PBS 緩沖液沖洗2 次， 再加入DAPI 染液避光孵育30 s 后，棄去工作液并用PBS緩沖液沖洗2 次。采用熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態表現，細胞骨架發出紅色熒光，細胞核發出藍色熒光。

1. 4 大鼠全層皮膚缺損模型的構建和實驗分組

12 只雄性SD 大鼠禁食禁水后采用戊巴比妥鈉（40 mg·kg-1） 腹腔注射麻醉，剃除并用脫毛膏去除大鼠背部毛發后， 75% 乙醇進行皮膚消毒， 用打孔器在大鼠的背部制備直徑為10 mm 的圓形全層皮膚缺損。12 只SD 雄性大鼠隨機分為對照組（創面用生理鹽水處理） 和實驗組（創面用直徑20 mm 的圓形PTMC/PVP 納米纖維膜覆蓋）， 對2 組大鼠進行相應處理后，均使用無菌紗布覆蓋創面。在0、3、6 和12 d 時拍照記錄， 采用Image J軟件測量并計算創面面積，采用創面愈合率評估創面愈合情況。創面愈合率= （初始創面面積-第n 天創面面積/初始創面面積×100%。

1. 5 組織學染色觀察 2組大鼠皮膚創面組織病理形態表現、膠原蛋白沉積情況和血管形成數量

術后第6 和12 天， 取大鼠皮膚創面及周圍組織，用4% 多聚甲醛固定，包埋在石蠟中并制成厚度為4 μm 的組織切片， 采用HE 染色、Masson 三色染色和CD31 免疫組織化學染色后用顯微鏡采集圖像，分別觀察大鼠皮膚創面組織病理形態表現、膠原蛋白沉積情況和CD31 表達情況， CD31 陽性表達增加則表示血管形成數量增多。

1. 6 統計學分析

采用SPSS 25. 0 統計軟件進行統計學分析。2 組細胞增殖活性和大鼠皮膚創面愈合率均呈正態分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗，2 組間樣本均數比較采用兩獨立樣本t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 PTMC/PVP納米纖維膜的細胞相容性

采用CCK-8 法檢測PTMC/PVP 納米纖維膜作用后各組L929 細胞的增殖活性。第1、3 和5 天L929 細胞增殖活性呈升高趨勢， 與對照組比較，實驗組細胞增殖活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖1。

采用活/死細胞染色實驗觀察2 組L929 細胞的生存能力。與對照組比較，實驗組細胞密度和數量無明顯變化，且均以活細胞（綠色熒光） 為主，僅有少量死細胞（紅色熒光）。見圖2。

采用細胞骨架染色實驗觀察2 組L929 細胞形態表現。對照組和實驗組L929 細胞均呈梭形且細胞伸展。見圖3。

2. 2 2組大鼠皮膚創面愈合率

術后第12 天時可見實驗組大鼠皮膚創面面積較小，基本愈合，而對照組大鼠皮膚創面仍有少量結痂。見圖4。

術后第3、6 和12 天時，實驗組大鼠皮膚創面愈合率均高于對照組（Plt;0. 01）。見圖5。

2. 3 2組大鼠皮膚創面組織病理形態表現、膠原蛋白沉積情況和血管形成情況

HE 染色： 治療12 d 后， 2 組大鼠皮膚創面均進行了一定程度的再上皮化，與對照組比較，實驗組大鼠皮膚創面具有更成熟的上皮組織、豐富的毛囊和新生血管（圖6A～6D）。Masson 染色： 與對照組比較，實驗組大鼠皮膚創面組織有更密集和排列更好的膠原蛋白（藍色） 沉積（圖6E～6H）。CD31 免疫組織化學染色：與對照組比較，實驗組大鼠皮膚創面組織中CD31 表達（棕黃色區域） 增多，表明血管形成數量增加（圖6I～6L）。

3 討 論

近年來，受胚胎傷口無創愈合方式的啟發，材料的機械收縮性已經成為促進皮膚傷口閉合的研究熱點之一。BLACKLOW 等［17］ 制備了熱響應收縮性聚N- 異丙基丙烯酰胺（poly Nisopropylacrylamide，PNIPAm） 活性黏合劑敷料，利用該敷料的機械活性和黏性能夠有效加速傷口閉合和傷口愈合。THEOCHARIDIS 等［18］ 制備了一種應變程序化貼片，基于材料的形狀記憶機制，機械收縮糖尿病患者傷口，促進糖尿病患者傷口閉合和再上皮化。

本課題組前期研究［16］ 制備出用于促進傷口閉合的溫控收縮性PTMC/PVP 納米纖維膜，并且已經對其理化性質表征和體外溫控收縮性進行了研究， 結果表明： 利用PTMC 的溫控收縮性和出色的力學性能及PVP 的親水性和黏附性， PTMC/PVP 納米纖維膜能夠有效縮小大鼠離體皮膚缺損模型的面積， 加速傷口閉合。在前期研究的基礎上，本研究進一步探討了PTMC/PVP 納米纖維膜的生物相容性以及對大鼠全層皮膚缺損模型的修復作用。

細胞相容性是設計生物材料植入物和醫療設備的首要條件，細胞增殖活性是評估傷口敷料生物特性的重要指標。本研究中CCK-8 實驗、活/死細胞染色實驗和細胞骨架染色實驗結果顯示：PTMC/PVP 納米纖維膜對 L929 細胞無毒性作用，且對L929 細胞形態也無明顯影響，表明PTMC/PVP 納米纖維膜具有良好的細胞相容性。PTMC 和PVP均是美國食品藥品監督管理局（Food and DrugAdministration， FDA） 批準的具有良好生物相容性的聚合物材料。PTMC 具有獨特的降解性能，包括抵抗非酶降解和表面降解機制， 使PTMC 在降解過程中能夠保持結構穩定性，同時其降解產物呈中性，避免了酸性降解產物對細胞及傷口產生的炎癥刺激［15］。而PVP 作為親水性聚合物，已經在制藥、生物醫學和營養保健領域中廣泛用作載體［19］。

本研究進一步通過體內實驗驗證PTMC/PVP納米纖維膜對大鼠全層皮膚缺損的修復作用，第3、6 和12 天時實驗組大鼠傷口愈合率明顯高于對照組，表明通過該納米纖維膜的機械牽拉作用能夠有效縮小傷口的面積，促進傷口的愈合，與相關研究結果［11］ 一致。本研究中HE 染色結果表明：PTMC/PVP 納米纖維膜能夠有效促進皮膚傷口處的再上皮化。沉積和重塑適當的膠原蛋白對于傷口愈合至關重要，本研究中Masson 三色染色結果表明：PTMC/PVP 納米纖維膜能夠促進大鼠皮膚創面膠原蛋白的沉積。血管化通過向傷口部位提供氧氣和營養物質并清除代謝廢物，在傷口修復中起著至關重要的作用，為了研究PTMC/PVP 納米纖維膜促進大鼠皮膚創面愈合的效果，本研究評估了血管生成的程度。CD31 是一種跨膜蛋白，在早期血管生成中表達，在促進傷口愈合方面發揮著至關重要的作用［20-21］。本研究中CD31 免疫組織化學染色結果表明：PTMC/PVP 納米纖維膜可以促進皮膚組織修復過程中的血管生成。快速的傷口收縮能夠促進傷口的修復過程［22］， 可能是由于傷口的收縮過程增強了基底細胞的增殖活性，減少了傷口的炎癥反應， 從而促進了傷口的愈合。研究［23］ 表明：抑制Yes 關聯蛋白（Yes-associated protein， YAP）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated proteinkinase，MAPK） 能夠阻斷創面的收縮反應，因此YAP 和MAPK/細胞外調節蛋白激酶（extracellularregulatory protein kinase， ERK） 信號通路的調節也可能影響傷口的愈合進程。

綜上所述，溫控收縮性PTMC/PVP 納米纖維膜具有良好的細胞相容性，并能夠通過機械收縮性縮小大鼠全層皮膚缺損處的面積，促進皮膚缺損處的膠原蛋白沉積、血管生成和再上皮化，加速皮膚缺損的修復過程。PTMC/PVP 納米纖維膜在促進傷口閉合和傷口愈合方面具有良好的應用前景。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

劉麗萍參與研究設計和論文撰寫，李弛宇和楊韜參與數據收集和分析，王少如和劉昀參與論文結果分析和討論，劉國民和程志強參與研究設計和實驗指導，羅云綱和劉志輝參與論文撰寫指導和論文審校。

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[基金項目] 吉林省科技廳科技發展計劃項目（20220204124YY）