下調miR-208a 通過靶向SFRP1 介導Wnt 信號通路對結直腸癌細胞5-FU 耐藥的改善作用

［摘 要］ 目的：探討下調微小 RNA-208a（miR-208a） 對結直腸癌細胞 5-氟尿嘧啶 （5-FU） 耐藥的影響，闡明其相關分子機制。方法：采用實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 法檢測結直腸癌5-FU耐藥細胞株HT-29/5-FU 及其親本HT-29 細胞中miR-208a 和分泌型卷曲相關蛋白1 （SFRP1） mRNA 表達水平。以HT-29/5-FU 細胞為研究對象，將miR-208a 抑制物（miR-208a inhibitor） 質粒及其陰性對照質粒（inbibitor-NC） 和SFRP1 小干擾質粒（si-SFRP1） 及其陰性對照質粒（si-NC） 分別或同時轉染至HT-29/5-FU 細胞中，聯合5-FU 處理，將細胞分為空白組、inhibitor-NC 組、miR-208a inhibitor 組、miR-208a inhibitor+si-NC 組和miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組。MTT 法檢測各組細胞增殖活性并計算耐藥指數，Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染法結合流式細胞術檢測不同濃度5-FU 作用后各組細胞凋亡率，Western blotting 法檢測各組細胞中SFRP1、β-連環蛋白（β-catenin）、P-糖蛋白（P-gp） 和ATP 結合盒B 亞家族成員1 轉運蛋白（ABCB1） 蛋白表達水平。雙熒光素酶報告基因實驗驗證miR-208a 與SFRP1 的靶向關系。結果：與 HT-29 細胞比較，HT-29/5-FU 細胞中 miR-208a 表達水平升高 （Plt;0. 05），SFRP1 mRNA 表達水平降低（Plt;0. 05）。與inhibitor-NC 組比較，miR-208a inhibitor 組細胞增殖活性降低（Plt;0. 05）， 耐藥指數降低， 細胞凋亡率升高（Plt;0. 05）， 細胞中β-catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。雙熒光素酶報告基因實驗提示SFRP1 是miR-208a 靶基因，且miR-208a 可負向調控SFRP1 的表達。 與 miR-208a inhibitor+si-NC 組 比 較， miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組細胞增殖活性升高（Plt;0. 05）， 耐藥指數升高， 細胞凋亡率降低（Plt;0. 05）， 細胞中β -catenin、P-gp 和 ABCB1 蛋白表達水平升高 （Plt;0. 05）。結論：下調 miR-208a 可通過靶向上調SFRP1 表達抑制Wnt 信號通路的轉導，進而改善HT-29/5-FU 細胞對5-FU 的耐藥。

［關鍵詞］ 結直腸腫瘤； 微小RNA-208a； 分泌型卷曲相關蛋白1； Wnt 信號通路； 5-氟尿嘧啶； 耐藥性

［中圖分類號］ R735. 1 ［文獻標志碼］ A

近年來，結直腸癌已成為世界第二大癌癥致死病因［1］，其臨床治療方法主要包括手術切除和化療等，但化療藥物的長期使用產生的耐藥性會導致治療效果較差， 患者生存期不能得到有效延長［2-3］。為此， 深入探索結直腸癌耐藥相關的異常表達基因、信號通路和分子機制，將有助于發掘潛在的結直腸癌耐藥治療靶點。微小RNA （microRNA，miRNA） 是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，與多種腫瘤細胞惡性發展關系密切。研究［4-6］ 表明： miR-208a 參與調控乳腺癌、非小細胞肺癌和骨肉瘤發生發展過程。分泌型卷曲相關蛋白（secreted frizzledrelatedprotein，SFRP） 1 是SFRP 家族一員，參與多種信號通路的調控，進而影響細胞的生化、分化和凋亡等進程，且SFRP1 是miR-208a 的靶基因之一。王曉鳳等［7］ 研究顯示：SFRP1 在肺癌組織中低表達，其過表達可明顯抑制肺癌A549 細胞增殖、克隆形成、遷移和侵襲等惡性表型。但miR-208a是否通過靶向SFRP1 介導Wnt 信號通路進而調控結直腸癌細胞5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil， 5-FU）耐藥目前尚不明確。本研究探討miR-208a 對人結直腸癌5-FU 耐藥株HT-29/5-FU 細胞耐藥性的影響及其分子機制，為改善結直腸癌5-FU 耐藥提供潛在的分子靶點。

1 材料與方法

1. 1 細胞和主要試劑

人結腸癌HT-29細胞株購自中國科學院上海細胞庫，人結直腸癌5-FU 耐藥細胞株HT-29/5-FU 由本課題組前期構建， 5-FU對親本HT-29 細胞的半數抑制濃度（half maximalinhibitory concentration， IC50） 為19. 48 mg·L-1 ［8］。RPMI-1640 培養基、Opti-MEM 培養基和胎牛血清（fetal bovine serum， FBS） 購自美國Gibco 公司，5-FU、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、噻唑藍（methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT） 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒和Lipo8000TM 轉染試劑購自上海碧云天生物技術有限公司，miR-208 抑制物（miR-208a inhibitor） 及其陰性對照質粒（inhibitor-NC）、miR-208a 模擬物（miR-208a mimics） 和 SFRP1 小 干 擾 質 粒（si-SFRP1） 及其陰性對照質粒（si-NC） 由廣州銳博生物技術有限公司提供，Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、細胞總蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和高靈敏ECL 發光檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，SFRP1 抗體、β-連環蛋白（β-catenin） 抗體、P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp） 抗體和ATP 結合盒B 亞家族成員1 轉運蛋白（ATP-binding cassette subfamily B member 1，ABCB1） 抗體購自英國Affinity 公司， GAPDH 抗體和HPR 酶標記的親和純化山羊抗兔IgG （H+L）二抗購自美國Proteintech 公司。

1. 2 細 胞 培 養 、轉 染 和 分 組

HT-29 細 胞 和HT-29/5-FU 細胞采用含10% FBS 的RPMI-1640完全培養基，置于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養過夜。胰酶消化對數生長期HT-29/5-FU 細胞，加入完全培養基重懸細胞并調整細胞密度為3×105 mL-1，將細胞以每孔2 mL 接種至6 孔細胞培養板中， 置于培養箱中培養過夜， 待細胞融合度達到70%～80% 時， 參照Lipo8000TM 轉染試劑說明書， 結合Opti-MEM 培養基進行以下2 個轉染實驗：①將細胞分為空白組（不進行轉染）、inhibitor-NC 組（轉染inhibitor-NC） 和 miR-208a inhibitor 組（ 轉染miR-208a inhibitor）。②將細胞分為inhibitor-NC 組、miR-208a inhibitor 組、miR-208a inhibitor+si-NC組（共轉染 miR-208a inhibitor 和 si-NC） 及miR-208ainhibitor+si-SFRP1 組（共轉染miR-208a inhibitor和si-SFRP1）。8 h 后更換新鮮RPMI-1640 完全培養基， 轉染48 h 收集細胞采用實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）法檢測細胞轉染效果， 轉染成功的細胞用于后續實驗。

1. 3 MTT 法檢測各組細胞增殖活性、IC50和耐藥指數

收集轉染后的各組HT-29/5-FU細胞，以每孔3×103 個細胞接種至96 孔細胞培養板中， 同時設置調零孔（培養基對照）， 置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養過夜。加入不同濃度（0、5、10、20、40、80 和160 mg·L-1） 5-FU 處理各組細胞24 h。于檢測前4 h， 向每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1） 溶液，繼續培養4 h，棄培養液，每孔加入150 μL DMSO， 室溫避光震蕩10 min， 采用酶標儀檢測490 nm 波長處吸光度（A） 值，以A 值代表各組細胞增殖活性。細胞增殖率= （實驗孔A 值－調零孔A 值） / （空白對照孔A 值－調零孔A 值） ×100% 。采用SPSS 軟件根據細胞增殖率計算細胞IC50。計算耐藥指數，耐藥指數=HT-29/5FU 細胞IC50/HT-29 細胞IC50。

1. 4 Annexin Ⅴ-FITC/ PI 雙染法結合流式細胞術 檢 測 各 組 細 胞 凋 亡 率

收 集 轉 染 后 的 各 組HT-29/5-FU 細胞，以每孔3×105 個細胞密度接種至6 孔細胞培養板中，置于37 ℃、5% CO2 培養箱中培養過夜。加入不同濃度（0 和20 mg·L-1）5-FU 處理各組細胞24 h 后，按處理方法不同分為空 白 組、 inhibitor-NC 組、 miR-208 inhibitor 組、5-FU 組、 inhibitor-NC+5-FU 組 和 miR-208inhibitor+5-FU 組，各組收集1×105 個細胞，加入200 μL Annexin Ⅴ -FITC 結合液重懸， 加入5 μLAnnexin Ⅴ-FITC 混勻，再加入10 μL PI 染液混勻，室溫避光孵育20 min， 采用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。細胞凋亡率= 凋亡細胞數/細胞總數×100%。

1. 5 RT-qPCR 法 檢 測 各 組 細 胞 中 miR-208a 和SFRP1 mRNA表達水平

收集各組細胞，冷 PBS緩沖液清洗1 次后， 加入Trizol 提取細胞中總RNA， 采用PrimeScript RT reagent Kit 將總RNA逆轉錄為cDNA， 再分別采用TB Green FastqPCR Mix 和MirX miRNA qRT-PCT TB Green Kit試劑盒進行檢測。引物序列： miR-208a， F 5'-CGCGGCATAAGACGAGCAAAAAGC-3'， R 5'-ACGACAGTTCAACGGCAGCACCG-3'；SFRP1，F 5'-CCAATCGATGCCCCCATC-3'， R 5'-GAACGAGGTCAAGCTCTCACA-3'；U6，F 5'-ATC-GCCTTCGGCAGCACA-3'， R 5'-CACGCTGCACGAATTCGCGT-3'； GAPDH， F 5'-AGCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'， R 5'-CCGTGTTCCTACCCCCAATG-3'。90 ℃ 預變性3 min； 90 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，75 ℃延伸30 s，40 個循環。分別以U6 和GAPDH 為內參， 采用2－△△Ct 法計算miR-208a 和SFRP1 mRNA 表達水平。

1. 6 Western blotting法檢測各組細胞中 SFRP1、β-catenin、P-gp 和 ABCB1 蛋白表達水平

收集各組轉染后的細胞，冷PBS 清洗1 次后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取各組細胞中總蛋白，采用BCA 蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg總蛋白上樣，通過凝膠電泳將蛋白分離并轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride， PVDF） 膜上，置于5 g·L-1 脫脂牛奶中封閉1 h，加入SFRP1抗體（1∶ 1 000）、β -catenin 抗體（1∶ 1 000）、P-gp 抗體（1∶ 1 000）、ABCB1 抗體（1∶ 1 000）和GAPDH 抗體（1∶ 10 000）， 4 ℃ 孵育過夜，TBST 清洗3 次，加入HPR 酶標記的親和純化山羊抗兔IgG （H+L） 二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次， 滴加ECL 顯影液曝光。采用Image J 軟件分析各組蛋白條帶灰度值， 以GAPDH 為內參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1. 7 雙熒光素酶報告基因實驗驗證 miR-208a 與SFRP1的靶向關系

采用 miRDB在線數據庫預測miR-208a 的靶基因。設計并合成含有miR-208a結合位點的SFRP1 野生型（SFRP1-wt） 和突變型（SFRP1-mut） 片段，并將其插入雙熒光素酶報告載體pmirGLO 中， 參照“1. 2” 中的轉染方法，將SFRP1-wt 或SFRP1-mut 質粒與mimics-NC 或miR-208a mimics 共轉染至293T 細胞中，48 h 后按照雙熒光素酶試劑盒說明書進行檢測，采用熒光酶標儀檢測各組細胞雙熒光素酶活性。以海腎熒光素酶為內參，計算熒光素酶活性。熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1. 8 統計學分析

采用 SPSS 26. 0統計軟件進行統計學分析。HT-29 細胞和HT-29/5FU 細胞中miR-208a 表達水平，各組HT-29/5FU 細胞增殖活性、IC50 值、凋亡率和雙熒光素酶活性， 細胞中SFRP1、β-catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平均符合正態分布，以 -x±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析， 兩組間樣本均數比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 HT-29細胞和 HT-29/5-FU 細胞中 miR-208a表達水平

與 HT-29 細胞 （1. 01 ± 0. 04） 比較，HT-29/5-FU 細胞中miR-208a 表達水平（5. 35±0. 43） 升高（Plt;0. 05）。

2. 2 下調 miR-208a 表達后各組細胞中 miR-208a表達水平、細胞增殖活性、IC50值和耐藥指數

與空白組和 inhibitor-NC 組比較，miR-208a inhibitor 組細胞中miR-208a 表達水平降低（Plt;0. 05）， 說明miR-208a inhibitor 轉染成功。見圖1。與空白組和inhibitor-NC 組 比 較， 隨 著 5-FU 濃 度 升 高，miR-208a inhibitor 組細胞增殖活性逐漸降低（Plt;0. 05）。見圖2。與空白組［（124. 87±4. 49） mg·L-1］和inhibitor-NC 組［ （124. 57±7. 33） mg·L-1］ 比較， miR-208a inhibitor 組HT-29/5-FU 細胞IC50 值［ （23. 84±1. 72） mg·L-1］ 降低（Plt;0. 05）?？瞻捉M和inhibitor-NC 組HT-29/5-FU 細胞耐藥指數分別為6. 41 和6. 39， miR-208a inhibitor 組HT-29/5-FU 細胞耐藥指數為1. 22，逆轉倍數為5. 24。

2. 3 下調miR-208a表達后各組細胞凋亡率

與空白組和inhibitor-NC 組比較， miR-208a inhibitor 組和 miR-208a inhibitor+5-FU 組細胞凋亡率升高（Plt;0. 05）， 5-FU 組和inhibitor-NC+5-FU 組細胞凋亡率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）； 與miR-208a inhibitor 組比較，miR-208a inhibitor+5-FU 組細胞凋亡率升高（Plt;0. 05）。見圖3 和4。

2. 4 下調 miR-208a表達后各組細胞中 β-catenin、P-gp 和 ABCB1 蛋 白 表 達 水 平

與 空 白 組 和inhibitor-NC 組比較， miR-208a inhibitor 組細胞中β-catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。見圖5。

2. 5 miR-208a 與 SFRP1 的靶向關系

RT-qPCR法結果顯示：與HT-29 細胞（0. 99±0. 03） 比較，HT-29/5-FU 細胞中SFRP1 mRNA 表達水平（0. 35±0. 05） 降低（Plt;0. 05）。miRDB 在線數據庫預測結果顯示： SFRP1 序列中含有與miR-208a互補的結合位點。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示：與SFRP1-wt+mimics NC組比較，SFRP1-wt+miR-208a mimics 組細胞熒光素酶活性降低（Plt;0. 05）； 與SFRP1-mut+mimics NC 組比較，SFRP1-mut+miR-208a mimics 組細胞熒光素酶活性差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。Western blotting法結果顯示： 與空白組和inhibitor-NC 組比較，miR-208a inhibitor 組細胞中SFRP1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）。提示SFRP1 是miR-208a 靶基因， 并且miR-208a 可負向調控SFRP1 的表達。見圖6～8。

2. 6 SFRP1基因沉默和下調miR-208a表達后各組細胞中SFRP1蛋白表達水平、細胞增殖活性、IC50和耐藥指數

與 inhibitor-NC 組 比 較， miR-208ainhibitor 組細胞中SFRP1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）； 與 miR-208a inhibitor 組 和 miR-208ainhibitor+si-NC 組 比 較， miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組細胞中SFRP1 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。見圖9。與inhibitor-NC 組比較，隨著5-FU濃度升高， miR-208a inhibitor 組和miR-208ainhibitor+si-NC 組細胞增殖活性逐漸降低（Plt;0. 05）； 與 miR-208a inhibitor 組 和 miR-208ainhibitor+si-NC 組 比 較， 隨 著 5-FU 濃度升高，miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組細胞增殖活性升高（Plt;0. 05）。見圖10。與inhibitor-NC 組［（120. 67±6. 58） mg·L-1］ 比 較， miR-208a inhibitor 組 和miR-208a inhibitor+si-NC 組細胞 IC50 ［ （23. 52±1. 32） 和（22. 14±1. 14） mg·L-1］ 降低（Plt;0. 05）；與 miR-208a inhibitor 組 和 miR-208a inhibitor+si-NC 組比較，miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組細胞IC50 ［（111. 73±2. 91） mg·L-1］ 升高（Plt;0. 05）。與 inhibitor-NC 組 （耐藥指數為 6. 19） 比 較，miR-208a inhibitor 組和miR-208a inhibitor+si-NC 組細胞耐藥指數（1. 21 和1. 14） 降低； 與miR-208ainhibitor 組 和 miR-208a inhibitor+si-NC 組 比 較，miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組細胞耐藥指數（5. 74） 升高，逆轉倍數為5. 05。

2. 7 SFRP1基因沉默和下調miR-208a表達后各組細胞中 β -catenin、P-gp 和 ABCB1 蛋白表達水平

與inhibitor-NC 組比較， miR-208a inhibitor 組細胞中β-catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平降低 （Plt;0. 05）； 與 miR-208a inhibitor 組 和 miR-208a inhibitor+si-NC 組比較，miR-208a inhibitor+si-SFRP1 組細胞中β-catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）。見圖11。

3 討 論

目前，5-FU 是臨床治療結直腸癌的主要化療藥物， 但其耐藥性的產生會導致患者治療效果不佳。腫瘤細胞可通過多種機制產生耐藥性，其中包括 miRNA 轉錄調節。近年來研究［9-10］ 顯示：miRNA 不僅可以作為腫瘤預測和診斷的生物學指標，而且與腫瘤發生發展和耐藥性有密切關聯。李新玲等［11］ 研究表明： miR-208a 可能通過靶向調控蛋白酪氨酸磷酸酶受體G （protein tyrosinephosphatase receptor type gamma， PTPRG） 來促進非小細胞肺癌A549 細胞增殖、侵襲和遷移。YANG 等［12］ 研究發現： miR-208a-3p 在人結直腸癌組織中高表達，沉默其表達可抑制結直腸癌細胞增殖， 并誘導細胞凋亡。 CUI 等［13］ 研究顯示：miR-208a 在胃癌組織中高表達， 可靶向負調控SFRP1 進而促進胃癌細胞增殖和侵襲。但miR-208a 是否參與結直腸癌5-FU 耐藥目前尚不明確。本研究結果證實：miR-208a 在結直腸癌5-FU耐藥細胞株HT-29/5-FU 細胞中高表達，下調其表達可提高 SFRP1 蛋白表達水平， 降低 β-catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平，抑制HT-29/5-FU 細胞增殖活性，促進細胞凋亡，進而降低HT-29/5-FU細胞對5-FU 的敏感性，提示下調miR-208a 可改善HT-29/5-FU 細胞5-FU 耐藥。

P-gp 是一種依賴ATP 的外排轉運蛋白，是由ABCB 基因編碼的產物，可以識別和促進腫瘤細胞的藥物外排，降低藥物療效，其高表達是多種腫瘤耐藥細胞對化療藥敏感性降低的原因之一［14-16］，降低細胞中P-gp 的表達是提高結直腸癌耐藥細胞對化療藥物敏感性的重要途徑。Wnt 信號通路是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路，對細胞增殖、遷移和分化有重要影響，β-catenin 是Wnt 信號通路中的關鍵調控因子［17-18］。SFRP1 是Wnt 信號通路拮抗劑，是近年來發現的新的抑癌基因。SFRP1基因在多種腫瘤中的缺失導致Wnt 信號通路轉導途徑紊亂，影響腫瘤的發生發展［19］。沈二棟等［20］ 研究發現： SFRP1 在胃癌組織中低表達， 上調其表達水平可阻斷Wnt 通路， 進而抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲。HU 等［21］ 研究表明： miR-1180可通過靶向負調控SFRP1 激活Wnt 通路進而促進卵巢癌細胞增殖。WANG 等［22］ 研究顯示：SFRP1在人結直腸癌組織中低表達， 而過表達SFRP1 可明顯抑制結直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡，并下調Wnt 和β-catenin 蛋白表達水平，提示SFRP1 在結直腸癌惡性進程中扮演抑制基因的角色。 本研究結果顯示： 與 HT-29 細胞比較，SFRP1 在HT-29/5-FU 細胞中低表達；生物信息學分析和雙熒光素酶報告基因實驗提示： SFRP1 是miR-208a 潛在的下游靶基因； 抑制miR-208a 表達后，SFRP1 表達水平升高，說明miR-208a 可靶向下調SFRP1 表達。本研究結果顯示：下調miR-208a和沉默SFRP1 基因共同處理后，HT-29/5-FU 細胞增殖活性升高， 對 5-FU 耐受性增強， 細胞中β -catenin、P-gp 和ABCB1 蛋白表達水平升高， 提示沉默 SFRP1 基 因 可 逆 轉 下 調 miR-208a 對HT-29/5-FU 細胞5-FU 耐藥， 表明下調miR-208a可改善HT-29/5-FU 細胞5-FU 耐藥， 其分子機制可能與靶向SFRP1 介導的Wnt 通路有關。

綜上所述， miR-208a 在 結 直 腸 癌 耐 藥 株HT-29/5-FU 細胞中高表達，下調其表達可能通過靶向上調SFRP1 抑制Wnt 信號通路降低癌細胞對5-FU 的耐藥性。miR-208a 可能成為人結直腸癌5-FU 耐藥治療的潛在分子靶點和生物標志物。本研究不足之處在于實驗結果均由體外實驗研究得出，后續將通過動物體內實驗進一步驗證。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

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[基金項目] 湖南省科技廳創新型省份建設專項科普專題項目（2022ZK4289）； 湖南省衛健委科研項目（202204013770，202204014806）