基于泛基因組學和消減蛋白質組學技術篩選金黃色葡萄球菌基于泛基因組學和消減蛋白質組學技術篩選金黃色葡萄球菌

［摘 要］ 目的：應用泛基因組學和消減蛋白質組學技術從金黃色葡萄球菌基因組中篩選新抗菌靶點，為抗金黃色葡萄球菌藥物的研發奠定基礎。方法：在美國國家生物技術信息中心 （NCBI） 數據庫中以金黃色葡萄球菌為關鍵詞檢索全基因組測序數據，收集50 個測序級別為Complete 的菌株基因組數據。采用BPGA 工具對基因組數據進行泛基因組分析獲得金黃色葡萄球菌核心基因，采用消減蛋白質組學技術從中篩選獲得潛在抗菌靶點， 以潛在抗菌靶點為受體， 采用LibDock 軟件從美國食品藥品監督管理局（FDA） 批準的藥物庫中篩選潛在的抗金黃色葡萄球菌藥物，并采用分子對接技術分析藥物和靶點的結合能力。 結果：50 個金黃色葡萄球菌基因組中共有 14 379 個基因家族，其中1 620 個為核心基因。消減蛋白質組學分析，酪氨酸自激酶 1335 為潛在的抗金黃色葡萄球菌靶點。采用LibDock 軟件篩選出巴龍霉素、替諾福韋二吡呋酯和阿德福韋等9 個化合物可能針對該靶點蛋白發揮抗金黃色葡萄球菌作用，分子對接結果顯示靶點與化合物結合力良好。結論：酪氨酸自激酶可能是一種抗金黃色葡萄球菌潛在的靶點。

［關鍵詞］ 金黃色葡萄菌； 泛基因組； 分子對接； 消減蛋白質組

［中圖分類號］ R378. 1; Q811. 4 ［文獻標志碼］ A

金黃色葡萄菌（Staphylococcus aureus） 是一種革蘭陽性病原菌，是人類感染中最常見的病原菌，可引起局部的化膿感染、肺炎、敗血癥和膿毒癥等［1］。由于金黃色葡萄菌的生物膜形成及其自身多重耐藥性等特點， 導致常規抗菌藥物抗菌作用不佳［2］，迫切需要開發新型抗金黃色葡萄球菌藥物。藥物靶點是新藥開發的基礎，通過實驗篩選抗菌藥物靶點周期長且費用昂貴，如何加快藥物靶點的篩選有助于加速新型抗菌藥物的研發。泛基因組是指包含同一物種不同個體的所有基因組，包括核心基因、附屬基因和獨特基因［3］。核心基因參與對物種生存和繁殖等至關重要的基本生物學功能，如細胞呼吸及DNA 復制、轉錄和翻譯等［4］，因此從核心基因中篩選藥物靶點具有極大的潛力。IRFAN 等［5］ 研究顯示：從產吲哚黃桿菌的核心基因中篩選出的D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶可能是一種潛在的抗菌靶點。BASHARAT 等［6］ 研究顯示：采用泛基因組分析發現的2， 3， 4， 5-tetrahydropyridine-2-carboxylate N-succinyltransferase 可能是針對恙蟲病東方體的藥物靶點。本研究將泛基因組技術和消減蛋白質組技術相結合，從金黃色葡萄球菌核心基因組中篩選抗菌靶點，并采用分子對接技術從數據庫中篩選針對該靶點的藥物，以期為抗金黃色葡萄球菌靶點和藥物的開發提供新的思路。

1 資料與方法

1. 1 基因組數據下載

從美國國家生物技術信息中心（NationalCenter for Biotechnology Information， NCBI） 數據庫（2023 年3 月2 日，https：//www. ncbi. nlm. nih.gov/genome/） 中檢索金黃色葡萄球菌全基因組數據，選擇50 個最新上傳且測序級別為Complete 的菌株數據進行下載分析。所有基因組登錄號如下：GCA_024612055. 1 ， GCA_025259685. 1 ，GCA_024399375. 1， GCA_020177155. 3，GCA_024296825. 1， GCA_026547005. 1，GCA_026547185. 1， GCA_026547075. 1，GCA_026547055. 1， GCA_026547095. 1，GCA_026547005. 1， GCA_026547145. 1，GCA_026546985. 1， GCA_026547035. 1，GCA_025232045. 1， GCA_022832835. 1，GCA_023373745. 1， GCA_024172245. 1，GCA_027943925. 1， GCA_027943905. 1，GCA_020702615. 2， GCA_023170045. 1，GCA_025643635. 1， GCA_025559005. 1，GCA_025559325. 1， GCA_025559605. 1，GCA_025561585. 1， GCA_025559685. 1，GCA_025559725. 1， GCA_025559745. 1，GCA_025561605. 1， GCA_025561625. 1，GCA_025560825. 1， GCA_025561645. 1，GCA_027942275. 1， GCA_027942255. 1，GCA_026167725. 1， GCA_027920385. 1，GCA_026636215. 1， GCA_026625925. 1，GCA_028743615. 1， GCA_000756205. 1，GCA_028596145. 1， GCA_028596165. 1，GCA_026636235. 1， GCA_020906975. 2，GCA_028596045. 1， GCA_024741575. 1，GCA_024741455. 1， GCA_024741615. 1，GCA_024741555. 1。

1. 2 金黃色葡萄球菌的泛基因組分析

采用BPGA 軟件進行金黃色葡萄球菌的泛基因組分析［7］。利用USEARCH 軟件以50% 序列同源性為截斷值，構建金黃色葡萄球菌核心基因組；利用MUSCLE 軟件對核心基因進行串聯比對，采用Gunplot 軟件繪制泛基因組與核心基因組點圖；通過Neighbor-Joining 法構建系統發育樹， 并用Mega-X 軟件可視化；使用同源蛋白簇（Clusters ofOrthologous Groups of Proteins， COG） 數據庫對所有核心基因、附屬基因和獨特基因進行功能分析。與核心基因組相關的蛋白質序列用于隨后的藥物靶點篩選。

1. 3 金黃色葡萄球菌消減蛋白質組學篩選

1. 3. 1 核心基因的非人同源（non-human，NH）基因、必需基因和毒力因子（virulent factor，VF）基因篩選

首先對核心基因進行NH 基因、必需基因和VF 基因篩選。下載人基因組數據， 采用NCBIBLASTp 工具進行本地比對，核心基因中E-valuegt;1×10-3 的基因為NH 基因； 核心基因輸入必需基因數據庫（Database of Essential Gene， DEG）（https：//tubic. org/deg/public/index. php）， 以截斷值E-valuelt;10-4 和bit scoregt;100 篩選獲得必需基因［8］；核心基因輸入毒力因子數據庫（VirulenceFactors Database，VFDB）（http：//www. mgc. ac.cn/cgi-bin/VFs/v5/main. cgi），以截斷值E-valuelt;10-4篩選獲得VF 基因［9］。

1. 3. 2 蛋白質理化性質預測

根據編碼蛋白質的理化性質進行篩選。采用Protparam 工具（https：//web. expasy. org/protparam/） 預測蛋白質的理化性質， 包括氨基酸數、相對分子質量、等電點（isoelectric point， pI） 和總平均親水性（grandaverage of hydropathicity， GRAVY） 等［10］。采用CELLO 軟件（http：//cello. life. nctu. edu. tw/） 預測蛋白質的亞細胞定位［11］。排除氨基酸數目lt;100、相對分子質量gt;110 000、GRAVY 數值為正、低脂肪指數和非細胞膜定位的蛋白。

1. 4 靶點蛋白的分子對接

1. 4. 1 靶點蛋白的同源建模

靶點蛋白采用SWISS-MODEL 軟件（https：//swissmodel.expasy. org/） 進行同源建模［12］。選擇覆蓋率最大的蛋白作為模板， 蛋白質模型合理性采用Ramachandran plot、GMQ 和QMEANDisCo Global進行評價［13］。

1. 4. 2 靶點蛋白與數據庫化合物分子對接

采用BIOVIA Discovery Studio 2019 軟件進行分子對接篩選。從ZINC 數據庫批量下載經美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration， FDA）批準的892 個天然藥物分子作為配體，以靶點蛋白為受體，配體和受體經過預處理后，采用DeepSite軟件（https：//www. playmolecule. com/） 預測受體活性位點，對接大小為10，采用LibDock 軟件進行批量分子對接。選取LibDock 評分（LibDockScore） 最高的9 個化合物進行受體-配體非鍵作用分析［14］。

2 結 果

2. 1 金黃色葡萄球菌泛基因組分析

泛基因組分析顯示： 50 個金黃色葡萄球菌基因組共有14 379 個基因家族，其中1 620 個為核心基因。繪制 Pan-core plot 點圖， 擬合曲線方程：f（x）=2 334. 61 X0. 147013，金黃色葡萄球菌的泛基因組b 值=0. 147 013，表明金黃色葡萄球菌的基因庫雖然在持續發生變化，但是趨于穩定。金黃色葡萄球菌R3-8 菌株的附屬基因最多（n=1 035）， 金黃色葡萄球菌Alexandria 2020-19 菌株的附屬基因最少（n=740）。COG 功能注釋顯示：核心基因組主要涉及氨基酸的運輸、代謝和翻譯及核糖體結構、生物發生和DNA 轉錄等功能基因，輔助基因組主要涉及DNA 轉錄、復制、重組、修復及氨基酸轉運和代謝等功能基因， 獨特基因組主要涉及DNA 復制、重組、修復、轉錄和防御機制等功能基因。見圖1。

2. 2 消減蛋白質組篩選藥物靶點

對泛基因進行分別 NH基因、必需基因和 VF基因進行篩選，結果顯示：1 620 個核心基因中含有VF 基因25 個、必需基因1 193 個和NH 基因1 124 個，三者取交集獲得8 個潛在藥物靶點。見圖2。

對潛在的藥物靶點進行了理化性質篩選，結果見表1。Gene576、Gene474 和Gene66 定位于細胞外基質上， Gene474 相對分子質量大于100 000，Gene2511 氨基酸數目少于100 個， Gene2511 和Gene2294 的GRAVY 值為正數， 故上述基因均被剔除。Gene1335 具有較低的pI 數值， 因此選擇其作為抗菌藥物靶點。Gene1335 含有230 個氨基酸，相對分子質量為25 250， 可用于編碼酪氨酸自激酶。

2. 3 酪氨酸自激酶1335的同源建模

選擇同源性 98. 70% 的酪氨酸激酶 （tyrosinekinase，TK）（PDB ID：2ved. 1. A） 為模板，進行同源建模。二級結構數據顯示： 酪氨酸自激酶1335 含有 5 個 α 螺旋， 7 個 β 折疊，1 個跨膜螺旋（transmembrane helices， TMH）。蛋白的GMQ 評分為0. 92分，QMEANDisCo Global評分為（0. 88±0. 05） 分， Ramachandran plot 中 顯 示Ramachandran favoured 占93. 78%， Ramachandranoutliers 占1. 78%， Rotamer outliers 占4. 29%， 表明酪氨酸自激酶1335 蛋白結構合理， 可用于下一步的分子對接。見圖3。

2. 4 酪氨酸自激酶1335與藥物的分子對接篩選

以酪氨酸自激酶 1335為受體，對 892個來自FDA 驗證的天然化合物進行分子對接篩選，892 個化合物生成2 135 個構象，分子對接產生157 355 個對接結果。巴龍霉素、替諾福韋二吡呋酯和阿德福韋等9 個化合物具有最高分數，LibDock Score 均大于140 （表2）。LibDock Score≥90 表明配體與受體具有較強的親和力， 使得配體更容易結合［19］。巴龍霉素、環丙沙星、去鐵胺和甲氨蝶呤4 個化合物具有抗菌活性，而巴龍霉素和環丙沙星具有抗金黃色葡萄球菌活性。

酪氨酸自激酶1335 與化合物的2D 相互作用分析見圖4 和5。藥物與靶點之間的穩定性主要來源于化合物與受體活性位點之間形成氫鍵和疏水相互作用。酪氨酸自激酶1335 與9 個化合物均能產生較多的氫鍵和疏水相互作用。巴龍霉素的氧原子與酪氨酸自激酶1335 的Ser1056、Lys1055、Lys1082、Ala1053、Arg1212 和Thr1057 殘基形成6 個常規氫鍵相互作用，此外還與Pro1160、Gly1054、Asn1211、Lys220 和Phe221 殘基形成5 個碳氫鍵。

3 討 論

伴隨抗生素的大量使用，金黃色葡萄球菌對于針對傳統抗菌靶點藥物的耐藥性不斷增強。為了尋找新的抗菌靶點，本研究對金黃色葡萄球菌的基因組依次進行了泛基因組和消減蛋白質組學的篩選。核心基因作為抗菌藥物靶點具有2 個明顯優勢：核心基因主要參與生物體的基本生物學功能，也是生物體生存所必需的基因。核心基因是所有個體中共存的基因，具有高度保守性，針對核心基因開發的藥物更不容易產生耐藥性［20］。本研究結果顯示：金黃色葡萄球菌中含有1 620 個核心基因組，主要涉及氨基酸運輸、代謝、翻譯及核糖體結構、生物發生和DNA 轉錄等功能。

在進一步研究中，對核心基因進行消減蛋白組學篩選。抗菌藥物靶點與人類蛋白同源可能會增加藥物產生不良反應的風險，因此本研究中排除了人同源蛋白。必需基因和VF 基因是發現抗菌藥物的2 種主要靶點［21］。必需基因控制生物體生存所需的基本功能，對生物體的生存和正常功能至關重要。VF 是使病原體在宿主生物中引起疾病的特定分子［22］。研究［23-26］ 表明： 藥物靶點應該符合某些理化特征，如低相對分子質量蛋白（lt;110 000） 更容易被藥物所識別，是一種合適的藥物靶點；靶蛋白主要分布于細胞膜上；過小的蛋白（lt;100 個氨基酸） 一般被認為是不重要的；GRAVY 值為負值表明蛋白親水性好；高脂肪族指數說明蛋白熱穩定性好。 通過篩選， 最終發現一個最優靶點蛋白Gene1335，該蛋白是一種酪氨酸自激酶。

酪氨酸自激酶主要參與細菌胞外多糖和莢膜多糖的生物合成，如酪氨酸自激酶Wzc 參與大腸桿菌1 型莢膜多糖的組裝［27］， 在洋蔥伯克霍爾德氏菌中，酪氨酸自激酶bceD 和bceF 參與洋蔥伯克霍爾德氏菌胞外多糖和生物膜的形成［28］。研究［29］ 顯示：酪氨酸自激酶是細菌生長所必需的，在肺炎鏈球菌中， 酪氨酸自激酶UbK 基因缺陷將導致菌株表現出嚴重的細胞生長和細胞形態缺陷。目前尚未見酪氨酸自激酶1335 作為抗菌藥物靶點的研究報道， 本研究推測酪氨酸自激酶1335 可能是一種潛在的抗菌靶點。

研究［30］ 顯示：巴龍霉素和環丙沙星具有抗金黃色葡萄球菌活性，巴龍霉素是一種氨基糖苷類抗生素，環丙沙星是一種喹諾酮類抗生素，除傳統作用機制外，巴龍霉素和環丙沙星還可通過與酪氨酸自激酶1335 結合發揮抗金黃色葡萄球菌作用。分子對接是一種強大的計算方法，用于預測候選藥物的結合親和力和構象［31］。LIU 等［32］ 通過分子對接篩選發現：Collismycin A 與幾丁質合成酶具有最強的結合能力， 可能是Collismycin A 發揮抗真菌作用的主要靶點。本研究以酪氨酸自激酶1335 為受體， 從數據庫中篩選能與該靶點結合的藥物， 對LibDockScore 排名前9 位的化合物進行了分子對接分析，結果顯示：酪氨酸自激酶1335 與9 個化合物均有較強的結合能，且能產生較多的氫鍵和疏水相互作用，是潛在的抗金黃色葡萄球菌藥物。

綜上所述，本研究通過泛基因組和消減蛋白質組學從金黃色葡萄球菌核心基因組中預測了一種的新的抗菌藥物靶點酪氨酸自激酶1335， 并預測了潛在的抗菌藥物，在后續研究中將對預測化合物的抗菌活性進行實驗驗證。本研究將泛基因組學和消減蛋白質組學技術運用于抗金黃色葡萄球菌靶點的預測和開發中，有望為相關藥物的開發提供一種新思路。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：

譚錦莉參與數據整理、數據分析和論文撰寫， 黃丹、廖婧陽和朱劉沖參與數據整理和論文審閱，劉文彬參與研究項目立項、實驗設計和論文修改。

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[基金項目] 廣東省衛健委醫學科學技術研究基金項目（A2022069）；廣東省中醫藥局科研項目（20222A010010）；廣東省廣州市科技局科技計劃項目（202201010357）