miR-761 通過調控腫瘤相關巨噬細胞極化對骨肉瘤MG63 細胞上皮-間質轉化的影響

［摘 要］ 目的：分析外泌體（Exo）微小RNA-761（miR-761）通過調控腫瘤相關巨噬細胞（TAM）極化對骨肉瘤（OS）細胞上皮-間質轉化（EMT）進程的影響，闡明其相關的作用機制。方法：miR-761質粒和陰性對照（miR-NC） 質粒分別轉染至HEK239 細胞中，同時設不轉染的細胞為對照組，實時熒光定量PCR （RT-qPCR） 法檢測轉染效果。分離含miR-761 的Exo，采用透射電鏡觀察Exo 形態，采用納米顆粒分析儀檢測Exo 樣品濃度和粒徑分布，Western blotting 法檢測Exo 表面標志蛋白表達情況。采用佛波酯（PMA） 刺激人單核細胞白血病THP-1 細胞成為M0 巨噬細胞，采用含miR-761 的Exo 處理M0 巨噬細胞并與OS MG63 細胞建立共培養體系， 實驗分組為M0 組、TAM 組、miR-761NC 組和miR-761 Exo 組，收集各組M0 巨噬細胞，流式細胞術檢測各組細胞中M1 巨噬細胞標志物CD86 和M2 巨噬細胞標志物CD206 陽性率，Western blotting 法檢測各組細胞中M1 巨噬細胞分泌因子白細胞介素1β （IL-1β） 及腫瘤壞死因子α （TNF-α） 和M2 巨噬細胞分泌因子白細胞介素10 （IL-10）及轉化生長因子β1 （TGF-β1） 蛋白表達水平；采用含miR-761 的Exo 處理M0 巨噬細胞并與MG63 細胞建立共培養體系，實驗分為對照組、TAM 組、miR-NC Exo+TAM 組和miR-761 Exo+TAM 組，收集各組MG63 細胞，免疫熒光染色法觀察各組MG63 細胞中E-鈣黏附蛋白（E-cadherin） 和波形蛋白（Vimentin） 熒光強度，Western blotting 法檢測各組細胞中E-cadherin、Vimentin 及EMT 調控相關轉錄因子Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達水平，Transwell 小室實驗檢測各組MG63 細胞中侵襲和遷移細胞數。結果：通過轉染實驗成功獲得含miR-761的HEK239細胞，并分離得到Exo。與M0組比較，TAM 組巨噬細胞中CD86 陽性率降低（Plt;0. 05）， CD206 陽性率升高（Plt;0. 05）， IL-1β 和TNF-α蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF-β1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）； 與TAM 組比較，miR-761 Exo 組巨噬細胞中CD86 陽性率升高（Plt;0. 05）， CD206 陽性率降低（Plt;0. 05）， IL-1β 和TNF-α 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05），IL-10 和TGF-β1 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）。與對照組比較，TAM 組MG63 細胞中E-cadherin 熒光表達強度減弱而Vimentin 熒光表達強度增強，E-cadherin 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05），Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05），遷移細胞數和侵襲細胞數增加（Plt;0. 05）； 與 TAM 組比較， miR-761 Exo+TAM 組 MG63 細胞中E-cadherin 熒光表達強度增強而Vimentin 熒光表達強度減弱， E-cadherin 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05），Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05），遷移細胞數和侵襲細胞數減少 （Plt;0. 05）。結論：Exo傳遞miR-761能夠抑制OS細胞EMT進程，進而抑制細胞的遷移和侵襲，其作用機制可能與調控TAM 極化作用有關。

［關鍵詞］ 骨肉瘤； 微小RNA-761； 外泌體； 上皮-間質轉化； 腫瘤相關巨噬細胞極化

［中圖分類號］ R738. 1 ［文獻標志碼］ A

骨肉瘤（osteosarcoma，OS） 是常見的原發性骨惡性腫瘤，主要累及長骨的干骺端［1］。據統計，全球 OS 的新發病例約為每年每百萬人中 1～3 例［2］。雖然OS 患者通常可以采用手術和輔助化療進行治療，但由于OS 具有高度異質性，治療后易出現復發或轉移，且該部分OS 患者的5 年生存率低于20% ［3-4］。OS 的腫瘤微環境是一個復雜且高度動態的環境，由骨細胞、間充質基質細胞、血管細胞、巨噬細胞和細胞外基質等多種成分組成，OS 微環境的免疫細胞主要是腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophage，TAM），TAM 通過多種途徑促進OS 的發生和進展，并具有保護腫瘤干細胞樣表型和促進血管生成的作用［5］。上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）是腫瘤發生和轉移的初始階段，在腫瘤轉移期間，TAM 通過上調基質金屬蛋白酶水平來降解細胞外基質， 并通過激活多種信號轉導途徑來刺激EMT［6］。

微小RNA （microRNA， miRNA） 是一組短的單鏈非編碼RNA，通過與mRNA 的3'非翻譯區（3' untranslated region， 3' UTR） 結合來調節基因表達［7］。研究［8-9］ 顯示：miRNA 表達變化與OS 細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等行為有密切關聯。miR-761 位于1p2 號染色體，通過調節腫瘤相關基因表達參與腫瘤進展， 有研究［10］ 表明： miR-761通過靶向人CXC 趨化因子受體1 （C-X-Cchemokine receptor 1， CXCR1） 抑制OS 細胞增殖和侵襲，提示miR-761 在OS 中發揮腫瘤抑制因子的作用。外泌體（exosome， Exo） 是直徑為40～100 nm 的囊泡， 其產生、組成、運輸和遞送的機制已被廣泛研究， 并可作為內源性信息載體［11］。本研究通過構建Exo 傳遞miR-761 體系，探討其對OS 細胞中TAM 極化的影響， 并利用細胞共培養模型來驗證Exo 傳遞miR-761 調控TAM 極化進而介導 EMT 的機制，以期為研究以Exo 為載體遞送miRNA 靶向調節OS 細胞的生長和遷移進而減緩OS 進展提供一種新途徑。

1 材料與方法

1. 1 細胞和主要試劑

人源胚胎腎HEK239細胞、人單核細胞白血病THP-1 細胞和人OS MG63 細胞購自美國典型培養物保藏中心（American TypeCulture Collection， ATCC）。DMEM 培養基、RPMI-1640 培養基、青-鏈霉素溶液和消化用胰酶（美國Gibco 公司），胎牛血清（美國Sigma 公司），LipofectamineTM 2000 Reagent 試劑盒（美國Thermo公司）， TRIzol 試劑盒（日本TaKaRa 公司），miRNA 逆轉錄試劑盒和miRcute 增強型miRNA 熒光定量檢測試劑盒［北京天根生化科技（北京） 有限公司］， Exo 提取試劑盒（北京百奧博萊科技有限公司）， RIPA 裂解液、 增強型 ECL 試劑液、DAPI 染料和結晶紫染料（上海碧云天生物技術有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（北京凱詩源生物科技有限公司），0. 4 μm Transwell 小室和12. 0 μmTranswell 小室（美國iCell 公司）， Triton X-100（瑞士 Roche 公司）， Matrigel 膠（美國 Corning 公司）， 流式抗體 FITC-CD206 和 PE-CD86 （美 國BD 公司），兔抗人 E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 單克隆抗體、兔抗人波形蛋白（Vimentin） 單克隆抗體、兔抗人Snail 多克隆抗體、兔抗Slug 多克隆抗體、兔抗人GAPDH 多克隆抗體和Alexa Fluor 標記的山羊抗兔IgG 抗體（英國Abcam 公司），兔抗人Twist1 單克隆抗體（美國Proteintech 公司）。miR-761 質粒和陰性對照（miR-NC） 質粒由生工生物工程（上海） 股份有限公司設計構建。

1. 2 細胞培養和轉染

HEK239細胞和 MG63細胞分別接種于DMEM 培養基中，THP-1 細胞接種于RPMI-1640 培養基中， 各培養基均含有10% 胎牛血清和1% 青-鏈霉素溶液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育， 0. 25% 胰酶消化，常規傳代培養。取對數生長期HEK239 細胞，PBS 緩沖液洗滌，調整密度后按照每孔1×105 個細胞的密度接種于6 孔細胞培養板過夜培養，將miR-761 質粒和miR-NC質粒分別轉染至HEK239 細胞中，為miR-761 組和miR-NC 組，同時設未轉染的HEK239 細胞為對照組， 按照LipofectamineTM 2000 Reagent 試劑盒說明書步驟操作，采用實時熒光定量 PCR （real-timefluorescence quantitative PCR， RT-qPCR） 法檢測轉染后細胞中miR-761 表達水平，以確定轉染是否成功。

1. 3 含miR-761的Exo提取和鑒定

將轉染后的HEK239 細胞收集于無菌離心管中， 4 ℃、4 500 r·min-1 離心15 min， 獲取上清， 移至新離心管， 4 ℃ 、12 000 r·min-1 離心20 min， 獲取上清，移至另一新離心管。在上清中加入等體積提取液A，渦 旋 混 勻， 4 ℃ 靜 置 過 夜。 次 日， 4 ℃ 、12 000 r·min-1 離心60 min， 棄上清， 保留沉淀物，吸取適量保存液B 重懸沉淀物，即獲得 Exo 懸液，－20 ℃保存備用。取適量Exo，滴入載樣銅網，2%醋酸雙氧乙鈾溶液染色，雙蒸水清洗后晾干， 透射電鏡觀察Exo 形態表現。將Exo 懸液緩慢注入納米顆粒分析儀中，根據納米微粒的布朗運動成像測定樣品濃度和粒徑分布。

1. 4 RT-qPCR 法檢測HEK239 細胞中和 Exo 中miR-761表達水平

收集轉染后的 HEK239細胞，TRIzol 法提取各組細胞或Exo 樣本總RNA， 核酸微量測定儀檢測總 RNA 的濃度和純度。取A （260） /A （280） 值范圍為1. 8～2. 0 的RNA，設計特異性反轉錄引物，進行逆轉錄以合成cDNA。以U6 為內參， 定量檢測各樣本中miR-761 表達水平， 嚴格按照miRcute 增強型miRNA 熒光定量試劑盒操作， 將配制好的反應體系轉移至Bio-RadCFX96 系統內， 反應程序： 95 ℃ 起始模板變性15 min；94 ℃變性20 s、60 ℃退火延伸34 s，循環45 次。擴增結束后， 分析溶解曲線， 采用2-ΔΔCt 法計算細胞或Exo 中miR-761 表達水平。引物序列：miR-761，上游引物5'-ACAGCAGGCACAGAC- 3'，下游引物5'-GAGCAGGCTGGAGAA-3'； U6， 上游引物5'-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3'， 下游引物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1. 5 Western blotting 法 檢 測 Exo 標 志 蛋 白 和MG63細胞中相關目的蛋白表達水平

采用 RIPA蛋白裂解液提取Exo 或不同分組處理THP-1 細胞和MG63 細胞的總蛋白， BCA 法對蛋白定量。蛋白通過沸水浴變性，制備10%SDS-PAGE 凝膠，每孔上樣等量40 μg 蛋白進行垂直電泳，結束后將分離的蛋白轉移至硝酸纖維素膜，恒流轉膜2 h。用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，以兔抗CD9、CD63、CD81、腫瘤易感基因101 （tumor susceptibility gene 101，TSG101）、白細胞介素1β （interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素10 （interleukin-10， IL-10）、 轉化生長因子β1 （transforming growth factor- β1， TGF- β1）、E-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 多克隆抗體（1∶ 1 000） 作為一抗加至膜上， 4 ℃ 過夜。次日取膜復溫， TBST 洗膜， 加入對應二抗（1∶ 5 000）， 常溫孵育2 h， TBST 洗膜， 增強型ECL 液顯影， 紫外凝膠儀上進行圖像掃描， 觀察各蛋白條帶。以GAPDH 作為內參， 采用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參蛋白條帶灰度值。

1. 6 含 miR-761 的 Exo 處 理 THP-1 細 胞 及 與MG63細胞共培養體系的制備

采用THP-1細胞模擬巨噬細胞形成，將細胞按照每孔5×105個的密度接種于6 孔細胞培養板， 加入終濃度150 μg·L-1PMA 刺激 THP-1 細胞， 24 h 后得到未活化的M0 巨噬細胞。以M0 巨噬細胞為研究對象，將OSMG63 細胞按照每孔5×105 個細胞的密度接種于孔徑為0. 4 μm 的Transwell 小室上層，將不同處理的M0 巨噬細胞按照每孔5×105 個細胞的密度分別接種于細胞培養板中；二者均置于37 ℃、5%CO2 培養箱中，分開培養至細胞貼壁后，將貼有MG63 細胞的上室移至含M0 巨噬細胞的細胞培養板中，建立上下雙層細胞共培養體系［12］。實驗分為對照組、TAM 組、miR-NC Exo組和miR-761 Exo組。M0組：上室僅有培養基無MG63 細胞，下層為M0 巨噬細胞； TAM 組： 上室為MG63 細胞， 下層為M0 巨噬細胞；miR-NC Exo 組：上室為MG63 細胞，下層為含終濃度20 mg·L-1 miR-NC Exo 的M0 巨噬細胞；miR-761 Exo 組： 上室為MG63 細胞， 下層為含終濃度20 mg·L-1 miR-761 Exo 的M0 巨噬細胞。繼續培養48 h，收集各組下室細胞檢測其極化狀態。

1. 7 流式細胞術檢測各組M0巨噬細胞中CD86和CD206 陽性率

收集“1. 6”中獲得的各組下室細胞， 0. 25% 胰酶消化， PBS 緩沖液洗滌， 4 ℃、4 000 r·min-1 離心10 min 后， 4% 多聚甲醛固定；PBS 緩沖液洗滌，4 ℃、4 000 r·min-1 離心10 min，采用0. 1% Triton X-100 通透處理5 min；PBS 緩沖液洗滌， 再次離心后， 添加100 μL PBS 緩沖液重懸沉淀，加入FITC-CD206 抗體和PE-CD86 抗體，常溫避光孵育60 min，PBS 緩沖液洗滌，添加流式緩沖液重懸細胞，采用流式細胞術檢測各組M0 巨噬細胞中CD86 和CD206 陽性率，可反映巨噬細胞極化狀態。

1. 8 MG63 細胞分組和處理方法

MG63 細胞分為對照組、TAM 組、miR-NC Exo+TAM 組和miR-761 Exo+TAM 組。按照“1. 6” 中方法建立雙層細胞共培養體系： 對照組， 在孔徑為0. 4 μm的Transwell 上室接種MG63 細胞， 下室僅有培養基；TAM 組，上室接種MG63 細胞，下層細胞培養板接種M0 巨噬細胞； miR-NC Exo+TAM 組，上室接種MG63 細胞，下層細胞培養板接種含終濃度20 mg·L-1 miR-NC Exo 處理的M0 巨噬細胞；miR-761 Exo+TAM 組，上室接種MG63 細胞，下層細胞培養板接種含終濃度20 mg·L-1 miR-761Exo 處理的M0 巨噬細胞。處理結束后，收集各組MG63 細胞進行后續實驗。

1. 9 免 疫 熒 光 染 色 法 檢 測 各 組 MG63 細 胞 中E-cadherin和Vimentin熒光強度

將處理后的各組MG63 細胞接種至防脫載玻片上， 37 ℃ 、5%CO2條件下培養12 h。PBS 緩沖液洗滌，4% 多聚甲醛固定， 0. 1%Triton X-100 通透處理10 min， 采用10% 山羊血清常溫孵育 2 h， 加入稀釋的兔抗人E-cadherin 單克隆抗體（1∶ 200） 和兔抗人Vimentin 單克隆抗體（1∶200），4 ℃過夜。次日，PBS 緩沖液洗滌， 加入稀釋的Alexa Fluor 標記的山羊抗兔IgG 抗體（1∶500），常溫孵育1 h。PBS緩沖液洗滌， DAPI 避光染核， 清洗多余染料后，防淬滅封片劑封固，自然晾干，采用熒光顯微鏡觀察各組細胞中蛋白表達熒光強度。

1. 10 Transwell小室實驗檢測各組 MG63細胞中侵襲和遷移細胞數

細胞分組同上。在孔徑為12. 0 μm 的Transwell 小室上層加入適量Matrigel膠， 置于37 ℃恒溫箱內待膠凝固。0. 25% 胰酶消化處理后的MG63 細胞，按照每孔2×103個細胞的密度接種于含24 孔細胞培養板的Transwell 小室上層，下層加入500 μL 含10% 胎牛血清的DMEM 培養液。將Transwell 小室體系置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h 后取出，棄培養液，棉簽擦去上室未穿孔細胞， PBS 緩沖液洗滌， 4% 多聚甲醛固定， 0. 1% 結晶紫染色10 min， PBS 緩沖液洗滌，中性樹膠封固，自然晾干，采用光學顯微鏡觀察細胞穿過小室情況，隨機選擇6 個視野統計侵襲細胞數，結果取平均數。檢測遷移細胞數時除不在上層鋪Matrigel 膠外，其余操作均與上述方法一致。

1. 11 統計學分析

采用 GraphPad Prism 8. 30 統計軟件進行統計學分析。各組HEK239 細胞中miR-761 表達水平，各組巨噬細胞中CD86 和CD206陽性表達率及IL-1β、TNF-α、IL-10 和TGF-β1 蛋白表達水平， 各組 MG63 細胞中E-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達水平，各組MG63 細胞中侵襲和遷移細胞數均符合正態分布， 以-x±s 表示， 多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 轉染后 HEK239 細胞中 miR-761 表達水平

與 對 照 組 和 miR-NC 組 比 較， miR-761 組HEK239 細胞中miR-761 表達水平均升高（Plt;0. 05）。見圖1。

2. 2 含 miR-761的 Exo提取和鑒定結果

透射電鏡下觀察： 提取的顆粒物呈圓形或橢圓形囊泡結構， 大多徑粒分布在100 nm 左右（圖2A～2D）。Exo 標志蛋白檢測結果顯示： 轉染 miR-NC 和miR-761 的HEK239 細胞中CD9、CD63、CD81 和TSG101 蛋白表達水平均明顯低于轉染miR-NC 和miR-761 的HEK239 細胞來源Exo （圖2E）。轉染miR-761 細胞來源的Exo 中miR-761 表達水平高于轉染miR-NC 細胞來源的Exo （Plt;0. 05）（圖2F）。以上結果表明：成功分離到含miR-761 的Exo。

2. 3 各組巨噬細胞中極化相關蛋白陽性率和極化相關細胞因子蛋白表達水平

與M0組比較，TAM組巨噬細胞中M1 巨噬細胞標志物CD86 陽性率降低（Plt;0. 05）， M2 巨噬細胞標志物CD206 陽性率升高（Plt;0. 05）； 與TAM 組比較， miR-761 Exo 組細胞中CD86 陽性率升高（Plt;0. 05），CD206 陽性率降低（Plt;0. 05）， miR-NC Exo 組細胞中CD86和CD206 陽性率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖3 和表1。

與M0 組比較， TAM 組巨噬細胞中IL-1β 和TNF- α 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF-β1 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）；與TAM 組比較，miR-761 Exo 組細胞中IL-1β 和TNF-α 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）， IL-10 和TGF-β1 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05），miR-NC Exo 組上述各蛋白表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖4。

2. 4 各組 MG63細胞中 E-cadherin和 Vimentin熒光強度

與對照組比較，TAM 組 MG63 細胞中E-cadherin 熒光強度減弱，Vimentin 熒光強度增強；與TAM 組比較，miR-761 Exo+TAM 組MG63 細胞中E-cadherin 熒光強度增強，Vimentin 熒光強度減弱，miR-NC Exo+TAM 組MG63細胞中E-cadherin和Vimentin 熒光強度無明顯變化。見圖5。

2. 5 各 組 MG63 細 胞 中 E-cadherin、Vimentin、Twist1、Snail和 Slug 蛋白表達水平

與對照組比較，TAM 組MG63 細胞中E-cadherin 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05），Vimentin、Twist1、Snail 和Slug蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）； 與TAM 組比較，miR-761 Exo+TAM 組MG63 細胞中E-cadherin 蛋白表達水平升高（Plt;0. 05）， Vimentin、Twist1、Snail 和 Slug 蛋白表達水平降低（Plt;0. 05），miR-NC Exo+TAM 組MG63 細胞中上述各蛋白表達水平差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖6。

2. 6 各組 MG63細胞中侵襲和遷移細胞數

與對照組比較，TAM 組MG63 細胞中侵襲和遷移細胞數增加（Plt;0. 05）； 與 TAM 組比較， miR-761Exo+TAM 組MG63 細胞中侵襲和遷移細胞數減少（Plt;0. 05）， miR-NC Exo+TAM 組MG63 細胞中侵襲和遷移細胞數差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。見圖7 和8。

3 討 論

TAM 通過特異性分化可以進化成2 種不同的極化狀態：經典活化的M1 型和替代活化的M2 型。在腫瘤微環境中， M1 型 TAM 可由干擾素 γ（interferon-γ，IFN-γ）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 和TNF- α 等細胞因子誘導產生， M1 型TAM 表現出較強的抗原呈遞能力，具有促進輔助性T 細胞（T helper cell，Th1） 免疫反應、吞噬細菌及病毒和殺死腫瘤細胞的作用， 并分泌白細胞介素6 （interleukin-6， IL-6）、白細胞介素 23（interleukin-23， IL-23）、活性氧（reactive oxygenspecies，ROS） 及其他參與炎癥反應并發揮抗腫瘤免疫作用的炎癥介質， 進而抑制腫瘤的發生和發展［13］。在白細胞介素4 （interleukin-4，IL-4）、IL-10、白細胞介素13 （interleukin-13， IL-13） 和糖皮質激素誘導下可以促進TAM 向M2 型極化， M2 型TAM 分泌IL-10 和TGF-β1 等抗炎細胞因子，促進血管生成、組織重塑、組織損傷修復和腫瘤生長［14］。在腫瘤微環境中，TAM 主要具有M2 樣巨噬細胞的表型，通過促進腫瘤血管生成或間接誘導腫瘤微環境中免疫細胞之間的相互作用來促進腫瘤免疫抑制。已有研究［15］ 表明： M1 型TAM 抑制OS 轉移，而M2 型TAM 通過分泌相關細胞因子促進OS 轉移。TAM 極化是一種高度可塑性的生理過程，因此使用藥物或天然免疫制劑通過改變其表型甚至抑制TAM 向M2 型極化，有望成為OS 新的治療方式。

作為一種通用調節因子， miRNA 在功能上參與多種關鍵的細胞過程， 包括 TAM 極化。miR-195-5p 通過抑制結直腸癌細胞中GATA 結合蛋白3 （GATA binding protein 3， GATA3） 介導的IL-4 分泌途徑來抑制TAM 向M2 型極化，并有助于TAM 向M1 型極化，起到了抑制結直腸癌體內外生長的作用［16］； miR-498 可抑制鼠雙微體2（murine double minute 2， MDM2） 介導的轉錄激活因子3 （activating transcription factor 3， ATF3）降解，進而抑制食管癌中TAM 自噬和向M2 表型極化， 對食管癌進展起到抑制作用［17］； 巨噬細胞中的miR-182 誘導其向M2 型極化，在乳腺癌小鼠模型和巨噬細胞中敲除 miR-182 會抑制 TAM 向M2 型極化，從而抑制M2 型TAM 發揮的促腫瘤作用［18］。由于Exo 體積小、穩定性強、免疫原性低和生物相容性高等特點，已被作為納米級載體在研究中廣泛使用［19-20］。將調控TAM 極化的miRNA通過Exo 遞送至腫瘤微環境中，可影響腫瘤的生長和轉移。本研究中，采用PMA 刺激THP-1 細胞產生M0 型巨噬細胞， 并與OS MG63 細胞建立共培養體系，結果顯示：巨噬細胞中M1 巨噬細胞標志物CD86 陽性率降低， M2 巨噬細胞標志物CD206 陽性率升高， M1 巨噬細胞分泌因子IL-1β 和TNF-α蛋白表達下調， M2 巨噬細胞分泌因子 IL-10 和TGF-β1 蛋白表達上調， 表明OS MG63 細胞可誘導TAM 向M2 型極化；含miR-761 Exo 的M0 型巨噬細胞與OS MG63 細胞建立共培養體系培養后，巨噬細胞中M1 巨噬細胞標志物CD86 陽性率升高，M2 巨噬細胞標志物CD206 陽性率降低， M1 巨噬細胞分泌因子IL-1β 和TNF- α 蛋白表達上調而M2 巨噬細胞分泌因子IL-10 和TGF-β1 蛋白表達下調， 表明Exo 傳遞的miR-761 可能抑制TAM 向M2 型極化并促進TAM 向M1 型極化。

EMT 是細胞失去上皮特征并獲得間充質特性的過程，可觸發癌細胞與原發部位的解離，使癌細胞侵入鄰近組織并隨后擴散至遠處器官，有助于腫瘤惡性生物學特性， 包括細胞侵襲和轉移。研究［21］ 表明：TAM 極化參與不同類型癌癥的EMT進程調節。在三陰性乳腺癌中不僅檢測到M2 型TAM 高度浸潤， 且與患者的不良預后有關； 與M2 型 TAM 共培養的三陰性乳腺癌 BT549 和HCC1937 細胞中間充質標志物 N- 鈣黏蛋白（N-cadherin）、Vimentin 和轉錄因子Snail 表達明顯增加， 而上皮標志物E-cadherin 表達受到抑制［22］；M2 型TAM 與肝內膽管癌細胞共培養后可促進肝內膽管癌細胞的EMT，增強細胞侵襲和轉移能力；此外， M2 型TAM 通過調節細胞因子如細胞間黏附分子1 （intercellular cell adhesion molecule-1、ICAM-1）、IL-6、CC 趨化因子配體 1 （C-Cchemokine ligand 1，CCL1） 和CC 趨化因子配體3（C-C chemokine ligand 3，CCL3） 等分泌來調節肝內膽管癌微環境［23］。推測打破TAM 和EMT 之間的信號通路或串擾循環能夠對抗腫瘤轉移。本研究結果顯示： 與M0 巨噬細胞共培養的OS MG63 細胞中E-cadherin 熒光強度減弱、Vimentin 熒光強度增強， E-cadherin 蛋白表達水平下調， Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達水平上調， 侵襲和遷移細胞數均增加，表明MG63 細胞誘導TAM 向M2 型極化后促進了EMT，同時提高了細胞遷移和侵襲能力； 而與含miR-761 Exo 的M0 型巨噬細胞共培養的OS MG63 細胞中E-cadherin 熒光強度增強、Vimentin 熒光強度減弱， E-cadherin 蛋白表達水平上調而Vimentin、Twist1、Snail 和Slug 蛋白表達水平下調， 侵襲和遷移細胞數均減少， 表明Exo 傳遞的miR-761 抑制TAM 向M2 型極化及其介導的EMT，進而抑制腫瘤轉移。

綜上所述， Exo 傳遞的miR-761 能夠調節OS微環境下TAM 極化，通過抑制TAM 向M2 型極化進而抑制EMT 進程可抑制腫瘤轉移，本研究結果為OS 的臨床治療提供了新思路。但本研究只在體外進行了初步研究，關于miR-761 作用的具體機制及在體內是否發揮同樣作用尚有待進一步探討。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明：

高世磊參與實驗設計和論文撰寫， 王家強、田志超、李超和梁瀟瀟參與數據收集、數據整理和統計學分析，姚偉濤和王鑫參與實驗設計指導和論文審閱。

[參考文獻]

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[基金項目] 河南省科技廳科技發展計劃項目（222102310131）