PPC/PBS 復(fù)合生物膜的屏障功能及其對兔脛骨骨缺損模型的促成骨作用

［摘 要］ 目的：探討聚碳酸1，2-丙二酯 （PPC）/聚丁二酸丁二醇酯 （PBS） 復(fù)合生物膜在兔脛骨骨缺損模型中的空間支撐能力及其對成骨效果的影響， 闡明其屏障功能的可靠性和體內(nèi)促成骨作用。方法：制備 PPC/PBS和 PPC/PBS/Ⅰ型膠原 （Col-Ⅰ）（PPC/PBS/Co） 復(fù)合生物膜。選用18 只日本大耳白兔，于兔每側(cè)脛骨制備2 處骨缺損，隨機(jī)選擇6 只兔于骨缺損處放置PPC/PBS 復(fù)合生物膜，術(shù)后4、8 和12 周各處死2 只兔，掃描電子顯微鏡（SEM） 觀察兔骨缺損區(qū)PPC/PBS 復(fù)合生物膜表面微觀結(jié)構(gòu)。 實(shí)驗(yàn)分為空白對照組、 PPC/PBS 復(fù)合生物膜組、 BME-10X 膠原膜組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組，分別行手術(shù)將上述生物膜放置于兔相應(yīng)骨缺損處，空白對照組兔不放置復(fù)合生物膜，于術(shù)后2、4、8 和12 周時分別處死3 只兔，采用軟X 線檢測各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織灰度值，熒光標(biāo)記后采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度，采用HE 染色和改良Gomori 三色染色法觀察各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)，免疫組織化學(xué)染色法檢測各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （BMP-2） 和骨橋蛋白（OPN） 蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：大體觀察， PPC/PBS 復(fù)合生物膜緊密覆蓋于骨缺損區(qū)， 未見移位及塌陷。 SEM 觀察，PPC/PBS 復(fù)合生物膜多孔面隨時間延長表面出現(xiàn)微孔結(jié)構(gòu)并數(shù)量增多，而光滑面基本未形成微孔樣結(jié)構(gòu)。軟X 線檢測，各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織灰度值均隨時間延長而升高， 12 周時PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織灰度值明顯高于其他各組（Plt;0. 05）。共聚焦顯微鏡觀察，4、8 和 12 周時 PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度與空白對照組相近；與PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較，4 周時PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度升高（Plt;0. 05），8 和12 周時PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度降低（Plt;0. 05）。HE 染色和改良Gomori 染色，與PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較，2 和4 周時PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組和空白對照組兔骨缺損區(qū)形成新骨的速度較快，在12 周時骨缺損區(qū)形成的層板狀骨礦化程度較高。免疫組織化學(xué)染色， 2 和4 周時， 與空白對照組、PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較，PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中BMP-2 和 OPN 蛋白表達(dá)水平升高（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）； 與空白對照組和PPC/PBS 復(fù)合生物膜組比較， BME-10X 膠原膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中 BMP-2 和 OPN 蛋白表達(dá)水平均降低（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）。 結(jié)論： PPC/PBS 復(fù)合生物膜具有較好的空間支撐能力，物理屏障功能可靠，且PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜具有良好的體內(nèi)促成骨作用。

［關(guān)鍵詞］ 引導(dǎo)骨再生； 復(fù)合生物膜； 聚碳酸1，2-丙二酯； 聚丁二酸丁二醇酯； 骨缺損

［中圖分類號］ R783. 1 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

種植義齒被譽(yù)為人類的第三副牙齒，因其類似真牙的舒適感和美觀成為牙列缺損及牙列缺失修復(fù)的首選治療手段。但一部分缺牙患者因牙槽骨骨量不足或頜骨缺損無法進(jìn)行種植修復(fù)，限制了種植修復(fù)技術(shù)的開展，常需骨移植術(shù)和（或） 引導(dǎo)骨再生術(shù)（guided bone regeneration，GBR） 來解決。目前， GBR 是國內(nèi)外骨缺損再生修復(fù)的研究熱點(diǎn)之一，其原理是利用生物膜的物理屏障功能將骨缺損區(qū)與周圍組織隔離， 創(chuàng)造一個相對封閉的組織環(huán)境，從而使特定組織的再生功能得到最大程度的發(fā)揮［1-2］，其中生物膜的屏障功能和生物活性至關(guān)重要。目前，臨床應(yīng)用的生物膜仍存在一些問題［3-4］，如不可吸收性膜易引起軟組織瓣裂開、膜暴露和感染，可吸收性生物膜硬度不足易塌陷、降解過早與成骨速率不匹配和價格昂貴等， 難以滿足臨床需求。因此，研發(fā)具備良好可塑性、空間維持能力和生物活性的新型復(fù)合生物膜具有重要的臨床意義，也是目前GBR 技術(shù)的研究熱點(diǎn)。理想的GBR 生物膜應(yīng)具有一定的強(qiáng)度、韌性和生物活性。有學(xué)者［5-7］ 曾將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2 （bone morphogeneticprotein-2， BMP-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF） 和Ⅰ型膠原（collagen type Ⅰ，Col-Ⅰ） 等加入到生物膜中，使GBR 生物膜具有一定的生物活性， 目前此類研究多處于基礎(chǔ)研究階段，并且生長因子的添加提高了生物膜成本。組織中的Col-Ⅰ以膠原纖維形式發(fā)揮作用，不僅可作為支持物賦予組織張力，而且與細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、細(xì)胞增生、組織損傷修復(fù)、炎癥反應(yīng)、組織硬化和纖維化等均有密切關(guān)聯(lián)［8］。然而，關(guān)于Col-Ⅰ復(fù)合生物膜的體內(nèi)研究國內(nèi)外少有報道。為了提高本課題組在前期研究中制備的聚碳酸1， 2- 丙二酯/聚丁二酸丁二醇酯［poly（propylene carbonate） /poly （butylene succinate），PPC/PBS］ 復(fù)合生物膜的生物活性， 現(xiàn)將Col-Ⅰ與PPC/PBS 生物膜相復(fù)合，制備新型 PPC/PBS/Col-Ⅰ （Co） 復(fù)合生物膜，通過建立兔脛骨骨缺損動物模型， 評價新型PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜的屏障功能和體內(nèi)促成骨作用，為其后續(xù)研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動物、主要試劑和儀器

日本大耳白兔18 只，雌雄不限，4 月齡，體質(zhì)量2. 5～3. 0 kg，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號： SCXK- （吉） 2008-0005。PPC （數(shù)均分子質(zhì)量4. 3×104 g·mol-1）（內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙西高新技術(shù)集團(tuán)公司），PBS （數(shù)均分子質(zhì)量1. 03×105 g·mol-1）（日本Showa 公司），氯仿（天津新通精細(xì)化工有限公司），氘代氯仿（上海默克化工技術(shù)有限公司），Col-Ⅰ （吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周病科馬寧副教授惠贈），BME-10X 膠原膜（福建省博特生物科技有限公司），兔抗人BMP-2 多克隆抗體（武漢博士德生物工程公司）， 兔抗人骨橋蛋白（osteopontin，OPN） 抗體和兔抗人Col-Ⅰ蛋白抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）， SP 超敏試劑盒和DAB 顯色試劑盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。真空冷凍干燥機(jī)（ALPHAl-2 型，吉林大學(xué)酶工程實(shí)驗(yàn)室提供）， 場發(fā)射環(huán)境掃描電子顯微鏡（scanningelectron microscope， SEM）（XL30 型， 美國 FEI公司）， 多功能電子拉伸實(shí)驗(yàn)機(jī)（Zwick/Z010 型，德國Zwick 公司），GIOTTO 鉬靶軟X 線機(jī)（意大利IMS 公司），共聚焦熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

1. 2 PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜制備和表面形態(tài)及微觀結(jié)構(gòu)觀察

在前期實(shí)驗(yàn)中，將 PPC與 PBS材料按比例混合，通過鹽析法制備出PPC/PBS 復(fù)合生物膜， 將其剪切成小片（1. 7 cm×1. 7 cm），75% 酒精浸泡2 h， 蒸餾水清洗， 常溫干燥1 周，真空干燥24 h 待用。配制Col-Ⅰ溶液：Col-Ⅰ稱質(zhì)量， 加入0. 05 mol·L-1 乙酸溶液中（pH3. 2）， 得到最終質(zhì)量濃度為250 g·L-1 的Col-Ⅰ-乙酸溶液，待用。將干燥后的PPC/PBS 復(fù)合生物膜放入凍干盒中，用加樣器吸取上述Col-Ⅰ-乙酸溶液，每孔滴加800 μL，用封口膜覆蓋冰盒，?20 ℃冰箱預(yù)凍4 h，轉(zhuǎn)到凍干機(jī)中真空冷凍干燥24 h，制成凍干PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜。觀察凍干后PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜表面形態(tài)，采用SEM 觀察其表面微觀結(jié)構(gòu)，計(jì)算平均孔徑，檢測5 個標(biāo)本，取平均值。平均孔徑計(jì)算方法： 在 105 倍視野下每個標(biāo)本選取5 個400 μm×400 μm 大小區(qū)域，檢測每個區(qū)域中所有孔數(shù)目和孔徑，區(qū)域內(nèi)所有孔徑之和除以孔數(shù)目之和得到平均孔徑。

1. 3 兔脛骨骨缺損模型建立

選用18只日本長耳大白兔， 速眠新及滅菌注射用水1∶ 1 混合， 按0. 2 mL·kg-1 劑量于兔臀部肌內(nèi)注射麻醉。仰臥位固定，術(shù)區(qū)剪毛消毒。在兔脛骨近心端前緣骨嵴區(qū)切開皮膚及皮下層，直達(dá)骨嵴，鈍性分離骨膜，暴露骨面，采用渦輪機(jī)（800 r·min-1） 在脛骨外側(cè)面制備0. 6 cm×0. 6 cm 方形骨缺損， 深達(dá)骨髓腔，術(shù)中用生理鹽水冷卻。每側(cè)制備2 處缺損，每只兔共4 個缺損。術(shù)后每日1 次200 000 U·kg-1 青霉素肌注，連續(xù)給藥3 d。

1. 4 SEM 觀 察 術(shù) 后 不 同 時 間 點(diǎn) 兔 骨 缺 損 區(qū)PPC/PBS 復(fù)合生物膜表面微觀結(jié)構(gòu)

隨機(jī)選擇6 只兔， 于骨缺損區(qū)覆蓋PPC/PBS 復(fù)合生物膜，分層縫合，觀察并記錄兔的生存情況及創(chuàng)口愈合情況。分別于4、8 和12 周時處死2 只兔， 截取雙側(cè)后肢脛骨近心端，兩端超過骨缺損區(qū)。肉眼觀察標(biāo)本后，取出生物膜，梯度脫水，表面噴金，SEM 觀察PPC/PBS 復(fù)合生物膜光滑面和多孔面微觀結(jié)構(gòu)。

1. 5 動物分組和處理

對剩余12只兔的每個骨缺損區(qū)分別進(jìn)行不同分組處理。①PPC/PBS 復(fù)合生物膜組：將PPC/PBS 復(fù)合生物膜置于兔右后肢上缺 損 處； ②PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組： 將PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜置于兔右后肢下缺損處；③BME-10X 膠原膜組：將BME-10X 膠原膜置于兔左后肢上缺損處；④空白對照組：兔左后肢下缺損處未加任何生物膜，直接分層縫合。觀察各組兔的生存情況及術(shù)后創(chuàng)口愈合情況，術(shù)后2、4、8 和12 周各處死3 只兔，截取雙側(cè)后肢脛骨近心端且兩端超過骨缺損區(qū)，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1. 6 軟X線檢測各組兔骨缺損區(qū)再生骨灰度值

將2、4、8 和12 周各組兔骨缺損區(qū)的脛骨標(biāo)本用硅橡膠印模材料固定于一次性托盤內(nèi)，鉬靶軟X 線機(jī)拍攝， 拍攝參數(shù)： 32 kV， 14 mA·s-1。存儲圖像數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Image-Pro Plus 軟件，計(jì)算骨缺損區(qū)再生骨灰度值。

1. 7 激光共聚焦顯微鏡觀察各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度

實(shí)驗(yàn)結(jié)束前10 d和前3 d分別對各組兔進(jìn)行30 mg·kg-1四環(huán)素肌內(nèi)注射，標(biāo)記缺損區(qū)再生新骨。處死各組兔后，獲取骨缺損區(qū)組織塊標(biāo)本， 用硬組織切片機(jī)切成厚1. 5 mm 小塊狀標(biāo)本，采用激光共聚焦顯微鏡單一綠色熒光通道，激發(fā)波長488 nm，觀察4、8 和12 周時各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織所形成的綠色熒光強(qiáng)度。

1. 8 HE染色和改良Gomori染色觀察各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)

各組兔骨缺損區(qū)1. 5 mm×1. 5 mm 小塊狀標(biāo)本放入包埋盒，甲酸氯化鋁脫鈣7 d，梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備5 μm石蠟切片。行常規(guī)HE 染色和改良Gomori 染色，光鏡下觀察各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)。

1. 9 免疫組織化學(xué)染色法檢測各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中 BMP-2和 OPN蛋白表達(dá)水平

取 2和4 周各組兔骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行BMP-2 和OPN 免疫組織化學(xué)染色，步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，采用Image-Pro Plus 軟件計(jì)算各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織BMP-2 和OPN 染色陽性面積，以其代表蛋白表達(dá)水平。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組兔骨缺損區(qū)再生骨灰度值、熒光強(qiáng)度、BMP-2 和OPN 蛋白表達(dá)水平經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)均符合正態(tài)分布， 以x±s 表示， 兩組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，多組間樣本均數(shù)采用單因素方差分析， 組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜的制備和表面結(jié)構(gòu)

PPC/PBS/Co生物膜經(jīng)凍干后，可見Col-Ⅰ呈海綿狀，附著在PPC/PBS 復(fù)合生物膜多孔面，并伸入至孔結(jié)構(gòu)內(nèi)部，側(cè)面觀 Col-Ⅰ 和 PPC/PBS 復(fù)合生物膜界限不清。見圖1。SEM 觀察：PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜中Col-Ⅰ纖維呈薄片樣彼此相連，相連處形成網(wǎng)孔，平均孔徑約220 μm，網(wǎng)孔相互連通，斷面見Col-Ⅰ纖維伸入生物膜孔隙內(nèi)部。見圖2。

2. 2 術(shù)后不同時間點(diǎn)兔骨缺損區(qū) PPC/PBS 復(fù)合生物膜大體和微觀形態(tài)

大體觀察：術(shù)后兔雙后肢有輕度腫脹，生長狀態(tài)良好。取材時肉眼可見各創(chuàng)口均愈合良好，表面組織完整，未見感染、破潰和分泌物。骨外膜結(jié)構(gòu)完整，緊縛于PPC/PBS 復(fù)合生物膜表面，生物膜覆蓋于骨缺損區(qū)，未見移位及塌陷現(xiàn)象；4 周時，生物膜能完整取出；8 周時，骨外膜與生物膜結(jié)合十分緊密（尤其是周邊處），生物膜難以整片取出， 再生骨表面見有新生的骨膜。見圖3。SEM 觀察：PPC/PBS 復(fù)合生物膜多孔面表面出現(xiàn)微孔，并且隨時間延長微孔數(shù)目增多；光滑面在4 周內(nèi)未見明顯變化，自4 周開始表面出現(xiàn)極小顆粒脫落形成的外觀，但基本未形成微孔樣結(jié)構(gòu)。見圖4。

2. 3 各組兔術(shù)后大體觀察和骨缺損區(qū)再生骨灰度值

術(shù)后各組兔雙后肢有輕度腫脹，生長狀態(tài)良好。取材時肉眼可見各組兔創(chuàng)口均愈合良好，表面組織完整，未見感染、破潰和分泌物。軟X 線檢測結(jié)果顯示：PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組兔骨缺損區(qū)再生骨灰度值隨時間延長而逐漸升高，空白對照組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨灰度值4 周后呈現(xiàn)明顯升高趨勢。2、4 和8 周時，與PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較， PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨灰度值升高（Plt;0. 05）；12 周時，與空白對照組、PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較， PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨灰度值升高（Plt;0. 05）。見表1。

2. 4 各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度

與空白對照組比較，不同時間點(diǎn) PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義（Pgt;0. 05）；12 周時，空 白 對 照 組 和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度極低。4 周時，與空白對照組比較，PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度降低（Plt;0. 05）；與PPC/PBS復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較， PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度升高（Plt;0. 05）。8和12周時，與空白對照組比較，PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度升高（Plt;0. 05）；與PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較，PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織熒光強(qiáng)度降低（Plt;0. 05）。見圖5 和表2。

2. 5 各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織病理形態(tài)表現(xiàn)

HE 染色：隨時間延長，各組兔骨缺損區(qū)均可見新生骨小梁， 其中空白對照組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)形成的骨小梁較多，且較早形成層板狀骨。2 周時，各組兔骨缺損區(qū)形成的骨小梁周邊無明顯炎性細(xì)胞聚集， 骨小梁內(nèi)有骨細(xì)胞， 周邊有成骨細(xì)胞圍繞； 12 周時， 各組兔骨缺損區(qū)均已形成致密的層板狀骨，骨陷窩明顯，骨基質(zhì)成熟。改良Gomori 染色：隨時間延長，各組兔骨缺損區(qū)骨小梁逐漸形成，與PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和 BME-10X 膠原膜組比較， 空白對照組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)骨小梁形成速度較快，數(shù)量較多，形成層板狀骨較早，礦化程度更高。見圖6 和7。

2. 6 各組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中 BMP-2 和OPN 蛋白表達(dá)水平

2 和 4 周時，與空白對照組、PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組比較， PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中BMP-2 和OPN 蛋白表達(dá)水平均升高（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與空白對照組和PPC/PBS 復(fù)合生物膜組比較，BME-10X 膠原膜組兔骨缺損區(qū)再生骨組織中BMP-2 和OPN 蛋白表達(dá)水平均降低（Plt;0. 05 或 Plt;0. 01）。見表3。

3 討 論

本研究采用凍干法制備PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜不破壞Col-Ⅰ結(jié)構(gòu)，不引起膠原變性，很好地保存了其活性； 凍干后的Col-Ⅰ 呈海綿狀附著在PPC/PBS 復(fù)合生物膜多孔面，該海綿樣結(jié)構(gòu)與人體松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)類似，可作為支架應(yīng)用于人體，具有仿生學(xué)意義。本研究中SEM 觀察結(jié)果顯示：Col-Ⅰ纖維呈薄片樣彼此相連， 形成平均孔徑約220 μm的相互連通的孔道，孔孔相通的三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔隙率高， 不僅利于骨缺損區(qū)細(xì)胞代謝和物質(zhì)交換， 也利于材料的生物降解并可提高其生物相容性。在PPC/PBS 生物膜上復(fù)合Col-Ⅰ 也利用了膠原的骨支架作用和骨誘導(dǎo)作用。研究［9］ 表明： 骨骼中超過90% 的有機(jī)質(zhì)為Col-Ⅰ蛋白，其發(fā)揮作用的主要方式是形成和保持骨架的完整性。Col-Ⅰ支架還可募集細(xì)胞因子，使缺損區(qū)組織再生因子水平升高，利于引導(dǎo)骨再生［10］。此外，Col-Ⅰ還有信號分子作用，能調(diào)控細(xì)胞生長、分化和增殖。成骨細(xì)胞直徑約為20 μm［11］， 遠(yuǎn)小于生物膜平均孔徑， 故PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞長入，可促進(jìn)細(xì)胞在生物膜上附著和繁殖。

本研究結(jié)果顯示：在兔脛骨前嵴處作一直達(dá)骨面切口后，脛骨干骺端前外側(cè)骨膜可完整剝離，視野清晰，故選擇于脛骨前外側(cè)制備骨缺損，分層縫合后，生物膜不會隨兔運(yùn)動發(fā)生位置變化，骨缺損模型十分穩(wěn)定；此外，本研究中兔術(shù)區(qū)創(chuàng)口小，術(shù)后恢復(fù)快，可降低術(shù)后感染等并發(fā)癥風(fēng)險，減少實(shí)驗(yàn)誤差，保證了結(jié)果的可靠性。

生物膜的屏障功能是GBR 技術(shù)成功的重要保障［12］。一般認(rèn)為生物膜在體內(nèi)保存時間至少為3個月，也有學(xué)者認(rèn)為其保存時間應(yīng)與骨生理周期相符甚至更長，從而保證成骨細(xì)胞分化、增殖和上皮細(xì)胞成熟［13］。本研究結(jié)果顯示： 取材時可見兔術(shù)區(qū)骨外膜結(jié)構(gòu)完整，生物膜覆蓋于骨缺損區(qū)，未見移位和塌陷；8 周時，骨外膜與生物膜周邊結(jié)合十分緊密， 難以整片取出， 新生骨表面可見新生骨膜；SEM 觀察，PPC/PBS 復(fù)合生物膜光滑面的物理屏障功能可維持3 個月以上， 物理屏障功能可靠，而多孔面隨時間延長逐漸出現(xiàn)微孔，但生物膜整體空間變化很小。材料降解出現(xiàn)的微孔可被骨缺損區(qū)成骨細(xì)胞、基質(zhì)和血管等成骨性成分占據(jù)，便于促進(jìn)硬組織再生，保證骨質(zhì)量。

理想的GBR 生物膜除物理屏障功能外， 還應(yīng)具備生物活性，如骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性等。本研究中兔骨缺損位于脛骨近心端，其骨再生方式主要是膜內(nèi)成骨，參與成骨作用的細(xì)胞主要位于骨膜內(nèi)和骨髓腔， 結(jié)果顯示： PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)生物膜未發(fā)生明顯降解，故參與成骨作用的細(xì)胞主要來源于骨髓腔；BME-10X 膠原膜初期未發(fā)生降解，其參與成骨作用的細(xì)胞主要來源于骨髓腔，而后期逐漸降解，骨膜也逐漸參與成骨作用；空白對照組兔在整個觀察時相內(nèi)均有來源于骨膜和骨髓腔的細(xì)胞參與成骨，成骨速度最快，在促成骨作用方面PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜組與空白對照組比較無明顯差異，可能與 PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜上的 Col-Ⅰ有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示： 術(shù)后初期空白對照組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)骨小梁形成較快，鈣鹽沉積較早，而PPC/PBS 復(fù)合生物膜組和BME-10X 膠原膜組新生骨小梁較少，礦化程度較低；隨時間延長，各組兔骨缺損區(qū)骨小梁彼此聯(lián)接形成網(wǎng)狀，逐漸形成層板狀骨，礦化程度逐漸增強(qiáng)；至12 周時，空白對照組和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)層板狀骨礦化程度較高，幾乎形成完全礦化的骨基質(zhì)；PPC/PBS 復(fù)合生物膜組兔骨缺損區(qū)礦化程度較低，而BME-10X 膠原膜組兔骨缺損區(qū)礦化程度最低，未形成完全礦化的骨基質(zhì)，表明PPC/PBS 復(fù)合生物膜和PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜具有一定的生物學(xué)活性，在促骨再生方面可以與自體骨膜相媲美， 尤其是含有 Col-Ⅰ 的PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜， 其術(shù)后初期骨小梁形成及鈣鹽沉積速度更快，骨再生效果更佳。

本研究結(jié)果顯示：兔骨缺損區(qū)成骨速度差異主要表現(xiàn)在術(shù)后初期，因此選擇術(shù)后2 和4 周兔骨缺損區(qū)標(biāo)本進(jìn)行BMP-2 和OPN 染色，探討成骨速度差異的機(jī)制。成骨細(xì)胞通過分泌BMP-2 和OPN 等活性成分發(fā)揮成骨功能。BMP-2 由成骨細(xì)胞產(chǎn)生，主要與骨基質(zhì)結(jié)合，可誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞分化形成軟骨和新生骨，并誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞， 在骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bonemorphogenetic protein， BMP） 家族中其骨誘導(dǎo)活性最強(qiáng)并且能單獨(dú)異位誘導(dǎo)成骨［14］。OPN 是骨組織中主要非膠原蛋白，由成骨細(xì)胞合成和分泌，參與調(diào)節(jié)骨基質(zhì)的形成和礦化［15］。本研究中BMP-2和OPN 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果表明：PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜促成骨作用明顯， 可能與Col-Ⅰ 誘導(dǎo)BMP-2 蛋白表達(dá)水平升高有關(guān)；PPC/PBS 復(fù)合生物膜和PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜的促成骨作用與OPN 蛋白表達(dá)水平有著密切關(guān)聯(lián)， 尤其是PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜， 主要原因可能是 Col-Ⅰ 可引導(dǎo)鈣鹽沉積礦化， 而鈣鹽能促進(jìn)OPN 分泌，從而調(diào)節(jié)骨基質(zhì)的形成和礦化。與 BME-10X 膠原膜比較，本研究制備的PPC/PBS/Co 復(fù)合生物膜因多孔樣結(jié)構(gòu)更適于成骨細(xì)胞的貼附生長，表現(xiàn)出更明顯的促成骨作用。

綜上所述， 通過凍干法制備的PPC/PBS/Co復(fù)合生物膜多孔化效果良好，具有可靠的物理屏障功能和明顯的體內(nèi)促成骨作用。

利益沖突聲明：

所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：

田野和石曉璐參與文獻(xiàn)檢索、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和論文撰寫，田野參與數(shù)據(jù)收集和分析，石曉璐、翟少博、劉洋、楊征和吳毓川參與論文結(jié)果分析和討論，儲順禮參與論文寫作指導(dǎo)和論文審校。

[參考文獻(xiàn)]

［1］ ALLAN B， RUAN R， LANDAO-BASSONGA E， et al.Collagen membrane for guided bone regeneration indental and orthopedic applications［J］. Tissue EngPart A， 2021， 27（5/6）： 372-381.

［2］ KOFINA V， MONFAREDZADEH M， RAWAL S Y，et al. Patient-reported outcomes following guided boneregeneration： correlation with clinical parameters［J］.J Dent， 2023， 136： 104605.

［3］ SANZ-SáNCHEZ I ， SANZ-MARTíN I ， ORTIZVIGóNA， et al. Complications in bone-graftingprocedures： classification and management ［J］.Periodontol 2000， 2022， 88（1）： 86-102.

［4］ XIE Y， LI S H， ZHANG T X， et al. Titanium mesh forbone augmentation in oral implantology： currentapplication and progress［J］. Int J Oral Sci， 2020，12（1）： 37.

［5］ JUNG N， PARK J， PARK S H， et al. Improving boneformation by guided bone regeneration using a collagenmembrane with rhBMP-2： a novel concept［J］. J FunctBiomater， 2023，14（3）： 170.

［6］ MERAW S J， REEVE C M， LOHSE C M， et al.Treatment of peri-implant defects with combinationgrowth factor cement［J］. J Periodontol， 2000， 71（1）：8-13.

［7］ KU J K， UM I W， JUN M K， et al. Dentin-derivedbarriermembrane in guided bone regeneration： a casereport［J］. Materials， 2021， 14（9）： 2166.

［8］ LINDNER C ， ALKILDANI S ， STOJANOVIC S ，et al. In vivo biocompatibility analysis of a novel barriermembrane based on bovine dermis-derived collagen forguided bone regeneration （GBR）［J］. Membranes，2022， 12（4）： 378.

［9］ VERMA N K， KAR A K， SINGH A， et al. Controlrelease of adenosine potentiate osteogenic differentiationwithin a bone integrative EGCG-g-NOCC/collagencomposite scaffold toward guided bone regeneration in acritical-sized calvarial defect［J］. Biomacromolecules，2021， 22（7）： 3069-3083.

［10］ARPITHA M， TEWARI S， SANGWAN， et al.Efficacy of mixture of injectable-platelet-rich fibrin andtype-1 collagen particles on the closure of through-andthroughperiapical bone defects： a randomized controlledtria［l J］. Int Endod J， 2023， 56（10）： 1197-1211.

［11］閔少雄， 靳安民， 童斌輝， 等. 不同孔徑的PDLLA/HA填充材料修復(fù)長骨缺損實(shí)驗(yàn)研究［J］. 骨與關(guān)節(jié)損傷雜志， 2003， 18（8）： 542-545.

［12］JUNG O， HESSE B， STOJANOVIC S， et al.Biocompatibility analyses of HF-passivated magnesiumscrews for guided bone regeneration （GBR）［J］. Int JMol Sci， 2021， 22（22）： 12567.

［13］KIM K， SU Y C， KUCINE A J， et al. Guided boneregeneration using barrier membrane in dentalapplications［J］. ACS Biomater Sci Eng， 2023， 9（10）：5457-5478.

［14］NIU H Y， MA Y F， WU G Y， et al. Multicellularityinterweavedbone regeneration of BMP-2-loaded scaffoldwith orchestrated kinetics of resorption andosteogenesis［J］. Biomaterials， 2019， 216： 119216.

［15］ULLAH I， HUSSAIN Z， ULLAH S， et al. Anosteogenic， antibacterial， and anti-inflammatorynanocomposite hydrogel platform to accelerate bonereconstruction［J］. J Mater Chem B， 2023， 11（25）：5830-5845.

[基金項(xiàng)目] 吉林省科技廳省重點(diǎn)項(xiàng)目（20230203065SF）；吉林省教育廳科研項(xiàng)目（JJKH20231291KJ）