基于CRISPR/Cas系統的生物傳感器在動物疫病診斷中的應用

摘 要：動物疫病不僅嚴重危害動物健康，阻礙養殖業良性發展，而且對人類健康構成潛在威脅。開發靈敏、特異、快速的診斷方法對于疫病防控尤為重要。PCR是目前檢測病原體核酸的金標準，但是它存在檢測周期較長，需要精密儀器和專業技術人員，無法應用于現場即時檢測等局限性。成簇規律間隔短回文重復序列及其相關蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas）具有敏感性高、特異性強和操作簡便等優點，可為動物疫病診斷提供新的方法和契機。CRISPR-Cas9靶向核酸的特異性和CRISPR-Cas12/Cas13“附屬切割”活性使其在核酸檢測中顯示出巨大的應用前景。本文簡述了CRISPR/Cas系統的分類，對3種常用的CRISPR/Cas系統的核酸檢測策略進行系統闡述，并對其在動物疫病診斷中應用的最新研究進展進行綜述，最后討論了它的優勢、面臨的挑戰及未來發展方向，以期為動物疫病診斷新方法的開發提供參考。

關鍵詞：CRISPR/Cas；生物傳感器；動物疫病；檢測

中圖分類號：S854.43

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-2859-18

收稿日期：2023-10-26

基金項目：福建省屬公益類科研院所項目（2023R1024002；2023R1024003；2023R1078）；福建省農業科學院自由探索科技創新項目（ZYTS2023017）

作者簡介：陳秀琴（1988-），女，福建漳州人，助理研究員，博士，主要從事畜禽疫病診斷方法研究，E-mail：lyunxqchen@163.com

*通信作者：黃梅清，主要從事預防獸醫學研究，E-mail：meiqingmail@126.com

Application of CRISPR/Cas-based Biosensors for Animal Diseases Diagnosis

CHENXiuqin^1，2，LINSu^1，2，ZHANGShizhong¹，ZHENGMin^1，2，HUANGMeiqing^1，2*

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Fujian Academy of

Agricultural Science，Fuzhou350013，China; 2.Fujian Animal Diseases

Control Technology Development Center，Fuzhou350013，China）

Abstract：Animal diseases not only seriously jeopardize the health of animals and hinder the healthy development of the breeding industry，but also pose apotential threat to human health.Therefore，it is vital to develop sensitive，specific and rapid diagnostic methods for disease prevention and control.The current gold standard for pathogens detection，PCR，has limitations such as long operational cycles，high instrumentation and technician requirements，cannot be applied to point-of-care testing.Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/clustered regularly interspaced short palindromic repeats-associated protein（CRISPR/Cas）have the advantages of high sensitivity，high specificity and easy operation，which can provide anew method and opportunity for the diagnosis of animal diseases.CRISPR-Cas9specificity in targeting nucleic acids and“collateral cleavage”activity of CRISPR-Cas12/Cas13show significant promise in nucleic acid detection.In this review，the classification of CRISPR/Cas systems，the strategies adopted by three commonly used CRISPR/Cas systems applied to nucleic acid detection were summarized，as well as the latest research progress of their application in animal disease diagnosis，finally their advantages，challenges，and future development were analyzed，in the hope of providing areference for the application of CRISPR/Cas biosensing platforms in animal diseases diagnosis.

Key words：CRISPR/Cas; biosensor; animal diseases; detection

*Corresponding author：HUANG Meiqing，E-mail：meiqingmail@126.com

盡管人類在預防和控制動物疫病方面取得了顯著的成就，但是新發現的或重新出現的人獸共患病仍然對人類和動物健康構成巨大威脅。值得注意的是，超過四分之三的新出現的人獸共患病原體源自野生動物^[1]。尤其是全球各地不斷出現極端天氣，不僅嚴重影響農業生產，而且將對傳染病的起源、分布和傳播產生深遠影響^[2]。最近幾年提出的同一健康（One health）理念更加突顯動物疫病防控對人類健康的重要性。靈敏、特異、快速地診斷動物疫病是疫病防控的重要措施。通過檢測核酸來識別病原體是疫病診斷的關鍵策略。基于核酸擴增的分子生物學技術具有特異性強、敏感性高等優點，在疫病診斷和預防中發揮了重要作用^[3]。PCR是第一個并且仍然是應用最廣泛的一種核酸擴增技術，但是它存在檢測周期長，高度依賴精密儀器和專業技術人員的弊端，無法應用于基層動物疫病監測，也不能滿足現場即時檢測（point-of-care testing，POCT）的需求，此外，敏感性和特異性也有待提高^[4]。自20世紀90年代初以來，各種核酸等溫擴增技術已被開發出來作為PCR的替代技術。其中，重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）和環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是最常用的兩種，它們可以在恒溫下快速有效地擴增靶標核酸，速度比PCR快，對儀器的依賴程度低^[5]。然而，RPA和LAMP都存在非特異性擴增，尤其是LAMP的引物設計復雜，反應溫度較高（60～65℃），限制了其在POCT中的應用^[5-6]。此外，核酸等溫擴增技術也無法區分單核苷酸多態性（single-nucleotide polymorphisms，SNPs），而這些微小的核苷酸差異對于病原體檢測和疾病診斷都至關重要^[6-7]。最近發現的成簇規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/CRISPR相關蛋白（CRISPR-associated protein，Cas）為解決這些問題開辟了一條新途徑。基于CRISPR/Cas系統的核酸檢測生物傳感器具有敏感性高、特異性強、反應溫度溫和（最佳溫度為37℃）的優點^[8]。此外，CRISPR試劑也可以冷凍干燥，從而克服了對冷藏設施和溫控運輸的要求^[9-10]。利用智能手機應用程序來關聯信號輸出，并且可以上傳和處理數據^[11-12]。因此，CRISPR/Cas系統是一種更適用于POCT的新型核酸檢測工具，在動物疫病診斷領域具有廣闊的應用前景。目前，已經發表了數篇關于CRISPR/Cas系統在核酸檢測中應用的綜述文章^[13-16]，但是它們只綜述了CRISPR/Cas系統在人獸共患病原微生物（病毒和細菌）核酸檢測中的應用或者重點介紹檢測策略，并沒有詳細闡述CRISPR/Cas系統在動物病原體核酸檢測中的應用。本文首先介紹了CRISPR/Cas系統的分類，回顧了基于CRISPR/Cas系統的核酸檢測策略，概述了其在動物病原體核酸檢測中的最新研究進展，最后討論了其在動物疫病診斷中面臨的挑戰，以期為動物疫病診斷新方法的研發提供參考依據。

1 CRISPR/Cas系統概述

CRISPR/Cas是原核生物中重要的適應性免疫系統，用于防御噬菌體或其他外來核酸的入侵^[17]。該系統利用CRISPR基因座中編碼的引導RNA（guide RNA，gRNA）序列來引導Cas核酸內切酶活性來識別和切割特定的外源核酸序列^[18]。CRISPR/Cas系統存在于不同的細菌和古細菌中，它們的組成和作用機制各不相同。根據進化關系，CRISPR/Cas系統可分為兩個大類和六個小類，第一大類系統為多效應蛋白復合體，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型，應用較少；第二大類系統為單一效應蛋白，包括Ⅱ型（Cas9核酸酶）和Ⅴ型（Cas12和Cas14核酸酶）以及Ⅵ型（Cas13核酸酶）^[18]。第二大類CRISPR系統中的Cas蛋白的特征概述如表1所示。由于第二大類系統的高效性和簡便性，已經廣泛應用于基因組編輯^[19]、基因表達調節^[20]以及核酸檢測^[10，21-22]等。

2 CRISPR/Cas系統檢測核酸的策略

CRISPR/Cas系統對靶標序列的特異性識別為核酸檢測提供了獨特的優勢，特別是Cas9和Cas12a對靶標DNA的特異性識別以及Cas13a對靶標RNA的特異性識別。CRISPR/Cas系統檢測核酸的信號輸出方式包括熒光^[22]、比色^[23]、電化學^[24]和生物發光^[25]等。Cas9、Cas12a和Cas13a是研究最多且應用最廣泛的效應蛋白，下面將對利用這三種效應蛋白構建的經典核酸生物傳感平臺進行介紹。

2.1 基于CRISPR/Cas9系統的生物傳感器用于檢測核酸的策略

CRISPR/Cas9是第一個被研究的CRISPR/Cas系統，最開始是作為一種基因編輯工具，近年的研究發現通過對Cas9改造產生不同的變體具有不同的生物特性，因而可用于構建檢測核酸的生物傳感器。這些檢測方法主要是利用Cas9的三種特性：切割特性^[22]、特異性識別能力^[25-26]或切口酶活性^[27]，對應的Cas效應器的類型分別為Cas9、dCas9（deactivated Cas9）和Cas9n（Cas9nickase）。

2.1.1 Cas9介導的生物傳感器用于檢測核酸

Cas9介導的生物傳感器檢測核酸的機制是RNA引導的Cas9的DNA切割，即靶標被酶切以啟動檢測或輸出序列被剪切并作為終點讀取信號^[28]。CRISPR/Cas9以嚴格依賴原間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的方式特異性識別靶標，然后在PAM上游的第三個堿基處斷開雙鏈^[29]。因此，CRISPR/Cas9可用于區分位于PAM區域的單堿基錯配。例如，Huang等^[22]利用Cas9的切割特性結合指數式擴增反應（exponential amplification reaction，EXPAR），成功構建出Cas-EXPAR的核酸檢測體系。其檢測核酸的原理如圖1A所示，小向導RNA（small guide RNA，sgRNA）首先與Cas9結合形成活化的Cas9/sgRNA復合物，當體系中存在PAM序列的寡核苷酸（PAM-presenting oligonucleotide，PAMmer）時，Cas9/sgRNA復合物對靶標的特定位點進行切割；接著下游的EXPAR系統利用這些切割產物作為其自身的引物并啟動等溫擴增，產生大量雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）片段，這些dsDNA被缺口內切酶切開，形成的裂解片段進入下一個循環放大反應中，從而形成循環擴增過程。這些片段可以與SYBR Green I熒光染料結合用于熒光信號讀取。該方法應用于檢測產單核細胞李氏桿菌，1h內即能完成對靶標DNA的檢測，敏感性高達0.82×10^-18mol·L^-1），且具有單堿基分辨率。與多數聯合擴增技術與CRISPR/Cas技術所構建的生物傳感平臺不同的是，該項研究首先進行信號轉導，再進行信號擴增，不需要額外添加引物，從而避免了非特異性擴增。

與Cas-EXPAR需要復雜設備相比，CASLFA方法通過將Cas9檢測集成到側流層析中，是一種可視化、快速和現場部署的策略^[30]。在該方案中，首先是基于聚腺嘌呤（A）-Au親和標記的設計一條AuNP-DNA探針，使用生物素化引物進行RPA或PCR生成可以被Cas9/sgRNA特異性識別的生物素化擴增子，形成三元復合物。當滴到側流裝置上時，這些三元復合物橫向流動并與AuNP-DNA探針雜交，AuNP-DNA探針再與sgRNA的環區域結合，從而形成四重復合物，并被測試線上預包被的鏈霉親和素捕獲，而過量的AuNP-DNA探針則向前擴散并最終通過固定的捕獲探針累積在對照線上，通過顯色指示是否存在靶標DNA（圖1B）。將CASLFA方法應用于檢測產單核細胞李氏桿菌、非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）和轉基因生物，檢測限為數百個基因組拷貝數，并具有良好的特異性。

2.1.2 dCas9介導的生物傳感器用于檢測核酸

通過對Cas9的兩個核酸酶結構域進行突變，獲得失去核酸酶活性的Cas9（dCas9）。dCas9保留了特異性識別dsDNA的功能而無切割活性，通過在dCas9上融合其它功能蛋白，可構建檢測核酸的生物傳感平臺。其檢測機制是RNA引導的dCas9結合DNA，將酶或熒光或顯色化合物轉運至所需位置以進行檢測。一個典型的例子是Zhang等^[26]提出一種配對dCas9報告系統來選擇性檢測dsDNA。在該系統中，通過將一對dCas9蛋白與螢火蟲熒光素酶N端和C端的一半融合，在sgRNA的引導下特異性地識別結合靶標DNA相鄰的兩個區域，使得它們相互接近并整合成完整的熒光素酶，恢復其催化生物發光的活性，從而實現對結核分枝桿菌的高靈敏（～50×10^-12mol·L^-1）和高特異檢測（圖1C）。受這項研究的啟發，van der Veer等^[25]采用更亮、更小、更穩定的分裂NanoLuc熒光素酶開發了一個更靈敏的生物發光核酸傳感平臺。該平臺與RPA結合，無需繁瑣的RNA提取步驟，單管檢測二型嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus2，SARS-CoV-2）RNA的敏感性達到1×10^-18mol·L^-1，整個過程在20min內完成。

2.1.3 Cas9n介導的生物傳感器用于檢測核酸

RNA引導的Cas9切口酶曾用于基因編輯^[31]，通過充分挖掘其特性，發現其也可以用于構建核酸檢測平臺。其檢測機制是Cas9n/sgRNA復合物解開螺旋，形成一個由DNA-RNA雜合體和單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA）組成的R環，該ssDNA可以被切口酶活性切割，從而從Cas9n蛋白的靶標容納槽中釋放出來，產生游離的3′末端^[32]。例如，Zhou等^[27]開發的基于CRISPR/Cas9觸發切口核酸內切酶介導的鏈置換擴增方法（CRISPR-Cas9-triggered nicking endonuclease-mediated strand displacement amplification，CRISDA）。CRISDA的檢測原理如圖1D所示，以帶有HNH催化殘基突變的化膿性桿菌Cas9作為模型。首先，設計一對sgRNAs用于識別靶標DNA并在兩條非靶標鏈中誘導一對切口（步驟1）。隨后，引入一對引物（IP_UPS/DNS）來啟動SDA反應并與非靶標鏈雜交（步驟2）。每個IP引物均包含5′Nb.BbvCI核酸內切酶切口位點，與暴露的非靶標鏈互補的中間雜交區域以及與非靶標鏈雙鏈區域互補的3′突出端。加入SDA混合物后，DNA聚合酶（Klenow片段3′→5′exo-，KF）在ssDNA結合蛋白TP32的輔助下沿著非靶標鏈延伸IP引物。同時，暴露的非靶標鏈也被DNA聚合酶從Cas9誘導的切口位點延伸至退火IP引物的5′端，產生雙鏈Nb.BbvCI核酸內切酶切口位點。此外，Nb.BbvCI切口酶、KF外切聚合酶和ssDNA結合蛋白共同作用，沿著靶標DNA到Cas9反向的結合位點進行線性鏈置換反應，生成Strand-Fo和Strand-Rev（步驟3）。然后，上述兩種產物分別與IP引物退火反應，進一步誘導靶標序列的鏈置換擴增，得到產物1～3（步驟4）。最后，使用針對擴增子中間區域的生物素和Cy5標記肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）探針，通過磁性吸附和熒光測量實現定量檢測靶標DNA（步驟5）。雖然CRISDA是一種具有創新性的核酸檢測策略，但是它只能區分PAM區域中的SNPs，而且所用到的試劑復雜，需要設計外源引物，這些將限制其進一步推廣應用。

盡管CRISPR/Cas9系統可用于核酸檢測，但是它在核酸檢測的應用遠不如CRISPR/Cas12a系統和CRISPR/Cas13a系統廣泛。原因包括以下三點：第一，Cas9不具有反式切割活性；第二，Cas9的結合、切割和切口誘導的解旋活動無法僅通過Cas蛋白的輕松轉換實現信號輸出^[33]；第三，Cas9是單周轉酶，因此檢測靈敏度取決于核酸預擴增^[34]或探針^[35]和檢測器^[36]的效率，而Cas12和Cas13是多周轉酶，反式裂解效率非常高，更容易開發出高靈敏度且無需核酸擴增的檢測方法^[37-38]。

2.2 基于CRISPR/Cas12a系統的生物傳感器的核酸檢測策略

Cas12a蛋白也稱為Cpf1蛋白，是Ⅴ型第二大類CRISPR/Cas系統的效應蛋白。不同于Cas9，Cas12a的PAM更偏好5′-（T）TTN-3′，并且具有“附屬切割活性”。Cas12a能夠在crRNA的引導下特異性切割靶標dsDNA，并在切割完成后繼續切割周圍的非靶標DNA，釋放標記在ssDNA上的熒光基團，產生熒光信號^[21]。利用Cas12a的這種特性開發出來的經典分子診斷平臺術主要有HOLMES（an one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）^[40]和DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）^[16]。HOLMES的檢測原理是利用PCR技術對靶標DNA進行預擴增，當反應體系中存在靶標DNA，Cas12a/crRNA二元復合物與靶標DNA形成三元復合物，然后激活CRISPR/Cas12a的非特異性反式切割活性，快速切割兩端分別修飾熒光分子和淬滅分子的ssDNA，進而將dsDNA信號以熒光信號的方式進行放大。該檢測平臺靈敏度可達到1×10^-18mol·L^-1，并且能鑒定SNPs。此外，通過逆轉錄，HOLMES也能實現RNA檢測。盡管HOLMES的用途廣泛，但是它的預擴增步驟不是采用等溫擴增技術，這不僅增加了操作難度也不適用于POCT。Doudna團隊構建的DETECTR分子診斷平臺則是采用等溫擴增技術（RPA）與Cas12a相結合，實現了恒溫檢測核酸，同樣具有檢測SNPs的能力。其檢測核酸的原理與HOLMES相似^[21]。

2.3 基于CRISPR/Cas13a系統的生物傳感器的核酸檢測策略

Cas13a蛋白又稱為C2c2蛋白，是Ⅵ型第二大類CRISPR/Cas系統的效應蛋白。與CRISPR/Cas9和CRISPR/Cas12a系統不同的是，CRISPR/Cas13系統是一種RNA引導的靶向切割ssRNA的系統，由Cas13和crRNA組成^[41]。此外，Cas13a不依賴于PAM位點，而是通過一個類似于PAM位點的側翼位點（protospacer flanking site，PFS）與ssRNA互補結合^[41]。與Cas12a相同，Cas13a也具有反式切割活性，利用Cas13a的這種特性開發出來的第一個經典分子診斷技術是SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）^[10]。其檢測原理是：Cas13a在crRNA的引導下與靶RNA序列結合，并在互補位置外的PFS附近切割靶標RNA，激活Cas13a的反式切割活性，對周圍的ssRNA進行非特性切割。該檢測平臺可用于檢測DNA或RNA，具有單堿基分辨率。此外，SHERLOCK所需的反應試劑可以凍干保存，不依賴于冷鏈，適合現場檢測和資源匱乏地區檢測^[10]。在SHERLOCK基礎上升級的SHERLOCKv2檢測平臺則是使用4種不同來源的核酸酶（LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）和4種不同熒光基團（FAM、TEX、Cy5和HEX）標記的探針來實現同時檢測4種病毒，敏感性達到2×10^-18mol·L^-1；其次，將探針改為一端修飾熒光分子另一端修飾生物素的報告探針可開發為側向流試紙條^[42]。為使SHERLOCK和SHERLOCKv2兩個檢測平臺更方便用于POCT，張鋒團隊^[43]提出了一種快速釋放病毒核酸的方式—HUDSON（heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases），通過加熱和化學還原來簡化滅活病毒并獲得病毒核酸，適用的樣品類型包括血液、唾液和尿液。總之，SHERLOCK和SHERLOCKv2提供了多功能、快速、便攜式和經濟高效的核酸檢測平臺，這對于流行病監測和病原檢測至關重要。

Cas9蛋白是研究最多的CRISPR蛋白，它很容易與其它技術結合衍生出多種檢測方法，但是它需要對樣品進行特殊標記以讀取結果，相比較于Cas12蛋白和Cas13蛋白，它的檢測敏感性更低，檢測時間更長。而基于CRISPR/Cas12的核酸檢測方法具有高靈敏度和強特異性的優點，對樣品的要求較低，簡單的樣品處理即可用于下游檢測。但是它靶向核酸時需要PAM，優化單管檢測的過程復雜。CRISPR/Cas12特別適用于DNA和SNP檢測。Cas13不受PAM序列限制，檢測靶標核酸的范圍更廣，但是對樣品的要求較高，優化過程較困難。

3 CRISPR/Cas系統在動物疫病診斷中的應用

基于CRISPR/Cas的檢測方法具有敏感性高、單堿基分辨率的特異性和可編程性的特點，已經廣泛應用于臨床診斷、食品安全、環境監測等領域，但是在動物疫病診斷領域仍然處于初步發展階段。下面作者將按照病原體的類型介紹CRISPR/Cas系統在動物疫病診斷中的應用。

3.1 在病毒性疫病診斷中的應用

近年來，基于CRISPR/Cas系統的生物傳感器不斷被開發用于檢測烈性病毒性傳染病，如，非洲豬瘟（African swine fever，ASF）和禽流感。ASF是由ASFV感染引起的一種出血性傳染病，被世界動物衛生組織（World Organisation for Animal Health，WOAH）列為法定上報傳染病。ASF給養豬業造成嚴重經濟損失，目前尚無商業疫苗或有效治療方法。ASFV是一種大型而復雜的雙股DNA病毒，在環境中非常穩定^[44]。因此，早期準確診斷是快速控制疫情的有效方法。Yang等^[45]將LAMP與CRISPR/Cas12a系統結合建立了單管檢測ASFV的LAMP-CRISPR方法，該方法的檢測限可以達到每個反應7copies·μL^-1的p72基因，與其它的豬DNA或RNA病毒不存在交叉反應，并且與實時熒光PCR（real-time fluorescent PCR，RT-PCR）方法具有良好的一致性。但是LAMP的最佳反應溫度為60～65℃，需要借助加熱器才能啟動反應，因此，LAMP-CRISPR方法不適用于POCT。開發便攜式裝置是實現POCT的一種有效策略。He等^[46]基于CRISPR/Cas12a系統構建了一種無需核酸預擴增的POCT方法，檢測限達到1pmol·L^-1，更重要的是，他們開發了便攜式激光器和微型光譜儀用于CRISPR/Cas12a系統的熒光信號讀取，這套裝置的檢測靈敏度比市售熒光計高約100倍，而且價格更低廉，實現了簡便、經濟且高通量地檢測ASFV，適用于資源欠發達地區。試紙條是一種無需實驗室設備即可判定結果的簡易便攜裝置，具有操作簡便，結果易解讀，成本低廉，能夠在幾分鐘內獲得檢測結果的優點，是提高CRISPR/Cas生物傳感器的便攜性和實用性的主要設備之一。例如，將構建的CASLFA核酸檢測方法應用于ASFV檢測，檢測限為200個病毒基因組DNA；在非實驗室環境中評估其檢測性能，成功從110份疑似豬血清樣本中檢測到27份ASFV感染樣本，與RT-PCR方法相比，準確度為100%，從樣品到結果的時間不到40min。CASLFA方法的特點是將Cas9特異識別靶標的特異與LFA結合，解決了常規LFA的假陽性信號和繁瑣且低效的雜交步驟^[30]。

自2017年Gootenberg等^[9]基于CRISPR/Cas13a系統搭建以熒光信號方式輸出的核酸檢測平臺以來，基于CRISPR/Cas系統構建的生物傳感器普遍采用熒光信號讀取方式。雖然這種信號輸出方式具有特異性高、檢測快速的優點，但是也存在熒光修飾成本高、熒光易淬滅、熒光光譜相互干擾等局限性^[47-48]。以比色的方式讀取信號具有簡單、低成本、易于使用、結果可視化的優點，十分適用于POCT。例如，Ki等^[23]將CRISPR/Cas12a靶標識別系統與基于脲酶的級聯反應誘導的吸光度變化方法相結合，開發出一種基于雙酶擴增的比色傳感平臺并用于ASFV檢測。該方法不需要核酸預擴增，檢測敏感性即能達到50pmol·L^-1，且具有良好的特異性，具有檢測快速、操作簡便、結果可視化的優點。

高致病性禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是一種可以引起人獸共患病的病原，由其引發的禽流感疫情可導致禽類大量死亡，具有重要的公共衛生意義。AIV的快速高靈敏檢測對于科學應對高致病性禽流感、有效地控制病毒的擴散和傳播等方面有著重要的意義。常規的AIV檢測包括病毒分離鑒定、血清學方法和分子生物學方法，這些方法適用于不同的場景，但是在敏感性、特異性和現場檢測方面無法同時滿足要求。因此，迫切需要開發檢測快速、敏感性高且可靠的檢測方法，而采用基于CRISPR/Cas系統的生物傳感器進行檢測具有巨大潛力。例如，楊芷翊等^[49]采用RT-RPA技術與CRISPR/Cas13a系統，建立一種高靈敏度且強特異性的H5亞型AIV核酸檢測的熒光生物傳感器。該方法檢測靈敏度可達1copies·μL^-1，檢測臨床樣品的特異性為100%，敏感性為95%，檢測結果與RT-PCR的符合率為98.2%，從核酸提取到獲得檢測結果的時間為80min。但是該方法的熒光信號讀取仍然使用精密儀器，不利于現場檢測。電化學是CRISPR/Cas系統另一種重要的信號轉導方式。電化學生物傳感器具有信號響應快速、靈敏度高的特點，并且與光學裝置相比，其配套設備簡單、成本低廉、便于攜帶^[50]。因此，電化學生物傳感器用于現場診斷的前景廣闊。例如，Wan等^[51]基于雜交鏈式反應擴增和CRISPR/Cas13a系統成功構建了一種檢測H7N9AIV的電化學生物傳感器。該項研究創新性地將分層花狀納米金結構修飾在碳電極上，這種修飾方式可以增加電極的比表面積，以有效負載探針DNA，并提高電子轉移能力，從而增強電化學響應。基于這種巧妙的設計方案，該生物傳感器檢測H7N9AIV的檢測限度低至5.8×10^-17mol·L^-1，并且具有良好的特異性和重復性。化學發光是另一種CRISPR/Cas生物傳感器的信號轉導方式，廣泛應用于生物分析領域。Xu等^[52]基于免疫磁珠和CRISPR/Cas13a系統成功構建了一種化學發光生物傳感器，用于檢測H7N9AIV的檢測限度低至1.97×10^-14mol·L^-1，在30min內即可完成檢測。此外，這種化學發光生物傳感器克服了CRISPR熒光背景高的問題，可應用于臨床大規模篩查，在病毒檢測顯示出巨大的應用潛力。更多基于CRISPR/Cas系統在病毒性疫病診斷中的應用如表2所示^[24，53-62]。

3.2 在細菌及真菌性疫病診斷中的應用

由細菌感染引起的食源性疾病是全世界重大的公共衛生問題。世界衛生組織估計，每年有6億例病例、超過42萬例死亡與食源性疾病相關^[63]。其中許多病例都是由細菌感染引起，主要包括沙門菌屬、彎曲桿菌屬、致病性大腸桿菌和霍亂弧菌^[63]。此外，這些細菌也是重要的人畜共患病原菌。從農場到餐桌的整個食品供應鏈需要多個環節，而畜禽生產是食品供應鏈的源頭，畜禽產品攜帶病原菌將帶來巨大的食品安全隱患。目前，細菌的傳統檢測方法是基于微生物培養和生化測試，這種方法雖然檢測結果可靠，但是檢測周期非常長。基于PCR的核酸分析方法需要精密的儀器和專業技術人員，而且敏感性和特異性仍然有待提高。為保障人和動物的健康，仍然亟待開發檢測快速、操作簡便、敏感性高的新型檢測方法。

CRISPR/Cas系統與試紙條結合可以實現快速、可視化且便攜檢測病原的目的。例如，Wang等^[64]基于Cas9切口酶觸發的等溫DNA擴增結合側流試紙條開發了一種同時檢測鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的檢測方法。該方法具有較高的靶標特異性和敏感性（基因組DNA檢測限低至100copies，細菌檢測限低至100CFU·mL^-1），從樣品制備到讀數的檢測時間約為3h。通過PCR擴增沙門菌屬的fimA基因，結合CRISPR/Cas9系統開發了一種檢測沙門菌的方法，結果通過側流試紙條即可肉眼判定，檢測牛奶中沙門菌的檢測限低至102CFU·mL^-1，甚至可與某些qPCR和數字PCR方法相媲美。該方法為病原檢測提供了一種方便且低成本的現場檢測策略。大多數基于CRISPR/Cas系統的電化學生物傳感器需要將報告分子固定在電極表面，這不僅操作復雜、耗時，而且重復性差。不僅如此，報告分子固定在電極表面所產生的空間位阻也會影響Cas蛋白切割的效率和電子傳導速率，這勢必會影響檢測結果的準確性^[65]。Dong等^[66]設計了一種基于FAM和亞甲基藍（MB）的電化學信號探針，它不需要固定在電極表面，而是依賴于FAM-RNA-MB的水解來實現MB的電化學信號變化。將FAM-RNA-MB探針應用于CRISPR/Cas13a系統，實現了電化學、熒光和直接肉眼觀察三種信號的響應。該方法在25min內即可完成檢測，檢測限為1×10^-12mol·L^-1；配合他們團隊自主研發的多室微流控芯片和便攜式電化學儀器，可在50min內實現對鼠疫桿菌（Y.pestis）、弗朗西斯土拉桿菌（F.tularensis）、鸚鵡熱衣原體（C.psittaci）、鼻疽伯克霍爾德菌（B．mallei）、類鼻疽伯克霍爾德菌（B.pseudomallei）、羊種布魯氏菌（B.melitensis）六種病原體的同時檢測。多數用于檢測病原的CRISPR/Cas生物傳感器都需要核酸擴增，這可能會引起污染從而導致假陽性結果。Wei等^[67]結合適體和Cas14a1蛋白的優點開發出能鑒別死或活的金黃色葡萄球菌的檢測系統。該檢測方法具有較高的特異性、敏感性（檢測限為400CFU·mL^-1）和準確度（從血液樣本中100%檢測出），無需核酸提取或擴增步驟。該生物傳感器包含兩個功能元件。一個元件是用于特異性結合金黃色葡萄球菌細胞的適體，另一個元件是用于激活Cas14a1/sgRNA的阻斷劑。適體和阻斷劑可以在沒有金黃色葡萄球菌的情況下形成雜合雙鏈DNA（Hy-dsDNA）。此時，被適體抑制的阻斷劑無法激活Cas14a1/sgRNA復合物。添加活金黃色葡萄球菌后，適體與細菌結合，導致Hy-dsDNA釋放阻斷劑。釋放的阻斷劑隨后與Cas14a1/sgRNA形成三元復合物，裂解標記有熒光基團和淬滅基團的ssDNA，從而產生強烈的熒光信號。而混合死金黃色葡萄球菌和Hy-dsDNA不會釋放阻斷劑。因此該檢測方法可以區分活細菌和死細菌。但是這項研究也有局限性，不僅檢出限高于其它基于CRISPR/Cas的方法，而且檢測時間很長（約150min），這些在一定程度上限制了其在POCT的應用。更多基于CRISPR/Cas系統在細菌及真菌性疫病診斷中的應用如表3所示^{[64-65，68-80]}。

3.3 在寄生蟲病診斷中的應用

隨著養殖場的不斷規模化和集約化，許多畜禽寄生蟲病已經取得較好的防控效果，但是仍然有一些寄生蟲嚴重危害畜牧養殖業的安全生產，甚至危害人類公共衛生健康。建立快速、敏感的檢測方法對于防控寄生蟲病流行與傳播具有重要意義。目前，檢測寄生蟲的方法大致可以分為三類，第一，形態學方法。這種方法目前仍然是動物寄生蟲病診斷的主要手段和“金標準”，但是依賴專業技術人員，而且無法鑒定到具體的蟲種；第二，血清學檢測方法。由于寄生蟲的抗原成分相對復雜，敏感且特異的血清學方法目前為數不多，多見于陸生動物血液寄生蟲病^[81]。第三，核酸檢測方法。基于CRISPR/Cas的檢測方法被認為是下一代的分子診斷工具，目前也逐漸應用于寄生蟲檢測。

利什曼病，又稱黑熱病，是由專性細胞內寄生蟲利什曼原蟲引起的一種人畜共患病。該病可通過雌性白蛉攜帶者的叮咬傳播到哺乳動物，主要包括人類、犬科動物和嚙齒動物^[82]。早期診斷對于防控利什曼病至關重要。已報道的基于CRISPR/Cas的熒光生物傳感器通常使用共價標記的ssDNA作為報告分子，這顯著增加了檢測成本。為了解決這個問題，Gao等^[83]使用G-四鏈體DNAzyme作為CRISPR/Cas12a的報告分子，構建出一種敏感且無需標記的方法用于檢測杜氏利什曼原蟲，并進一步將該方法用于分析感染杜氏利什曼原蟲的小鼠。結果顯示，該方法可以檢測低至3.1條的利什曼原蟲，在低劑量接種杜氏利什曼原蟲約2周，該方法即能從小鼠脾中檢測到，比病原學分析提前了近2周。此外，與常規的熒光ssDNA報告分子相比，使用G-四鏈體DNAzyme作為報告分子可將檢測靈敏度提高5倍，而且更經濟。將dCas9與RPA耦合可以實現靈敏的即時檢測，Bengtson等^[84]利用該策略等溫檢測利什曼原蟲屬，敏感性為1×10^-21mol·L^-1，更重要的是，通過使用緩沖液即可從尿液和血液樣本中提取DNA，直接通過比色讀取結果，能滿足各種感染性疾病的即時診斷需求。

隱孢子蟲是一種常見的食源性寄生蟲，被世界衛生組織視為監測糞-口污染的水質控制的病原體之一，同時也是導致嚴重胃腸道疾病的主要病原體之一^[85]。由于其危害嚴重，且感染劑量極低（lt;10個卵囊），因此，開發高靈敏且操作簡便的檢測方法具有重要意義。Li等^[86]基于CRISPR/Cas12a構建出一種用于檢測隱孢子蟲的免疫傳感方法，該方法通過抗體-DNA耦合物將基于抗體的識別與基于CRISPR/Cas12a的熒光信號放大結合起來，能夠檢測4μm大小的隱孢子蟲卵囊，線性范圍為6.25～1600個卵囊·mL^-1，無需額外的核酸擴增即能從每份樣本中檢測到單個卵囊，并且能應用于檢測污水中的隱孢子蟲。這種直接靶向抗原的方法不僅節省了核酸提取的時間，而且避免了核酸提取過程中靶標的丟失或污染。基于CRISPR系統的生物傳感器除了用于檢測原蟲，還可以用于檢測蠕蟲。例如，Macgregor等^[87]將RPA與CRISPR/Cas13a檢測相結合建立了檢測日本血吸蟲和曼氏血吸蟲的方法，檢測結果可以通過熒光或比色兩種方式讀取。將該方法應用于檢測感染血吸蟲小鼠的糞便/血清樣本以及從菲律賓日本血吸蟲流行區和烏干達曼氏血吸蟲流行區采集的人糞便/血清樣本，結果表明，該方法與金標準qPCR方法的檢測符合率達到93%～100%，用于檢測曼氏血吸蟲顯示出比qPCR方法更高的敏感性，并且使用便攜式加熱塊即可實現即時檢測。更多基于CRISPR/Cas系統在寄生蟲病診斷中的應用如表4所示^[88-93]。

4 CRISPR/Cas系統應用于動物疫病診斷所面臨的挑戰

相較于傳統的核酸檢測技術，基于CRISPR/Cas的核酸檢測方法應用于病原體檢測具有以下優勢（表5）：1）特異性更強，敏感性更高。2）檢測快速，操作相對簡單，適用于POCT的應用場景。3）結果讀取方式多樣。基于CRISPR/Cas系統的生物傳感器的信號輸出模式包括熒光、比色、生物發光、電化學、側流層析試紙條等，能滿足現場、經濟、高通量檢測等各種需求。4）相應的試劑允許冷凍干燥保存，方便攜帶和使用。但是，CRISPR/Cas檢測技術應用于動物疫病診斷仍然面臨挑戰。首先，樣品核酸提取大多依賴商品試劑盒，不僅延長了檢測周期，而且難以真正實現POCT；其次，為了提高CRISPR系統的檢測敏感性，采用與核酸等溫擴增技術聯用的兩步法增加了操作難度及氣溶膠污染的風險^[94]。第三，由于試劑混合引起的敏感性降低，潛在的脫靶檢測以及高度依賴用于信號生成的標簽，CRISPR介導的多重檢測能力受到限制^[33]。此外，基于CRISPR/Cas的生物傳感平臺普遍無法定量檢測，也無法檢測未知病原體。最后，檢測成本仍然較高，現場即時檢測核酸也存在挑戰。相比較于RT-PCR方法，基于CRISPR/Cas的核酸方法的檢測成本更高^[95]。

理想的核酸檢測方法應該是成本低、特異性強、快速、便攜、易于操作。為了達到這些目標，基于CRISPR/Cas的核酸檢測方法可以在以下幾方面改進。1）簡化樣品處理以滿足POCT的需求。通過使用化學試劑或加熱等方式快速裂解病原已被證明可行^[43，96]。此外，需要選擇合適的Cas效應蛋白。目前，（d）Cas9和Cas12a可用于檢測未純化的樣品，但是Cas13a由于易受核糖核酸酶的干擾，難以應用于未經處理的復雜樣品。2）將核酸等溫擴增步驟與CRISPR/Cas檢測體系集成到單管反應或開發無需預擴增的檢測方法。實現單管反應可采取的策略包括試劑的空間隔離^[97-98]，優化緩沖液或采用次優PAM位點以削弱CRISPR反應^[99]或通過光照射來控制CRISPR反應^[100]。沒有靶標的預擴增過程無疑會降低檢測敏感性，使得臨床診斷面臨挑戰。可以采取的策略包括以下幾種：通過設計新型crRNA或使用化學增強劑來增強CRISPR的反式切割活性^[101-102]；多個CRISPR系統聯用以實現信號增強^[42]；多個crRNA組合^[103]；使用納米材料（例如二硫化鉬納米片）來完全淬滅熒光團的熒光，從而降低背景噪音^[104]；采用超靈敏的信號讀取技術，例如，表面增強拉曼光譜和場效應晶體管^[105]。3）開發能定量、多靶標檢測的傳感平臺。例如，使用多種Cas效應蛋白，微流控平臺，不同的熒光染料或酶標記報告分子等策略均可實現多重檢測^[42，65]。其中，通過空間隔離的微流控平臺最有發展前景。此外，納米材料在CRISPR/Cas系統的應用也使多重檢測成為可能^[106]。4）降低檢測成本可以從以下幾方面入手：a.使用化學試劑或加熱等方式替代核酸提取試劑盒。b.開發無需預擴增且靈敏的檢測方法。目前開發的基于CRISPR/Cas系統的檢測方法普遍采用RPA擴增靶標序列以提高檢測敏感性，而RPA試劑盒成本是總成本的最重要的組成部分，開發免擴增方法可節省大部分的檢測成本。c.開發更廉價的探針。經典的CRISPR/Cas系統使用的熒光探針是在ssDNA的5′端使用有機染料作為熒光基團，并在3′端修飾淬滅基團，這種雙標記的ssDNA探針成本高。本課題組用二硫化鉬納米片作為淬滅劑替代雙標記ssDNA探針的熒光基團可將檢測成本降低97.3%，在不使用RPA試劑盒的情況下，每個反應的檢測成本只需1.44元^[104]。d.使用普通且便攜的設備讀取信號。例如，使用便攜式的藍光切膠儀讀取熒光信號不僅節約成本，而且滿足現場即時可視化檢測的需求。

CRISPR/Cas系統是一種可用于POCT的新型診斷工具，為了實現現場即時可視化檢測核酸，可以從以下幾方面入手。首先，簡化從樣品中獲取核酸的過程，其次，開發或改進便攜式的設備。由于從開發再轉化為商業上可行的設備需要相當長的時間，將現有的設備用于其它用途的檢測是一種更為可取的策略。例如，CRISPR/Cas系統的轉導信號通過個人血糖儀^[107]、妊娠試紙條^[53]和體溫計^[108]讀取。最后，采用可視化的信號讀取方式。熒光、比色和側向流免疫層析是更適用于動物疫病診斷的信號讀取方式。

5 問題與展望

CRISPR/Cas系統具有高度的靈活性、高敏感性和序列特異性、單堿基分辨率的生物學特性，因而被開發用于生物醫學、食品安全和環境監測等領域。CRISPR/Cas系統的可編程性使其不僅可以用于檢測核酸，通過改變crRNA序列，利用功能性核酸（如DNAzyme和適體）、抗體和細菌變構轉錄因子實現核酸和非核酸靶標的轉換，同樣可實現蛋白質^[109]、小分子^[110]、金屬離子^[111]等的快速檢測。值得一提的是，基于CRISPR/Cas系統的檢測試劑盒已經被開發用于人類健康領域。例如，Sherlock CRISPR SARS-CoV-2試劑盒和DETECTR試劑盒被批準用于檢測SARS-CoV-2病毒，國內也有兩家公司生產的CRISPR試劑盒獲得國家藥品監督管理局批準用于檢測SARS-CoV-2病毒。雖然CRISPR/Cas系統在病原體核酸檢測領域已經取得一定的突破，但是該技術在動物疫病診斷中的應用尚處于起步階段，仍然存在許多問題亟待解決。首先，檢測成本高限制了其在經濟動物的廣泛應用，但是在寵物和珍稀動物疫病診斷中仍然具有較大的應用潛力；其次，核酸提取普遍依賴商品試劑盒，不僅檢測時間長，而且增加了檢測成本；最后，基于CRISPR/Cas系統的檢測方法普遍無法實現定量和多重檢測。

在未來，通過進一步簡化樣品處理過程，開發便攜式儀器，采用凍干、納米載體和水凝膠儲存CRISPR相關試劑將能極大提升核酸現場即時檢測水平；讀取的數據通過手機應用程序的5G服務轉換到云端進行存儲和處理，將有助于構建快速、準確、智能的早期預警系統。總之，盡管仍然有很大的改進空間，但相信未來通過將生物工程、納米材料和人工智能等學科技術與CRISPR/Cas系統相融合，基于CRISPR/Cas的核酸檢測方法將實現更快速、低成本、現場即時檢測、多重定量檢測，成為更強大的動物疫病診斷工具。

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（編輯 白永平）