北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)及成脂誘導(dǎo)分化研究

摘 要：旨在建立北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)及成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系，為研究豬脂肪沉積的分子機(jī)制提供試驗(yàn)材料，為生物培育肉的制備提供技術(shù)指導(dǎo)。本研究采集1頭7日齡健康的北京黑豬公豬的頸部皮下脂肪組織，使用機(jī)械法聯(lián)合I型膠原酶消化法分離脂肪前體細(xì)胞。對獲得的脂肪前體細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察、生長曲線繪制、免疫熒光鑒定、成脂誘導(dǎo)分化、油紅O染色、BODIPY染色、甘油三酯含量測定及使用實(shí)時熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測成脂分化相關(guān)基因的表達(dá)。結(jié)果表明，分離的北京黑豬脂肪前體細(xì)胞貼壁后呈長梭形，細(xì)胞生長曲線呈S型。免疫熒光結(jié)果表明，PREF1表達(dá)為陽性，表明分離的細(xì)胞的確為脂肪前體細(xì)胞。在相同的誘導(dǎo)試劑組合條件下，使用10%FBS比2%FBS成脂誘導(dǎo)分化效果更好。在相同血清濃度的情況下，雞尾酒法與油酸鈉、羅格列酮共同聯(lián)用的細(xì)胞分化效果較好。分化8d的細(xì)胞中出現(xiàn)大量的脂滴，脂滴經(jīng)油紅O染色呈紅色，經(jīng)BODIPY染色呈綠色。且分化8d的細(xì)胞中甘油三酯的含量顯著升高（Plt;0.001）。qPCR結(jié)果顯示，PPARγ、CEBPα、ACCα、LPL、SCD和FABP4在分化2d時表達(dá)量均顯著升高（Plt;0.05），4～6d達(dá)到高峰，8d時表達(dá)量降低。Western blot結(jié)果表明，PPARγ、CEBPα、FABP4、APN在細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸上調(diào)。PREF1在細(xì)胞分化過程中表達(dá)逐漸下調(diào)。在三維培養(yǎng)情況下，使用10%FBS，雞尾酒法與油酸鈉、羅格列酮共同聯(lián)用也能使脂肪前體細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞，分化8d的細(xì)胞中脂滴經(jīng)BODIPY和油紅O染色后分別呈綠色和紅色，且PPARγ、CEBPα、ACCα、LPL、SCD和FABP4在分化8d的細(xì)胞中的表達(dá)量顯著上調(diào)（Plt;0.001）。綜上所述，本研究成功建立了北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的分離與培養(yǎng)體系，并篩選出適合二維和三維培養(yǎng)的成脂誘導(dǎo)分化方法，為進(jìn)一步研究豬脂肪沉積的分子機(jī)制和改善肉品質(zhì)奠定基礎(chǔ)，也為細(xì)胞培育肉的制備提供技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：北京黑豬；脂肪前體細(xì)胞；成脂誘導(dǎo)分化；成熟脂肪細(xì)胞；三維培養(yǎng)；細(xì)胞培育肉

中圖分類號：S828.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-2877-13

收稿日期：2024-01-05

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2021YFC2101404）；中國工程院戰(zhàn)略研究與咨詢項(xiàng)目（2023-XZ-79）

作者簡介：梁小娟（1989-），女，河南開封人，博士，高級工程師，主要從事動物遺傳育種與繁殖研究，E-mail：xyskylxj8907@163.com

*通信作者：王守偉，主要從事細(xì)胞培育肉研究，E-mail：cmrcwsw@126.com

Isolation，Culture and Adipogenic Differentiation of Beijing Black Pig Preadipocytes

LIANGXiaojuan，LIYushuang，LIYingying，WANGShouwei^*

（China Meat Food Research Center，Beijing Institute of Food Science，Beijing100068，China）

Abstract：The study aimed to establish the system for the isolation，culture and adipogenic differentiation of Beijing Black pig preadipocytes，to provide experimental materials for studying the molecular mechanism of fat deposition in pigs，and technical guidance for the preparation of cultured meat.The neck subcutaneous fat of ahealthy7-day-old male Beijing Black pig was collected，and preadipocytes were isolated using mechanical method combined with type Icollagenase digestion.The obtained preadipocytes were subjected to morphological observation，growth curve drawing，immunofluorescence identification，adipogenic differentiation，Oil Red Ostaining，BODIPY staining，triacylglycerol content determination，and detection of the expression of adipogenic differentiation-related genes using real-time quantitative PCR and Western blot techniques.The results showed that the isolated Beijing Black pig preadipocytes were spindle-shaped after adherence and the cell growth curve showed Stype.The immunofluorescence results showed that PREF1was positive，indicating that the isolated cells were indeed preadipocytes.Under the same combination of induction reagents，10%FBS exhibited abetter adipogenic differentiation effect than2%FBS.Under the same serum concentration，the combined use of the cocktail with sodium oleate and rosiglitazone displayed abetter differentiation effect.A large number of lipid droplets appeared in cells differentiated for8days，and the lipid droplets became red after Oil Red Ostaining and green after BODIPY staining.Moreover，the triacylglycerol content in cells differentiated for8days was significantly increased（Plt;0.001）.The qPCR results showed that the expression of PPARγ，CEBPα，ACCα，LPL，SCD，and FABP4were all significantly increased after2days of differentiation（Plt;0.05），reached apeak at4-6days，and decreased at8days.The Western blot results showed that the expression of PPARγ，CEBPα，F(xiàn)ABP4，and APN gradually increased during cell differentiation.Expression of PREF1gradually decreased during cell differentiation.Under three-dimensional culture condition，the combination use of10%FBS，the cocktail，sodium oleate and rosiglitazone could also induce preadipocytes into mature adipocytes.The lipid droplets in cells differentiated for8days became green and red after BODIPY and Oil Red Ostaining，respectively，and the expression levels of PPARγ，CEBPα，ACCα，LPL，SCD，and FABP4in cells differentiated for8days increased significantly compared with the control group（Plt;0.001）.In summary，this study successfully established an isolation and culture system for Beijing Black pig preadipocytes and screened out adipogenic differentiation methods suitable for two-dimensional and three-dimensional culture，laying afoundation for further studying the molecular mechanism of fat deposition in pigs and improving meat quality，and also providing technical guidance for the preparation of cultured meat.

Key words：Beijing Black pig; preadipocytes; adipogenic differentiation; mature adipocytes; three-dimensional culture; cultured meat

*Corresponding author：WANG Shouwei，E-mail：cmrcwsw@126.com

脂肪組織在人和動物體內(nèi)與能量代謝密切相關(guān)，除了儲存能量，還具有內(nèi)分泌功能。脂肪組織過度堆積可導(dǎo)致肥胖、脂肪肝和其他脂肪代謝相關(guān)疾病，而脂肪組織萎縮也會對人體的健康產(chǎn)生負(fù)面影響。畜禽體內(nèi)的脂肪含量與肉品質(zhì)密切相關(guān)。因此，了解脂肪組織的代謝機(jī)制對于人類健康、畜禽肉產(chǎn)量和肉品質(zhì)至關(guān)重要。在研究脂肪代謝機(jī)制時，通常將脂肪前體細(xì)胞的體外增殖和分化試驗(yàn)作為研究基礎(chǔ)。

近年來，細(xì)胞培育肉作為一種替代蛋白備受關(guān)注，它可以滿足未來的肉類需求，同時解決傳統(tǒng)畜牧業(yè)帶來的挑戰(zhàn)^[1-2]。細(xì)胞培育肉的制備過程包括從動物身上獲取種子細(xì)胞，進(jìn)行體外增殖和分化、然后結(jié)合3D打印技術(shù)塑形，制成替代傳統(tǒng)肉類的產(chǎn)品^[3-5]。常用的細(xì)胞培育肉種子細(xì)胞包括骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞和脂肪前體細(xì)胞^[6-8]。動物脂肪含量直接影響肉品質(zhì)，因此，脂肪細(xì)胞分化在細(xì)胞培育肉制備過程中至關(guān)重要^[9]。

脂肪前體細(xì)胞原代培養(yǎng)體系已在牛^[10-12]、豬^[13-19]、羊^[20-23]等家畜中成功建立。目前，分離的脂肪前體細(xì)胞主要來自皮下脂肪^{[14，17，22]}和肌內(nèi)脂肪^{[12-13，16，18，20-21]}。脂肪前體細(xì)胞是成熟脂肪細(xì)胞的前體，能夠增殖并分化為成熟的脂肪細(xì)胞。脂肪細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的生物過程，伴隨著細(xì)胞形態(tài)和基因表達(dá)的變化，該過程受一系列轉(zhuǎn)錄因子的精細(xì)調(diào)控。脂肪細(xì)胞分化的標(biāo)志是脂滴（lipid droplet，LD）的產(chǎn)生，脂滴主要由甘油三酯（triacylglycerol，TAG）和膽固醇酯組成。目前，常用的成脂誘導(dǎo)分化方法是經(jīng)典的雞尾酒法（cocktail），包括胰島素（insulin，INS）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）和地塞米松（dexamethasone，DEX）。此外，羅格列酮（rosiglitazone，RSG）作為PPARγ的激活劑，也常用于提高脂肪細(xì)胞分化效率^[19]。油酸（oleic acid，OA）作為禽類脂肪前體細(xì)胞分化必須的外源脂肪酸^[24]，近年來也用于牛的脂肪前體細(xì)胞分化^[25-26]。盡管脂肪前體細(xì)胞分化的方法有所改進(jìn)，但仍存在分化效率低和不穩(wěn)定等問題。因此，優(yōu)化分化條件以提高成脂分化效率是進(jìn)一步的研究重點(diǎn)。

北京黑豬是中國優(yōu)良的黑豬品種，具有理想的體形，鮮嫩的肉質(zhì)和較強(qiáng)的抗病能力^[27-28]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了試驗(yàn)方案，分離培養(yǎng)了北京黑豬脂肪前體細(xì)胞，建立了一套適合細(xì)胞體外二維和三維培養(yǎng)的成脂分化技術(shù)，將脂肪前體細(xì)胞高效分化為成熟脂肪細(xì)胞。這為解析豬脂肪沉積的分子機(jī)制提供了材料，也為細(xì)胞培育肉的制備提供了技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動物

1頭7日齡健康無病的北京黑豬公豬。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

熒光倒置顯微鏡、3D FloTrix^?miniSPIN FLEX4通道生物反應(yīng)器、高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)、羅氏LightCycler480II實(shí)時熒光定量PCR儀、化學(xué)發(fā)光儀等。

1.1.3 主要化學(xué)試劑

DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶（solarbio）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）（gibco）；INS（macgene）、DEX、IBMX、RSG、油酸鈉（sodium oleate，NaOL）（sigma）；10%PAGE凝膠制備試劑盒、蛋白酶抑制劑（epizyme）；RIPA裂解液、油紅O染色試劑盒（beyotime）；3D TableTrix^?微載體（cytoniche）；BODIPY（glpbio）；ECL化學(xué)發(fā)光液（meilunbio）；PREF1、APN、FABP4、PPARγ、CEBPα、TUBB、ACTB抗體（proteintech）；HPR標(biāo)記山羊抗兔二抗、HPR標(biāo)記山羊抗鼠二抗、ABflo^?594-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）二抗（abclonal）；RNA抽提試劑盒（promega）；cDNA制備試劑盒、SYBR試劑（novoprotein）；TAG測定試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（applygen）。

1.2 方法

1.2.1 北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)

將北京黑豬麻醉后處死，用75%酒精進(jìn)行全身消毒，轉(zhuǎn)移至生物安全柜，取出頸部皮下脂肪組織。用75%酒精漂洗1次，然后轉(zhuǎn)移到PBS漂洗3次。將脂肪組織轉(zhuǎn)移至離心管中，剪成1mm³大小的碎塊。加入5倍體積2mg·mL^-1的I型膠原酶，37℃消化60min。加入等體積含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基終止消化。將組織消化液經(jīng)100μm孔徑細(xì)胞篩過濾，1000r·min^-1離心8min，棄上清。加入紅細(xì)胞裂解液，室溫裂解10min。再次以1000r·min^-1離心8min，棄上清。最后，加入含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2d更換1次完全培養(yǎng)基。細(xì)胞生長至匯合度80%時，進(jìn)行消化傳代。將細(xì)胞按2×10⁴個·孔^-1接種至12孔培養(yǎng)板。接種當(dāng)天記為0d，每2d進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，繪制脂肪前體細(xì)胞增殖曲線。

1.2.2 北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的免疫熒光鑒定

將細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板。次日，去除培養(yǎng)基，用PBS洗3次；加入4%PFA固定15min，PBS洗3次；使用0.1%TritonX-100使細(xì)胞通透15min，PBS洗3次，用0.2%BSA封閉60min。棄去封閉液，加入PREF1一抗（1∶100），4℃孵育過夜，PBS洗3次，加入熒光二抗（1∶100），室溫孵育1h，PBS洗3次，加入2μg·mL^-1的DAPI避光染色5min，PBS洗3次，熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化

脂肪前體細(xì)胞長滿后，繼續(xù)培養(yǎng)2d，加入誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基（表1）培養(yǎng)2d，再換成維持分化培養(yǎng)基（表1）繼續(xù)培養(yǎng)2d，之后，換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4d，每2d換1次培養(yǎng)基。表1中誘導(dǎo)試劑的最終濃度分別為胰島素（INS）5μg·mL^-1，地塞米松（DEX）0.4μg·mL^-1，IBMX0.5mmol·L^-1，羅格列酮（RSG）1μmol·L^-1，油酸鈉（NaOL）150μmol·L^-1。

1.2.4 北京黑豬脂肪細(xì)胞的染色

選擇第6組分化方案，分別對分化0d和分化8d的脂肪細(xì)胞進(jìn)行油紅O染色和BODIPY染色。棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗1遍；加入4%PFA固定10min；PBS洗2次；然后進(jìn)行如下操作：1）油紅O染色：加入染色洗滌液浸泡20s；棄掉洗滌液，加入油紅O染色液，避光染色15min；棄掉油紅O染色液，加入染色洗滌液浸泡30 s；棄掉洗滌液，然后加入PBS，顯微鏡下觀察并拍照。2）BODIPY染色：加入含有5μmol·L^-1BODIPY和2μg·mL^-1DAPI染液對脂滴和細(xì)胞核避光染色10min; 棄掉染色液，PBS洗3次，然后使用熒光倒置顯微鏡觀察并拍照。對于三維培養(yǎng)的細(xì)胞染色操作過程中的棄上清的步驟，是通過離心或者靜置將微載體連同細(xì)胞沉降至離心管底部，再棄掉上清。三維培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)BODIPY染色后使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析系統(tǒng)拍照。

1.2.5 細(xì)胞TAG含量的測定

利用TAG測定試劑盒對分化0d和8d的脂肪細(xì)胞進(jìn)行TAG含量測定。具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，以每毫克蛋白濃度校正甘油三酯含量。

1.2.6 細(xì)胞總RNA抽提和cDNA合成

使用普洛麥格RNA抽提試劑盒提取分化0、2、4、6和8d的RNA。對于三維培養(yǎng)的細(xì)胞，微載體在細(xì)胞裂解之后通過離心或者靜置自動沉降至離心管底部去除微載體。取1μg RNA進(jìn)行cDNA合成，具體反應(yīng)體系：2×NovoScript plus1^st Strand cDNA Synthesis SuperMix10μL、RNA1μg、gRNA Purge1μL，使用無RNA酶水補(bǔ)充體系至20μL。反應(yīng)程序：50℃孵育15min，85℃孵育5s。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA稀釋10倍放置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 熒光定量PCR

采用NCBI網(wǎng)頁中的pick primer設(shè)計qPCR的特異性引物（表2），18S rRNA作為看家基因，使用羅氏LightCycler480II進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。反應(yīng)體系為20μL：2×NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus10μL，濃度為10μmol·L^-1的上下游引物各0.5μL，模板cDNA2μL，ddH₂O7μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性1min；然后95℃變性20s、60℃退火20s及72 ℃延伸30s，共40個循環(huán)。采用2^-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。

1.2.8 細(xì)胞總蛋白提取及Western blot

將細(xì)胞用PBS洗1次，加入RIPA裂解液，冰浴10min，用細(xì)胞刮刮取細(xì)胞，并收集裂解物。然后，4℃，12000r·min^-1離心30min，取上清液，上清液即細(xì)胞蛋白。將蛋白變性后上樣于SDS-PAGE，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜；用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，加入一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入二抗，室溫孵育40min，TBST洗3次。加入ECL發(fā)光液顯色，將膜置于化學(xué)發(fā)光儀中拍照并保存。

1.2.9 三維培養(yǎng)條件下豬脂肪前體細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化

將100mL培養(yǎng)基、10片微載體片和1×10⁶細(xì)胞接種至體積為125mL的轉(zhuǎn)瓶中。將轉(zhuǎn)瓶置于生物反應(yīng)器設(shè)備上，轉(zhuǎn)速依次設(shè)置為25r·min^-1，持續(xù)10min；0r·min^-1，持續(xù)50min，共循環(huán)24次，隨后轉(zhuǎn)速調(diào)整為30r·min^-1，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。待細(xì)胞貼壁長滿后，繼續(xù)培養(yǎng)2d。加入第6組成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)2d，然后加入第6組維持分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)2d。之后使用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4d，每2d更換1次培養(yǎng)基。

1.2.10 統(tǒng)計分析

用GraphPad Prism Version8統(tǒng)計軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)分析。結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。以Plt;0.05為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，*Plt;0.05，**Plt;0.01，***Plt;0.001。

2 結(jié) 果

2.1 北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定

在本研究中，使用機(jī)械法結(jié)合I型膠原酶消化法分離北京黑豬脂肪前體細(xì)胞，并將其接種至培養(yǎng)皿進(jìn)行原代培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，大部分細(xì)胞貼壁，且形態(tài)為不規(guī)則的長梭狀（圖1A）。細(xì)胞消化傳代后，通過每2d細(xì)胞計數(shù)的方法測定脂肪前體細(xì)胞的生長曲線。從圖1B可以看出，北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的生長曲線呈經(jīng)典的“S”型，細(xì)胞在貼壁后0～4天生長較為緩慢，而在4～8天生長速度加快，之后由于生長空間受限制，在第8天達(dá)到平臺期，符合細(xì)胞的生長規(guī)律。鑒于PREF1作為脂肪前體細(xì)胞特異性表達(dá)蛋白可以用于脂肪前體細(xì)胞的鑒定。因此，本研究將細(xì)胞接種至24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞生長至70%左右，使用PREF1抗體進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色以鑒定脂肪前體細(xì)胞。結(jié)果如圖1C所示：幾乎所有細(xì)胞均表達(dá)PREF1蛋白，即PREF1陽性。這表明成功分離了北京黑豬脂肪前體細(xì)胞。

2.2 北京黑豬脂肪前體細(xì)胞的成脂誘導(dǎo)分化

本研究基于已報道的幾種成脂誘導(dǎo)分化試劑（INS、DEX、IBMX、NaOL、RSG）進(jìn)行不同組合聯(lián)用誘導(dǎo)北京黑豬脂肪前體細(xì)胞成脂誘導(dǎo)分化。以下將雞尾酒法（INS、DEX和IBMX組合）簡寫為cocktail。本研究共探索了8組脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化方法（表1）。結(jié)果如圖2所示，在相同的誘導(dǎo)試劑組合條件下，使用10%FBS比2%FBS成脂誘導(dǎo)分化效果更好。在相同血清濃度的情況下，cocktail、NaOL、RSG共同聯(lián)用的細(xì)胞分化效果較好。通過對誘導(dǎo)試劑聯(lián)用和不同血清濃度的比較，可以判斷出第6組（成脂誘導(dǎo)分化液：DMEM+cocktail+NaOL+RSG+10%FBS，維持分化液：DMEM+INS+NaOL+RSG+10%FBS）的分化效果是最佳的。

2.3 北京黑豬脂肪細(xì)胞的染色及TAG含量測定

油紅O是一種脂溶性染料，特異性地對細(xì)胞內(nèi)TAG等中性脂肪著色。BODIPY是一種近紅外的短波長熒光染料，能特異性地作用于中性脂質(zhì)組成的脂滴。本研究采用油紅O和BODIPY染色兩種方法對使用第6組分化方案分化0和8d的細(xì)胞進(jìn)行了染色。結(jié)果如圖3A所示，分化0d的細(xì)胞均未被油紅O和BODIPY著色。而對于分化8d的細(xì)胞未染色時，脂肪細(xì)胞中的脂滴呈圓泡狀，染色后，細(xì)胞中的脂滴被油紅O染成鮮紅色，被BODIPY染成綠色。這表明脂肪前體細(xì)胞成功分化為成熟的脂肪細(xì)胞。此外，本研究對分化0和8d細(xì)胞中的TAG含量進(jìn)行了檢測，結(jié)果如圖3B所示：與分化0d相比，分化8d細(xì)胞中的TAG含量顯著升高（Plt;0.001）。

2.4 北京黑豬脂肪細(xì)胞分化不同時期分化相關(guān)基因的表達(dá)

本研究收集了使用第6組分化方案分化0、2、4、6和8d的脂肪細(xì)胞，提取RNA和蛋白，利用qPCR和Western blot技術(shù)從mRNA和蛋白水平檢測了分化相關(guān)基因在分化不同時期的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示：過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPα）、乙酰輔酶A羧化酶α（acetyl-CoA carboxylase alpha，ACCα）、硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）、脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（fatty acid binding protein4，F(xiàn)ABP4）在誘導(dǎo)分化2d時均顯著上調(diào)（Plt;0.05），在4～6d達(dá)到高峰，8d時表達(dá)水平降低（圖4A）。Western blot顯示前脂肪細(xì)胞因子-1（preadipocyte factor-1，PREF1）從分化2d開始表達(dá)量逐步降低，在分化8d的細(xì)胞中表達(dá)量非常低，與預(yù)期結(jié)果一致。而分化標(biāo)記蛋白脂聯(lián)素（adiponectin，APN）、FABP4、PPARγ、CEBPα的表達(dá)隨著分化時間的增加表達(dá)量逐步增強(qiáng)（圖4B）。以上結(jié)果從分子層面表明了北京黑豬脂肪前體細(xì)胞成功分化為成熟脂肪細(xì)胞。

2.5 北京黑豬脂肪前體細(xì)胞三維培養(yǎng)及成脂誘導(dǎo)分化

細(xì)胞的三維培養(yǎng)比傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)更接近體內(nèi)生理環(huán)境。因此，本研究將篩選的適合二維培養(yǎng)的第6組分化方案應(yīng)用于三維培養(yǎng)中。并對三維培養(yǎng)條件下分化8d的細(xì)胞進(jìn)行了BODIPY和DAPI染色（圖5A）和油紅O染色（圖5B），結(jié)果分別顯示有大量的綠色和紅色信號的產(chǎn)生，即脂滴的生成，說明細(xì)胞由脂肪前體細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞（圖5A和5B）。此外，收集分化0和8d的細(xì)胞RNA，利用qPCR技術(shù)檢測分化0和8d的脂肪細(xì)胞中分化相關(guān)基因PPARγ、CEBPα、SCD、ACCα、LPL和FABP4的表達(dá)。結(jié)果顯示，與分化0d相比，這些基因在分化8d脂肪細(xì)胞中的表達(dá)均顯著上調(diào)（Plt;0.001）（圖5C）。這進(jìn)一步從分子層面說明，在三維培養(yǎng)條件下，脂肪細(xì)胞由脂肪前體細(xì)胞分化為成熟的脂肪細(xì)胞。以上結(jié)果表明，本研究的第6組成脂誘導(dǎo)分化方案也適用于三維培養(yǎng)。

3 討 論

在人和動物體內(nèi)，脂肪組織扮演著存儲能量和內(nèi)分泌等重要角色。過度脂肪堆積可能導(dǎo)致肥胖和代謝相關(guān)疾病的發(fā)生。此外，畜禽的脂肪含量直接影響動物的經(jīng)濟(jì)特性和肉品質(zhì)。細(xì)胞培育肉是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)肉制品的方法，無需傳統(tǒng)畜牧業(yè)的過程^[29-30]。細(xì)胞培育肉的生產(chǎn)過程包括種子細(xì)胞的獲取、細(xì)胞支架的制備、細(xì)胞高效增殖與分化，以及3D打印塑形等。然而，這項(xiàng)技術(shù)仍面臨巨大挑戰(zhàn)^[31]。脂肪含量是影響肉類食品口感和風(fēng)味的重要因素^[32]。因此，獲取脂肪種子細(xì)胞，并在體外實(shí)現(xiàn)其高效增殖與分化對于脂肪細(xì)胞培育肉的制備至關(guān)重要。同時，脂肪前體細(xì)胞的體外增殖與分化也是研究脂肪發(fā)育的體外理想模型，為深入探究動物脂肪沉積機(jī)理提供了寶貴材料和數(shù)據(jù)。

原代脂肪前體細(xì)胞獲取方法主要包括膠原酶消化法^[33-35]和組織貼壁法^[36]。相比較而言，膠原酶消化法具有更高的細(xì)胞分離效率。本研究使用機(jī)械法先將脂肪組織剪成小塊，然后進(jìn)行膠原酶消化，以更好地獲得適用于細(xì)胞培育肉種子細(xì)胞的細(xì)胞樣本。PREF1是脂肪前體細(xì)胞的標(biāo)志基因^[37]，通常用于鑒定或純化脂肪前體細(xì)胞^[21]。本研究利用PREF1抗體結(jié)合免疫熒光技術(shù)對獲得的脂肪前體細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。結(jié)果顯示幾乎所有細(xì)胞均表達(dá)PREF1，這表明提取的細(xì)胞為脂肪前體細(xì)胞，可用于后續(xù)其他試驗(yàn)研究。

雞尾酒法（cocktail）是一種常用于誘導(dǎo)哺乳動物脂肪細(xì)胞分化的方法，其成分包括胰島素、地塞米松和IBMX^[4，35]。研究表明，羅格列酮的添加可以進(jìn)一步提高雞尾酒法的分化效率^[38]。此外，還有研究人員在雞尾酒法的基礎(chǔ)上添加了羅格列酮、生物素和泛酸^[39-40]，用于豬脂肪前體細(xì)胞的分化。另外，胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、氫化可的松和羅格列酮的聯(lián)合使用也可以促使豬的脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞^[41]。油酸是一種常用的禽類脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)試劑^[42]，而現(xiàn)在也有研究者在哺乳動物脂肪細(xì)胞分化中使用油酸^[43]。本研究的對比結(jié)果顯示，雞尾酒法的分化效率較低且脂滴分布不均勻。然而，羅格列酮的添加確實(shí)可以提高脂肪細(xì)胞分化效率（圖2）。在存在10%FBS的情況下，添加羅格列酮比油酸鈉更有效地促進(jìn)了脂肪細(xì)胞分化，而在存在2%FBS的情況下，添加油酸鈉的促進(jìn)效果更好。推測其原因是低濃度血清中的脂肪酸含量較少，脂肪酸本身是甘油三酯的合成底物。油酸鈉是油酸的鈉鹽，也是合成甘油三酯的底物，因此油酸鈉的添加在一定程度上促進(jìn)了脂肪細(xì)胞中脂滴的形成。而高濃度血清中脂肪酸含量本身較高，因此，額外添加油酸鈉對于促進(jìn)成脂分化的作用相對較小。

體外培養(yǎng)細(xì)胞時常在培養(yǎng)基中添加不同濃度的胎牛血清，是因?yàn)檠蹇梢蕴峁┘?xì)胞生長過程中所需的細(xì)胞因子、激素和營養(yǎng)物質(zhì)。然而，血清中含有的細(xì)胞因子和一些激素可能會影響脂肪前體細(xì)胞的分化過程。通常，10%是最常用的血清濃度。此外，研究表明，在使用0.5%低濃度血清聯(lián)合誘導(dǎo)試劑的情況下，也能夠使豬的脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞^[44]。Boone等^[45]研究小組以無血清培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，在培養(yǎng)基中添加胰島素、氫化可的松、胰島素樣生長因子1和T3，成功實(shí)現(xiàn)了豬血管基質(zhì)細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的分化。無血清培養(yǎng)基也被應(yīng)用于成功誘導(dǎo)人前脂肪細(xì)胞的分化^[46-48]。劉海峰等^[49]的研究發(fā)現(xiàn)，在使用含10%FBS的分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)豬前脂肪細(xì)胞分化時，細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積速度要快于不含血清的分化培養(yǎng)液。在本研究中，比較了在相同誘導(dǎo)試劑的情況下，2%FBS和10%FBS對細(xì)胞分化的影響，同樣也發(fā)現(xiàn)了高濃度血清（10%FBS）情況下的細(xì)胞分化效率更高。此外，有研究探索了培養(yǎng)溫度37℃和39℃對原代培養(yǎng)中豬脂肪前體細(xì)胞增殖和分化的影響，結(jié)果顯示39℃更適合豬脂肪前體細(xì)胞的體外增殖與分化^[41]。基于上述報道，后續(xù)的研究可以進(jìn)一步探索39℃結(jié)合誘導(dǎo)試劑的聯(lián)用，以提高細(xì)胞培育肉用脂肪種子細(xì)胞的分化效率。

細(xì)胞三維培養(yǎng)因更接近體內(nèi)生理環(huán)境而在細(xì)胞體外培養(yǎng)中被廣泛使用，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的細(xì)胞增殖和分化。2022年，Liu等^[50]通過三維培養(yǎng)技術(shù)，在多孔明膠微載體上成功實(shí)現(xiàn)了3T3-L1脂肪前體細(xì)胞和C2C12成肌細(xì)胞的增殖和分化，并利用3D打印技術(shù)制造出“肥瘦相間”的人造肉丸。另外，三維海藻酸鹽水凝膠珠也被用于脂肪細(xì)胞的三維培養(yǎng)、增殖和分化^[51]。有些研究者在制備培育肉的過程中直接使用脂肪添加劑^[52]。與之不同的是，本研究中使用的是具有地方特色的北京黑豬^[27]的脂肪前體細(xì)胞，而非小鼠源的脂肪前體細(xì)胞。通過三維培養(yǎng)技術(shù)，北京黑豬脂肪前體細(xì)胞能夠在在微載體上成功增殖并分化為成熟的脂肪細(xì)胞，這為制備北京黑豬脂肪細(xì)胞培育肉提供了技術(shù)指導(dǎo)。

誘導(dǎo)試劑、培養(yǎng)溫度和血清濃度是脂肪細(xì)胞分化的關(guān)鍵因素。本研究探索了不同誘導(dǎo)試劑的聯(lián)合使用，以及不同血清濃度對脂肪細(xì)胞分化的影響，旨在探索一種高效的脂肪細(xì)胞分化方案。然而，對于細(xì)胞培育肉的制備來講，成本降低也是需要考慮的因素。因此，后續(xù)的研究將同時考慮分化培養(yǎng)時的溫度和三維培養(yǎng)條件，并結(jié)合誘導(dǎo)試劑的聯(lián)合使用，以探索一種高效且價格低廉的適用于細(xì)胞培育肉大規(guī)模培養(yǎng)的分化技術(shù)。

4 結(jié) 論

本研究成功分離培養(yǎng)了北京黑豬脂肪前體細(xì)胞。通過不同血清濃度下多種誘導(dǎo)因子聯(lián)用，篩選出適合二維和三維培養(yǎng)的成脂誘導(dǎo)分化方法，在體外成功地將北京黑豬脂肪前體細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞。為深入研究豬脂肪前體細(xì)胞增殖與分化及脂肪沉積的分子機(jī)制提供良好的細(xì)胞模型，也為細(xì)胞培育肉的制備提供技術(shù)指導(dǎo)。

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（編輯 郭云雁）