荷斯坦奶牛胚胎基因組遺傳評估研究

摘 要：旨在建立一種荷斯坦奶牛胚胎細(xì)胞早期基因組檢測和遺傳評估的方法并篩選優(yōu)秀種用胚胎，通過胚胎移植技術(shù)選育優(yōu)秀種牛，進(jìn)一步縮短世代間隔，加快遺傳進(jìn)展。本研究基于4頭荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞，比較分析2細(xì)胞、5細(xì)胞的微量基因組DNA提取效果、全基因組芯片檢出率及錯配率；隨后提取24枚荷斯坦奶牛早期胚胎5細(xì)胞樣本的基因組DNA，利用150K芯片進(jìn)行基因組檢測；基于大規(guī)模基因組選擇參考群體，采用GBLUP方法計(jì)算每枚胚胎9個性狀的基因組育種值。結(jié)果表明，2和5克隆細(xì)胞的基因組DNA濃度、純度和相對完整性均較好；5克隆細(xì)胞樣品的150K芯片檢出率較高（89.54%～95.07%）、錯配率較低（1.02%～4.67%）。24枚胚胎的5細(xì)胞樣品基因組DNA質(zhì)量、總量和相對完整性均較好，150K芯片數(shù)據(jù)檢出率為92.28%～98.51%，9個性狀（產(chǎn)奶、體型和體細(xì)胞評分）基因組評估準(zhǔn)確性為55%～79%，平均基因組評估準(zhǔn)確性不低于65%。綜上，本研究優(yōu)化并建立了奶牛胚胎少量細(xì)胞DNA提取及基因組評估技術(shù)，胚胎樣本基因組檢出率不低于90%，平均基因組評估準(zhǔn)確性不低于0.65。

關(guān)鍵詞：荷斯坦奶牛；胚胎；基因組選擇

中圖分類號：S823.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-2940-11

收稿日期：2023-10-07

基金項(xiàng)目：“國家乳業(yè)技術(shù)創(chuàng)新中心創(chuàng)建”重點(diǎn)專項(xiàng)（2021—國家乳創(chuàng)中心—3）；內(nèi)蒙古自治區(qū)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2021GG0403）；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFF1000700）；教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT_15R62）

作者簡介：郭子驕（1996-），女，山西晉中人，碩士生，主要從事分子及數(shù)量遺傳學(xué)研究，E-mail：gzijiao@cau.edu.cn

*通信作者：孫東曉，主要從事動物分子數(shù)量遺傳學(xué)與奶牛育種研究，E-mail：sundx@cau.edu.cn

Study on Genomic Selection of Embryos in Holstein Cattle

GUOZijiao¹，ZHENGWeijie¹，SUNWei^2，3，WUBaojiang⁴，BAOXiangnan^2，3，ZHANGQi¹，

HEJinfeng¹，BAOSiqin⁴，ZHAOGaoping²，WANGZixin²，HANBo¹，

LIXihe^2，3，4，SUNDongxiao^1*

（1.National Key Laboratory of Livestock and Poultry Bio-breeding，National Engineering

Laboratory for Animal Breeding，Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and

Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，College of

Animal Science and Technology，China Agricultural University，Beijing100193，China;

2.Inner Mongolia Saikexing Institute of Breeding and Reproductive Biotechnology in

Domestic Animal，Hohhot011517，China; 3.National Center of Technology Innovation for

Dairy Industry，Hohhot010020，China; 4.College of Life Sciences，

Inner Mongolia University，Hohhot010021，China）

Abstract：The present study aimed to establish amethod for early genomic detection and genetic evaluation of embryos in Holstein cattle in order to select excellent breeding embryos，and further breed outstanding bulls through embryo transfer technology thereby shortening the generation interval and accelerating genetic progress.Firstly，the cloned somatic cells from4Holstein bulls was utilized to compare the efficiency of genomic DNA extraction，and call rate and mismatch rate for genotypic data with genome-wide SNP chip from2-cell and5-cell samples.Subsequently，the genomic DNA was extracted from24early-stage embryo samples of Holstein cattle with5cells in each sample，and then genotyped using150K chip.Further，the genomic estimated breeding values for9traits of each embryo were calculated with the GBLUP method based on alarge-scale genomic selection reference population.The results indicated that the concentration，purity and relative integrity of genomic DNA of both2-cell and5-cell samples were good.Of them，the call rates of150K chip genotypic data from5-cell samples were higher（ranging from89.54%to95.07%）than those of2-cell，the mismatch rates were lower（1.02%-4.67%）.The quality，quantity，and relative integrity of the genomic DNA from5-cell samples of24embryos were also usable，which call rate of150K chip data ranged from92.28%to98.51%.The genomic evaluation accuracy for the9traits（including milk yield，type and somatic cell score）reached55%-79%，with an average accuracy of not less than65%.In conclusion，the present study optimized and established an available method for genomic DNA extraction and genomic selection from asmall number of cells in Holstein cattle embryos.The genomic call rate of the embryo samples was not less than90%，and the average accuracy of genomic evaluation was not less than0.65.

Key words：Holstein cattle; embryo; genomic selection

*Corresponding author：SUN Dongxiao，E-mail：sundx@cau.edu.cn

胚胎生產(chǎn)和胚胎移植是奶牛良種快速擴(kuò)繁技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于種牛培育和奶牛群體擴(kuò)繁。生產(chǎn)具有高育種價值的優(yōu)秀胚胎可加速優(yōu)秀基因的擴(kuò)繁，可提高育種效率和奶牛群體的生產(chǎn)水平。目前，通常基于胚胎的系譜信息判斷其種用價值，而產(chǎn)奶、體型、體細(xì)胞評分性狀的遺傳力分別為0.20～0.35^[1]、0.04～0.28^[2]、0.01～0.07^[3]，如果基于常規(guī)系譜指數(shù)選擇^[4]其準(zhǔn)確性為7%～42%，準(zhǔn)確性較低。

基因組選擇（genomic selection，GS）技術(shù)利用覆蓋全基因組的遺傳標(biāo)記對個體進(jìn)行育種值估計(jì)，可以實(shí)現(xiàn)不依賴表型信息對個體進(jìn)行早期準(zhǔn)確選擇^[5]。在傳統(tǒng)的奶牛育種中，優(yōu)秀種公牛需要經(jīng)過后裔測定進(jìn)行選擇，選擇準(zhǔn)確性高但育種周期長；優(yōu)秀母牛通常基于系譜及產(chǎn)奶、體型等性狀表型進(jìn)行選擇，準(zhǔn)確性較差^[6-7]。自2009年，歐美奶業(yè)發(fā)達(dá)國家陸續(xù)應(yīng)用GS技術(shù)進(jìn)行青年公牛早期選擇^[8-9]，目前美國青年公牛產(chǎn)奶性狀的基因組評估可靠性為80%，繁殖、健康和長壽性狀為59%～77%（數(shù)據(jù)來自美國奶牛育種委員會：Council on Dairy Cattle Breeding，CDCB，https：//uscdcb.com/，2023年12月）；2012年，我國正式啟動荷斯坦青年公牛基因組遺傳評估工作^[10-11]，目前產(chǎn)奶性狀的評估準(zhǔn)確性為0.65～0.93，健康和體型性狀的評估準(zhǔn)確性為0.47～0.80^[12]。近幾年，GS技術(shù)也開始應(yīng)用于后備母牛的選擇^[13-15]。關(guān)于奶牛胚胎基因組選擇的報(bào)道仍然不多。Oliveira等^[16]選擇巴西吉爾牛囊胚階段10～20個細(xì)胞進(jìn)行基因組檢測并計(jì)算了產(chǎn)奶量的基因組估計(jì)育種值，其準(zhǔn)確性為0.55～0.82；Fujii等^[17]利用日本黑牛囊胚階段的15個細(xì)胞計(jì)算了胴體重、肋眼面積和大理石紋評分的基因組估計(jì)育種值，并發(fā)現(xiàn)與對應(yīng)胚胎生產(chǎn)犢牛的GEBV非常吻合，相關(guān)性大于90%。

在胚胎移植前，利用基因組選擇技術(shù)選擇優(yōu)秀種用胚胎進(jìn)行移植，可以進(jìn)一步縮短育種周期，快速擴(kuò)繁優(yōu)秀種牛的遺傳物質(zhì)，加快群體遺傳進(jìn)展。但切割過多胚胎細(xì)胞可能會損害胚胎從而影響受胎率，胚胎細(xì)胞過少則影響DNA產(chǎn)量及基因組芯片檢出率。鑒于此，本研究比較了不同細(xì)胞數(shù)量的種公牛克隆體細(xì)胞基因組DNA提取與基因組芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量；進(jìn)一步對奶牛胚胎早期少量細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA提取及基因組遺傳評估，選擇優(yōu)秀種用胚胎。為利用奶牛胚胎基因組選擇技術(shù)培育優(yōu)秀種牛，進(jìn)一步縮短世代間隔，提高育種效率和加快群體遺傳進(jìn)展提供技術(shù)支撐和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取4頭荷斯坦種公牛的耳組織成纖維克隆細(xì)胞，每頭種公牛分別提供2細(xì)胞、5細(xì)胞兩個樣本，用于探究合適細(xì)胞數(shù)量的微量DNA提取；4頭種公牛具有毛囊樣品的150K基因組芯片數(shù)據(jù)；24枚荷斯坦奶牛胚胎桑椹胚5細(xì)胞樣本。克隆細(xì)胞及胚胎樣本均來自內(nèi)蒙古賽科星家畜種業(yè)與繁育生物技術(shù)研究院有限公司。

1.2 荷斯坦奶牛胚胎少量細(xì)胞的獲取

取24枚荷斯坦奶牛桑椹胚階段的胚胎樣本，用IVC溶液沖洗胚胎樣本后進(jìn)行培養(yǎng)。在60mm培養(yǎng)皿底第一行做3個滴，每個滴均為50μL的7%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）；第二行做3個滴，每個滴均為100μL的HM（自配培養(yǎng)基）；將胚胎放入第二行任意的液滴里，用顯微操作儀進(jìn)行操作，用注射針穿破透明帶，吸取出1～5個胚胎細(xì)胞。

1.3 基因組DNA提取和完整性檢測

1.3.1 基因組DNA提取

使用單細(xì)胞擴(kuò)增試劑盒（QIAGEN）提取4頭荷斯坦種公牛耳組織克隆細(xì)胞（2細(xì)胞、5細(xì)胞）樣本及24枚胚胎桑椹胚5細(xì)胞樣本的基因組DNA。將細(xì)胞裂解液加入含有微量細(xì)胞的離心管中，裂解細(xì)胞；加入終止反應(yīng)液，終止細(xì)胞裂解；輕彈離心管混勻DNA擴(kuò)增體系；使用PCR擴(kuò)增儀（BIO-RAD T100，美國）擴(kuò)增基因組DNA。

利用核酸分析儀（NanoDrop，美國）測定基因組DNA樣本的濃度和純度；利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本基因組DNA的長度。

1.3.2 基因組DNA相對完整性檢測

為檢測基因組DNA的相對完整性，挑選位于奶牛不同染色體上的5個功能基因：SESN2（Gene ID：509863）、RPL11（Gene ID：512745）、DDIT3（Gene ID：777788）、GAPDH（Gene ID：281181）和DGAT1（Gene ID：282609），利用Primer3.0（http：//primer3.wi.mit.edu/）分別設(shè)計(jì)5個基因的PCR擴(kuò)增引物。以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。得到擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，比較PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度是否與目的片段長度相同，以此判斷所獲得的基因組DNA相對完整性。5個基因PCR擴(kuò)增的引物序列、產(chǎn)物長度、退火溫度見表1。

1.4 基因組芯片檢測及數(shù)據(jù)質(zhì)控

將4頭荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞（2細(xì)胞、5細(xì)胞）樣本及24枚胚胎5細(xì)胞樣本的基因組DNA使用150K基因組芯片（139097個SNPs）進(jìn)行基因組檢測（石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司，石家莊），獲得芯片基因型數(shù)據(jù)；使用plink1.9軟件分析個體檢出率和SNP檢出率。

1.5 胚胎5細(xì)胞樣本的基因組遺傳評估

首先使用plink1.9軟件對24枚胚胎5細(xì)胞樣本的基因組芯片基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制：剔除SNP位點(diǎn)檢出率低于90%、最小等位基因頻率低于0.01的SNPs位點(diǎn)。

基于作者團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建的1.7萬頭中國荷斯坦牛基因組選擇參考群體^[18-19]，通過Jairath等^[20]提供的計(jì)算方法，利用逆回歸迭代方程由常規(guī)估計(jì)育種值（estimated breeding value，EBV）計(jì)算包括產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳脂量、乳蛋白量、體型總分、泌乳系統(tǒng)評分、肢蹄評分性狀和體細(xì)胞評分共9個性狀的逆回歸育種值（De-regressed proof，DRP），其計(jì)算公式為：

其中，R^-1_i為對角矩陣，其元素等于計(jì)算公牛性狀EBV所用女兒數(shù)量；A^jj為親緣關(guān)系矩陣逆矩陣，當(dāng)j為s、p和g時，分別表示由記錄的動物個體、祖先個體和遺傳組別；k_i為殘差方差和公牛方差的比率，k_i=（4-h²）/h²（h²為性狀遺傳力）；u_i為第i個性狀的EBV群體平均值；Q為公牛與無親本記錄公牛群體的關(guān)聯(lián)矩陣；g_i為第i個性狀的無親本記錄的公牛群體的效應(yīng)向量；s_i為第i個性狀的公牛育種值向量；p_i為沒有估計(jì)育種值的已知父母的解向量；y_i為第i個性狀的逆回歸育種值向量。令a_i=1u_i+Qg_i+s_i，其中a_i為第i個性狀的EBV向量，u_i、g_i、s_i、p_i和y_i都是未知的，其迭代過程為：

（1）將a_i，u_i，g_i，s_i和p_i設(shè)置為0；

（2）計(jì)算：Qg_i+s_i=a_i-1u_i；

（3）計(jì)算：p_i

g_i=A^psA^pp

A^gsA^gg-1A^pg

A^ggQg_i+s_i；

（4）推導(dǎo)：

R^-1_iy_i=R^-1_i1u_i+R^-1_i+A^ssk_iQg_i+s_i+A^spp_ik_i+A^sgg_ik_i和1R^-1_iy_i；

（5）計(jì)算：u_i=（1′R^-1_i1）^-11′R^-1_iy_i；

（6）返回到第二步進(jìn)行迭代循環(huán)直至收斂；

（7）最后計(jì)算得到逆回歸育種值：y_i=R_iR^-1_iy_i。

基因組直接育種值（direct genomic breeding value，DGV）估計(jì)結(jié)果使用準(zhǔn)確性進(jìn)行評價，計(jì)算公式為r=1-seq²V²_a，其中seq為DGV預(yù)測誤差的標(biāo)準(zhǔn)差，V²_a為表型方差。

使用Beagle5.0軟件對24枚胚胎樣本的質(zhì)控后芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行缺失基因型填充，填充至50K密度水平（54609個SNPs；其中150K芯片與50K芯片共有位點(diǎn)41825個），對填充后基因型數(shù)據(jù)再次進(jìn)行質(zhì)控；基于填充質(zhì)控后的芯片基因型數(shù)據(jù)（包括參考群及胚胎細(xì)胞樣本），計(jì)算24枚胚胎樣本間的基因組親緣關(guān)系，構(gòu)建基因組關(guān)系矩陣（G陣）。以參考群體個體的逆回歸育種值作為反應(yīng)變量，基于單性狀動物模型GBLUP方法，使用DMU軟件計(jì)算24枚胚胎樣本的各性狀直接基因組育種值（direct breeding breeding value，DGV），數(shù)學(xué)模型如下：

y=μ+Zg+e

其中，y為產(chǎn)奶性狀（產(chǎn)奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量或乳蛋白率）、健康性狀（體細(xì)胞評分）和體型性狀（體型總分、肢蹄評分或泌乳系統(tǒng)評分）的逆回歸育種值；μ為總體均值；g為個體隨機(jī)加性遺傳效應(yīng)向量；Z為關(guān)聯(lián)g和y的設(shè)計(jì)矩陣；e為隨機(jī)殘差效應(yīng)向量。

基于直接基因組育種值，根據(jù)中國奶牛基因組性能指數(shù)（genomic China performance index，GCPI）公式，獲得24枚胚胎樣本的GCPI。GCPI公式如下：

GCPI₂₀₂₀=4×25×GEBV_Fat22.0+35×GEBV_Prot17.0-10×GEBV_SCS-30.46+8×GEBV_Type5+14×GEBV_MS5+8×GEBV_Famp;L5+1800

其中，GEBV_Fat、GEBV_Prot、GEBV_SCS、GEBV_Type、GEBV_MS、GEBV_Famp;L分別是乳脂量、乳蛋白量、體細(xì)胞評分、體型總分、泌乳系統(tǒng)、肢蹄評分性狀的基因組育種值。

最終根據(jù)24枚胚胎樣本各性狀的基因組育種值和/或GCPI數(shù)值，從大到小進(jìn)行排名，選擇高品質(zhì)優(yōu)秀胚胎作為種用。

2 結(jié) 果

2.1 荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞的基因組DNA提取及完整性檢測

考慮到胚胎成本較高，首先利用驗(yàn)證種公牛的克隆細(xì)胞優(yōu)化少量細(xì)胞的DNA提取方法及芯片數(shù)據(jù)質(zhì)量。4頭荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本的基因組DNA質(zhì)檢結(jié)果顯示，DNA濃度為2188.7～2270.2ng·μL^-1，DNA純度A_260nm/A_280nm為1.8～2.0；利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本基因組DNA的長度，均為2～10kb彌散條帶（圖1）。結(jié)果表明樣本DNA均達(dá)到基因組芯片檢測要求。

4頭荷斯坦種公牛2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本基因組DNA相對完整性如圖2所示，SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度均符合目的條帶長度，表明2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本獲得的基因組DNA完整性相對較好。

2.2 荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞的基因組檢測及質(zhì)量分析

1～4號種公牛克隆2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本的150K芯片捕獲目標(biāo)片段測序數(shù)據(jù)量分別為7.16G、6.31G、6.10G、6.55G、6.55G、6.85G、6.21G、7.49G；位點(diǎn)平均測序深度依次為139.95×、121.95×、115.49×、129.67×、128.79×、133.40×、120.54×、142.59×，檢測樣本所有目標(biāo)SNPs位點(diǎn)的平均測序深度均在30×以上，表明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠。然后分析4頭荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本基因組芯片個體檢出率（表2），結(jié)果表明：5細(xì)胞樣本個體檢出率為89.54%～95.07%，高于2細(xì)胞樣本個體檢出率（87.83%～92.64%）。

將克隆細(xì)胞的芯片數(shù)據(jù)與4頭種公牛的毛囊樣本基因組芯片數(shù)據(jù)（作為真值對照；檢出率不低于99%）進(jìn)行比較（表2），5細(xì)胞樣本的芯片基因型錯配率為1.02%～4.67%，均小于5%，并且低于2細(xì)胞樣本錯配率（4.49%～14.06%）。

通過比較4頭荷斯坦種公牛2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本的基因組DNA濃度和相對完整度、150K芯片數(shù)據(jù)檢出率及錯配率，后續(xù)選擇每枚胚胎切割5個細(xì)胞用于基因組遺傳評估。

2.3 荷斯坦奶牛胚胎少量細(xì)胞獲取

通過顯微切割技術(shù)，分別獲得24枚荷斯坦奶牛桑椹胚階段胚胎樣本各5個細(xì)胞（圖3）。

2.4 荷斯坦奶牛胚胎少量細(xì)胞DNA提取及完整性分析

24枚胚胎桑椹胚5細(xì)胞樣本基因組DNA質(zhì)檢結(jié)果顯示，DNA濃度為2226.6～2560.0ng·μL^-1，DNA純度A_260nm/A_280nm為1.8～2.0；利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測樣本基因組DNA的長度，均為2～10kb彌散條帶（圖4）。結(jié)果表明樣本DNA均達(dá)到基因組芯片檢測要求。

24枚胚胎桑椹胚5細(xì)胞樣本基因組DNA相對完整性的結(jié)果如圖5所示，SESN2、RPL11、DDIT3、GAPDH和DGAT1基因擴(kuò)增產(chǎn)物長度均符合目的條帶長度，表明樣本獲得的基因組DNA完整性相對較好。24枚胚胎5細(xì)胞樣本基因組DNA濃度、純度、擴(kuò)增長度和擴(kuò)增相對完整性均與克隆細(xì)胞樣本相似，表明提取的胚胎5細(xì)胞樣本基因組DNA足量且完整，可以用于全基因組芯片檢測。

2.5 荷斯坦奶牛胚胎細(xì)胞基因組遺傳評估

將24枚胚胎5細(xì)胞樣本基因組DNA使用150K芯片進(jìn)行基因組檢測，捕獲目標(biāo)片段的測序數(shù)據(jù)量分別為5.12G、4.57G、4.48G、4.73G、5.73G、4.97G、5.51G、4.69G、6.19G、5.47G、5.12G、5.22G、3.85G、6.12G、4.18G、4.25G、5.19G、5.41G、4.49G、4.75G、5.21G、6.71G、4.70G、4.85G；檢測樣本所有目標(biāo)SNPs位點(diǎn)的平均測序深度依次為59.18×、54.53×、52.89×、56.81×、70.81×、59.57×、65.93×、55.51×、74.15×、78.90×、73.62×、74.19×、45.22×、72.32×、48.62×、75.24×、95.86×、95.58×、83.99×、89.09×、95.99×、123.08×、88.38×、86.52×，均在30×以上，表明數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠；樣本基因組芯片個體檢出率為92.28%～98.51%。

利用課題組前期構(gòu)建的基因組選擇參考群體，將樣本填充至50K密度水平，質(zhì)控過后剩余51478個SNPs。利用DMU軟件，基于單性狀動物模型GBLUP方法對樣本進(jìn)行基因組遺傳評估。結(jié)果顯示9個性狀的直接基因組育種值估計(jì)準(zhǔn)確性為0.55～0.79，其中，產(chǎn)奶量、乳脂率、乳蛋白率、乳脂量、乳蛋白量、體型總分、泌乳系統(tǒng)評分、肢蹄評分性狀和體細(xì)胞評分的估計(jì)準(zhǔn)確性分別為0.60～0.72、0.65～0.76、0.68～0.79、0.58～0.70、0.58～0.70、0.55～0.68、0.55～0.67、0.64～0.75和0.55～0.67（表3）。基于GCPI結(jié)果，可以選擇排名優(yōu)秀的胚胎作為種用胚胎進(jìn)行移植，用于優(yōu)秀后備種牛選育。

3 討 論

由于胚胎細(xì)胞數(shù)量較少，在牛囊胚中，每10～20個細(xì)胞僅含有100pg的DNA^[21]，因此需要對微量基因組DNA進(jìn)行提取和擴(kuò)增，本研究比較了2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本微量基因組DNA擴(kuò)增結(jié)果，以及選取牛不同染色體上的基因，以擴(kuò)增的DNA為模板進(jìn)行PCR，以此判斷所獲得的基因組DNA相對完整性，進(jìn)而用于下一步全基因組芯片檢測。同時用于基因分型的150K全基因組芯片其位點(diǎn)均勻分布于牛的基因組上，依據(jù)檢測報(bào)告顯示檢測的胚胎樣本所有SNPs位點(diǎn)的平均測序深度在30×以上，并且芯片檢出率大于85%，說明本研究提取的DNA完整性較好。

微量基因組DNA的擴(kuò)增會導(dǎo)致堿基錯配。基因組芯片檢出率及錯配率會影響基因組評估的準(zhǔn)確性，因此選擇荷斯坦種公牛克隆細(xì)胞的基因組芯片檢出率與這些種公牛通過毛囊樣本檢測的基因組芯片檢出率比較，因?yàn)槊倚酒瑪?shù)據(jù)為國際通用且檢出率不低于99%，因此作為真值對照，本研究發(fā)現(xiàn)5細(xì)胞樣本檢出率和錯配率結(jié)果均優(yōu)于2細(xì)胞樣本。Fisher等^[22]研究表明，檢出率與細(xì)胞數(shù)量存在一定關(guān)系，選取胚胎囊胚的單個細(xì)胞和囊胚時期一半的胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA擴(kuò)增，基因組芯片檢出率由78%增加到94%；Fujii等^[17]研究發(fā)現(xiàn)，用于基因組DNA擴(kuò)增的樣本由5個細(xì)胞（日本黑牛囊胚）樣本增加到15個細(xì)胞樣本時基因組芯片檢出率由91%升至98%。通過顯微切割少量胚胎細(xì)胞進(jìn)行基因組檢測，選擇較少的細(xì)胞進(jìn)行檢測對胚胎的破壞較小，但會導(dǎo)致樣本擴(kuò)增效率低、基因組檢出率低，而增加細(xì)胞的數(shù)量會影響胚胎后期發(fā)育以及受胎率^[23]，因此目前的研究采集的細(xì)胞數(shù)量一般為5～10個^[24]。有研究表明，胚胎樣本的基因組芯片檢出率大于0.85時，胚胎樣本基因組估計(jì)育種值與對應(yīng)胚胎生產(chǎn)犢牛的基因組估計(jì)育種值相關(guān)性大于0.9^[25]。同時考慮顯微切割對后續(xù)胚胎發(fā)育以及移植可能造成影響^[26]以及不同數(shù)量細(xì)胞對基因組芯片檢出率的影響，本研究選擇切割胚胎5個細(xì)胞用于基因組評估，檢出率平均可達(dá)到90%且錯配率低于5%，結(jié)果較為理想。

本研究中，荷斯坦奶牛胚胎細(xì)胞的基因組評估準(zhǔn)確性為0.55～0.79，相較于常規(guī)系譜指數(shù)選擇和依據(jù)母牛的產(chǎn)奶、體型等性狀表型選擇的準(zhǔn)確性^[27]提高了20%～30%。根據(jù)美國奶牛育種委員會（CDCB，https：//www.uscdcb.com/）和各國的基因組評估體系等數(shù)據(jù)顯示歐美等國家的奶牛基因組育種值平均可靠性為60%～93%^[28-29]；依據(jù)《2021中國乳用種公牛遺傳評估概要》^[12]顯示，我國荷斯坦青年公牛產(chǎn)奶性狀基因組評估準(zhǔn)確性為0.65～0.93，健康性狀的準(zhǔn)確性為0.47～0.73，體型性狀的準(zhǔn)確性為0.57～0.80。由于美國超大規(guī)模的基因組參考群（4萬多頭驗(yàn)證種公牛及30多萬頭母牛）使得其基因組選擇準(zhǔn)確性較高，本研究中奶牛胚胎細(xì)胞的基因組評估的準(zhǔn)確性高于常規(guī)系譜指數(shù)或表型數(shù)據(jù)，可以用于植入前胚胎早期評價育種價值，選擇高育種值的優(yōu)秀胚胎進(jìn)行移植用于培育優(yōu)秀后備公牛或母牛，由原來的犢牛出生后檢測轉(zhuǎn)變?yōu)榕咛ブ踩肭邦A(yù)測后備牛的性狀，相較于常規(guī)的犢牛出生后檢測進(jìn)一步縮短了育種周期，加快了遺傳進(jìn)展，降低了育種成本。

4 結(jié) 論

本研究比較了荷斯坦種公牛克隆體細(xì)胞的2細(xì)胞、5細(xì)胞樣本基因組DNA提取效果及150K基因組芯片檢出率與錯配率，發(fā)現(xiàn)5細(xì)胞的DNA濃度和完整度符合檢測要求，檢出率較高（89.54%～95.07%）且錯配率較低（1.02%～4.67%），可作為每枚胚胎切割5個細(xì)胞用于胚胎基因組遺傳評估的依據(jù)。

通過提取荷斯坦奶牛胚胎桑椹胚5細(xì)胞樣本的基因組DNA，對胚胎進(jìn)行150K基因組芯片檢測和遺傳評估，芯片數(shù)據(jù)檢出率不低于90%（92.28%～98.51%），9個性狀基因組評估準(zhǔn)確性為0.55～0.79，平均基因組評估準(zhǔn)確性不低于0.65。該研究建立并優(yōu)化了奶牛胚胎少量細(xì)胞的基因組DNA提取及基因組芯片檢測方法，并對送檢胚胎樣品進(jìn)行了基因組遺傳評估，為高效選育優(yōu)秀種牛提供了技術(shù)支撐，進(jìn)一步縮短了奶牛育種世代間隔，加快了遺傳進(jìn)展。

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（編輯 郭云雁）