陰囊熱應激對山羊血睪屏障結構和功能的影響

摘 要：旨在探究熱應激對山羊血睪屏障（BTB）結構和功能的影響，為山羊熱應激防治提供理論依據。本研究選擇6只1～1.5歲的健康雄性關中山羊，隨機分為2組，每組3只。對照組正常飼喂，試驗組采用改良后的陰囊熱刺激法建立山羊睪丸熱應激模型。利用CASA法檢測精液質量變化，光鏡與透射電鏡觀測睪丸結構，生物素示蹤法顯示BTB通透性改變，蛋白質印記法與免疫組織化學法檢測BTB關鍵蛋白表達定位。熱應激組中山羊睪丸指數、精子數量、精子活率、精子總運動性和精子前進運動率均顯著降低（Plt;0.05）。熱應激導致睪丸組織形態受損明顯，生精細胞數量減少且排列紊亂；支持細胞內質網擴張，并出現大量空泡；支持細胞間緊密連接結構松散且不連續。熱應激引起BTB通透性升高，關鍵連接蛋白表達水平顯著降低（Plt;0.05），但分布定位未受影響。熱應激損傷山羊睪丸組織形態，破壞支持細胞結構并降低BTB關鍵蛋白表達，從而導致BTB結構和功能完整性受損，造成精子質量下降，影響雄性山羊繁殖性能。

關鍵詞：山羊；熱應激法；血睪屏障；超微結構

中圖分類號：S827.3

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-2973-10

收稿日期：2024-01-02

基金項目：國家自然科學基金青年項目（31902223）；陜西省自然科學基金青年項目（2021JQ-159）

作者簡介：武永杰（1979-），男，河南西平人，實驗師，碩士，主要從事動物形態與機能研究，E-mail：wyj79821@nwafu.edu.cn

*通信作者：徐永平，主要從事動物生殖調控機理研究，E-mail：xuyp717@nwsuaf.edu.cn

Effect of Scrotal Hyperthermia on Structure and Function of Blood-testis Barrier in Goats

WUYongjie，XUYinghuan，LIUTengfei，MALin，CHENHong，XUYongping^*

（College of Veterinary Medicine，Northwest Aamp;F University，Yangling712100，China）

Abstract：The aim of this study was to investigate the effects of heat stress on the structure and function of blood-testis barrier（BTB）in goats，and to provide atheoretical basis for the prevention and treatment of heat stress in goats.Six healthy male Guanzhong goats aged1to1.5years old were selected and randomly divided into two groups with three goats in each group.Goats in the control group were fed normally，and the heat stress model was established in the experimental group by the modified scrotal heat stimulation method.The semen quality was detected by CASA，the testicular structure was observed by light microscopy and transmission electron microscopy，the permeability of BTB was detected by biotin tracer，and the expression and localization of key proteins of BTB were detected by Western blot and immunohistochemistry.In heat stress group，the testis index，spermatozoa count，spermatozoa viability，spermatozoa total motility and progressive motility were significantly decreased（Plt;0.05）.Heat stress caused obvious morphological damage of the testis，and the number of spermatogenic cells decreased and the arrangement was disordered.Endoplasmic reticulum of sertoli cells was expanded and alarge number of vacuoles appeared.The tight junction between sertoli cells was loose and discontinuous.The permeability of BTB increased，and the expression level of key junction proteins decreased significantly（Plt;0.05），but the distribution and location of BTB were not affected in heat stress group.Heat stress damages the morphology of goat testis，destroys the structure of sertoli cells and reduces the expression of key BTB proteins，thereby impairing the structural and functional integrity of BTB，resulting in the decline of spermatozoa quality and affect the reproductive capacity of male goats.

Key words：goat; heat stress method; blood-testis barrier; ultrastructure

*Corresponding author：XU Yongping，E-mail：xuyp717@nwsuaf.edu.cn

隨著全球平均氣溫持續上升，環境溫度過高引起的動物熱應激現象受到廣泛關注^[1-2]。熱應激是動物承受超過其體溫調節能力的過高溫度時，機體所產生的非特異性反應^[3]。熱應激嚴重影響動物生長和繁殖性能^[4-6]。研究表明，哺乳動物睪丸溫度過高可阻礙精子正常發生，降低精子質量，最終導致雄性不育^[7-9]。當前我國山羊集約化養殖規模不斷擴大，熱應激對雄性山羊生殖系統的影響不容忽視。

哺乳動物正常精子發生取決于血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）結構的完整性^[10-11]。BTB是睪丸毛細血管腔和生精小管腔之間的物理屏障，由緊密連接（tight junction，TJ）、縫隙連接（gap junction，GJ）、外質特化（ectoplasmic specialization，ES）和橋粒組成。BTB損傷可造成精子生成減少、未成熟精子提前釋放，進而導致雄性不育。眾多研究表明熱應激通過破壞BTB結構影響雄性生殖系統^[12]。例如：環境熱應激可誘發豬睪丸緊密連接關鍵蛋白表達量下降，導致精子損傷^[13]；微波輻射局部熱療陰囊可導致家兔支持細胞膜損傷，進而破壞BTB的保護功能^[14]；熱應激可以影響牛睪丸支持細胞結構與功能，破壞BTB完整性，造成雄性不育^[15]。目前鮮有關于熱應激損傷山羊BTB結構的研究報道。本研究以BTB為切入點，解析熱應激對雄性山羊生殖系統的損傷作用，通過改良的陰囊熱刺激法建立山羊睪丸熱應激模型，探究熱應激對山羊精子質量和睪丸結構的影響，明確熱應激對BTB結構的損傷作用，研究結果可為夏季山羊熱應激防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

選用陜西省千陽縣種羊場6只1～1.5歲、體重20～30kg、繁殖性能良好、健康的雄性關中山羊。本研究經西北農林科技大學實驗動物倫理委員會審查批準（批準編號：DY2023033）。

1.1.2 主要試劑

蘇木素（北京索萊寶生物科技有限公司，H8070）、中性樹膠（北京索萊寶生物科技有限公司，G8590）、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin（美國賽默飛世爾科技公司，21335）、鏈霉親和素-FITC（美國Sigma-Aldrich公司，S3762）、DAPI（美國Abcam公司，ab104139）、二氨基聯苯胺（DAB）（美國Abcam公司，ab64264）、免疫組織化學試劑盒（福州邁新生物技術開發有限公司，KIT-9710）、ECL試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，P0018S）、蛋白上樣緩沖液（上海碧云天生物技術有限公司，P0015L）、一抗稀釋液（上海碧云天生物技術有限公司、P0256）、蛋白裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司，R0010）、兔抗N-cadherin單克隆抗體（美國Abcam公司，ab207608）、兔抗ZO-1單克隆抗體（美國Abcam公司，ab276131）、兔抗Occludin單克隆抗體（美國Abcam公司，ab216327）、兔抗Claudin-11單克隆抗體（美國賽默飛世爾科技公司，36-4500）、兔抗Connexin-43單克隆抗體（美國Abcam公司，ab217676）、兔抗β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司，ab8227）、驢抗兔IgG抗體（美國Abcam公司，ab205722）。常規生化試劑購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器

自動熒光顯微鏡（德國Leica公司，LECIA DM6B）、輪轉式切片機（德國Leica公司，LEICA RM2235）、研究級顯微鏡（日本Nikon公司，NI-U）、透射電子顯微鏡（美國FEI公司，TECNAI G2SPIRIT BIO）、超薄切片機（德國Leica公司，EMUC7）、計算機輔助精子分析儀（美國Hamilton Thorne公司，IVOS12）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

本研究在9～10月份進行，將6只雄性關中山羊隨機分為對照組和熱應激組，每組各3只。試驗分為適應期和試驗期兩個階段，其中適應期7d，試驗羊每天正常給水、喂食。試驗期28d，對照組不做任何處理；熱應激組采用改良后的陰囊熱刺激法建立睪丸熱應激模型，具體操作為利用可控溫電熱毯覆蓋住山羊陰囊（42℃加熱2h），每隔6h處理一次，每天處理3次?？煽販仉姛崽簠⒄誜i等^[16]方法進行改良制作，主要由碳纖維發熱線、數顯溫控器和防水布組成。

1.2.2 取材

最后一次熱刺激處理6h后，利用假陰道法采集山羊精液，并置37℃水浴箱液化。山羊麻醉后將雙側睪丸完整取下，標記左、右側后稱重。一部分睪丸組織分別用多聚甲醛、戊二醛和液氮保存。另一部分睪丸組織用于血睪屏障（blood-testis barrier，BTB）通透性檢測。

1.2.3 睪丸指數計算

山羊睪丸稱重并計算睪丸指數。睪丸指數=睪丸重量/山羊體重×100%。

1.2.4 精子質量測定

0.9%生理鹽水將精液稀釋20倍，置于37℃水浴鍋孵育2min，取10μL精子懸液于載玻片上，利用計算機輔助精子分析系統（computer-aided sperm analysis，CASA）進行精液質量測定。測定指標為精子數量、精子活率、總運動性和前進運動率。

1.2.5 伊紅-蘇木素染色（hematoxylin eosin stain，HE）

睪丸經多聚甲醛固定48h后，進行脫水、透明及浸蠟等處理，石蠟包埋，切片機切取5μm厚切片，HE染色。光學顯微鏡下觀察睪丸形態結構并拍照。

1.2.6 透射電鏡觀察睪丸組織超微結構

睪丸組織經戊二醛固定48h后，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗3次，每次15min。1%鋨酸固定2h后PBS洗3次，每次15min。30%、50%、70%、90%、100%丙酮梯度脫水。環氧樹脂浸透、包埋、聚合。超薄切片機切片，醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色后，透射電鏡觀察睪丸超微結構并拍照。

1.2.7 血睪屏障通透性檢測

BTB通透性檢測參照Zeng等^[17]的方法，將100μL EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotin（10mg·mL^-1溶解于含1mmol CaCl₂的PBS中）注射到睪丸間質中，30min后取睪丸組織進行冰凍切片，厚度為7μm。切片經4%多聚甲醛固定15min，5%胎牛血清封閉1h，FITC標記的鏈霉親和素室溫孵育30min。DAPI核染色后，抗淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍攝。

1.2.8 蛋白質印跡法檢測

蛋白裂解液裂解睪丸組織，提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。通過SDS-PAGE電泳分離并轉移至PVDF膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉2h，加入稀釋好的一抗N-cadherin（1∶1000）、Occludin（1∶1000）、ZO-1（1∶1000）、Claudin-11（1∶300）、Connexin-43（1∶1000）和β-actin（1∶1000），4℃孵育過夜。驢抗兔二抗（1∶10000）室溫孵育2h后，ECL化學發光法顯影。

1.2.9 免疫組織化學檢測

石蠟切片脫蠟、酒精梯度脫水、抗原修復、封閉后，加入稀釋好的一抗N-cadherin（1∶500）、Occludin（1∶200）、ZO-1（1∶100）、Claudin-11（1∶100）和Connexin-43（1∶500）4℃孵育過夜。驢抗兔二抗（1∶2000）室溫下孵育30min，DAB顯色，蒸餾水終止反應，蘇木精復染、脫水、透明、封片后，切片在光學顯微鏡下觀察拍照。

1.3 統計分析

試驗數據以“平均值±標準誤（Mean±SEM）”表示，使用SPSS20.0軟件進行分析，獨立樣本t檢驗進行差異性比較，以Plt;0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 熱應激對山羊睪丸指數和精子質量的影響

如圖1A所示，與對照組相比，山羊睪丸熱刺激處理后，睪丸指數顯著下降（Plt;0.05）。CASA精液質量檢測結果顯示，熱應激組精子密度（圖1B）、精子活率（圖1C）、總運動性（圖1D）和精子前進運動率（圖1E）均顯著低于對照組（Plt;0.05）。這些結果提示，熱應激對山羊睪丸造成損傷，并顯著降低精子質量。

2.2 熱應激對山羊睪丸組織結構的影響

利用HE染色法檢測熱刺激處理后睪丸組織形態變化（圖2）。結果顯示，對照組山羊睪丸生精小管基膜清晰完整，外形規則，各級生精細胞有序排列；精原細胞位于基底部，體積較小，細胞核圓形，核仁明顯；精母細胞位于中層，體積較大，細胞核圓形，胞質較多，染色質呈細粒狀，核仁明顯；精子呈蝌蚪狀，頭朝向基底膜，染色深；大部分生精小管管腔內有較多精子，睪丸間質細胞成群分布（圖2A、圖2B）。熱應激組中，生精小管變薄，各級生精細胞和支持細胞明顯減少，管腔內可見脫落的生精細胞，且管腔內精子數目減少；部分曲細精管內僅剩支持細胞及殘留的少量精原細胞，空腔面積變大；生精細胞間隙增大并有大量空泡，生精細胞和基底膜之間存在分離，間質空間增加（圖2C、圖2D）。上述結果表明熱應激損傷了山羊睪丸組織結構。

2.3 熱應激對山羊睪丸超微結構的影響

透射電鏡觀察熱應激對山羊睪丸超微結構的影響（圖3）。結果顯示，對照組中生精上皮內可見不同周期生精細胞，且生精細胞和支持細胞排列有序；支持細胞呈不規則錐體形，細胞底部緊貼基底膜，核大且常染色質豐富均勻，內質網與線粒體等細胞器結構正常；相鄰支持細胞間形成緊密連接（黑色箭頭），且緊密連接界線連續、致密，橋粒結構清晰可見（圖3A、圖3B、圖3C）。熱應激組中，生精上皮內細胞排列松散、紊亂；支持細胞間緊密連接界線模糊，結構松散且不連續，甚至出現斷裂；值得注意的是，支持細胞內大量內質網出現擴張，形成空泡（紅色箭頭），少部分線粒體亦出現空泡化（圖3D、圖3E、圖3F）。以上結果提示，熱應激可損傷生精上皮超微結構，破壞支持細胞間緊密連接。

2.4 熱應激對山羊睪丸血睪屏障通透性的影響

透射電鏡結果提示支持細胞間緊密連接破壞，BTB結構損傷。進一步利用生物素示蹤法檢測熱應激對BTB通透性的影響。結果如圖4所示，對照組生物素（綠色熒光）分布在睪丸組織間質和靠近生精小管基底膜處，曲細精管管腔內沒有綠色生物素分布。熱應激組中生物素分布在睪丸間質和基底膜周圍，部分生物素滲透進入曲細精管管腔內。上述結果表明，熱應激可導致BTB通透性增加，其功能完整性受損。

2.5 熱應激對山羊睪丸血睪屏障關鍵蛋白表達量的影響

為了進一步檢測熱應激損傷BTB結構功能，采用蛋白質印跡法檢測BTB關鍵蛋白（緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-11、縫隙連接蛋白Connexin-43、外質特化蛋白N-cadherin）表達量變化。結果如圖5所示，與對照組相比，熱應激組BTB關鍵蛋白表達量均顯著下降（Plt;0.05），提示熱應激可下調BTB關鍵蛋白表達水平。

2.6 熱應激對山羊睪丸血睪屏障關鍵蛋白表達分布的影響

利用免疫組織化學法檢測熱應激對BTB關鍵蛋白表達分布的影響（圖6）。結果發現，對照組和熱應激組中睪丸組織均可見蛋白陽性信號（黑色箭頭）。對照組中ZO-1、Occludin、Claudin-11、Connexin-43和N-cadherin蛋白均特異性分布于生精小管基底部，位于睪丸支持細胞之間，且陽性反應強烈。熱應激組中這些關鍵蛋白陽性信號顯著降低，但分布位置不變。這些結果表明，熱應激明顯降低ZO-1、Occludin、Claudin-11、Connexin-43和N-cadherin等BTB關鍵蛋白表達量，但其分布定位未受影響。

3 討 論

隨著山羊集約化、規?；⒐I化養殖現象普遍，熱應激被認為是損傷山羊繁殖機能的主要環境因素^[18]。熱應激可顯著降低哺乳動物繁殖性能，尤其會破壞雄性生殖系統^[19-20]。BTB是曲細精管內重要的屏障結構，可為精子發生提供穩定微環境^[21-22]。研究表明，熱應激可損傷BTB結構，BTB結構的破壞導致睪丸生精功能障礙，進而引起雄性不育^[23-24]。目前關于熱應激損傷山羊BTB結構的研究報道較少，本研究以關中山羊為試驗動物，通過對陰囊熱刺激法進行改良并建立山羊睪丸熱應激模型，研究熱應激對山羊BTB結構和功能的影響。

睪丸指數是反映哺乳動物睪丸生殖功能的重要指標^[25]。和玉丹等^[26]給予小鼠全身熱刺激處理后發現睪丸指數明顯減低，提示熱應激可導致小鼠睪丸受損。本研究發現，給予山羊睪丸熱刺激處理后睪丸指數顯著降低，表明熱應激對山羊睪丸造成損傷。精子活率和運動參數是衡量精液質量的重要指標^[27]。本研究通過CASA分析發現熱應激可降低山羊精子密度、活率和活力等指標，這些結果與張琛^[28]對熱應激公兔的精液檢測結果一致，表明熱應激可損傷山羊睪丸功能，導致精子質量下降。

BTB是睪丸生精小管和血管之間的物理屏障，其完整性是保證正常精子產生的關鍵^[10]。眾多研究表明熱應激通過破壞BTB完整性損傷雄性生殖系統^[23]。本研究通過HE染色發現，熱應激導致曲細精管內生精細胞減少、排列紊亂，支持細胞萎縮、胞質內出現空泡等結構變化，提示熱應激導致山羊睪丸結構損傷。支持細胞是BTB重要組成部分，支持細胞損傷可影響BTB結構完整性^[29]。本研究進一步通過透射電鏡觀察生精上皮超微結構，發現熱應激組支持細胞超微結構損傷明顯，支持細胞間緊密連接遭到破壞。緊密連接是BTB結構的基礎，緊密連接形態異常說明BTB完整性受損。生物素示蹤法是檢測BTB完整性的常用方法。Li等^[30]利用生物素示蹤法驗證陰囊熱刺激法可以增加BTB通透性。范小瑞^[31]通過生物素示蹤法檢測了隱睪大鼠BTB通透性的改變。本研究利用生物素示蹤法發現，熱應激可導致生物素穿過BTB結構進入生精小管，進一步明確熱應激可破壞山羊BTB結構和功能。

內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是一種適應性反應，持續或過強ERS可誘導細胞死亡^[32]。細胞發生ERS時，形態上會出現異常改變，主要表現為：內質網異常擴張和腫脹、正常折疊結構消失、胞漿空泡化^[33]。值得注意的是，本研究觀察發現支持細胞內質網呈現明顯擴張，并形成大量空泡，提示支持細胞發生ERS反應。眾多研究表明，熱應激可引起支持細胞ERS導致睪丸損傷。劉洪茂等^[34]將小鼠進行43℃水浴后發現睪丸內ERS相關蛋白表達量顯著升高，提示熱應激可激活ERS反應。胡煜^[35]通過對仔豬睪丸支持細胞熱刺激處理后發現ERS激活，支持細胞大量凋亡。綜上，本研究形態學結果提示熱應激可能引起山羊睪丸支持細胞ERS，進而導致BTB結構功能損傷。

BTB結構的維持取決于連接蛋白的正常表達^[36]。ZO-1、Occludin和Claudin-11在緊密連接中起關鍵作用，研究發現ZO-1、Occludin和Claudin-11缺失可導致BTB通透性增加^[37-39]。Connexin-43為縫隙連接主要蛋白，睪丸Connexin-43的異常表達影響BTB功能完整性^[40]。N-cadherin是外質特化結構的重要蛋白，支持細胞缺失N-cadherin可誘發BTB損傷^[41]。本研究利用蛋白質印跡法和免疫組織化學法檢測BTB關鍵蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-11、Connexin-43和N-cadherin的表達分布，結果顯示熱應激后這些BTB關鍵蛋白表達量顯著降低，但分布定位未受影響。這些結果表明熱應激可降低BTB關鍵蛋白表達，進而影響BTB結構和功能完整性。

4 結 論

本研究結果表明，熱應激可損傷山羊睪丸組織形態，破壞支持細胞結構并降低BTB關鍵蛋白表達，從而導致BTB結構和功能完整性受損，造成精子質量下降，影響雄性山羊繁殖性能。

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（編輯 郭云雁）