飼糧不同能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性和微生物組成的影響

摘 要：旨在探究飼糧不同能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性和菌群結構的影響。選擇40只體重[（13.80±1.60）kg]接近的陜北白絨山羊斷奶公羔隨機分為4組，飼喂消化能水平分別為9.16（I組）、9.66（II組）、10.16（III組）和10.66MJ·kg^－1（IV組）4種飼糧，所有飼糧的粗蛋白質水平均為11.8%。飼養試驗持續60d，包括7d預試期和53d正試期。試驗結束后采集所有動物瘤胃液，測定瘤胃發酵參數，提取瘤胃液總DNA，PCR擴增16S rRNA的V3～V4區進行高通量測序及分析。結果顯示：1）隨著飼糧能量水平的提高，瘤胃液pH、氨態氮（NH₃-N）含量和乙酸/丙酸的比值逐漸降低，總揮發性脂肪酸、乙酸和丙酸含量呈現出先增加后降低的變化趨勢，微生物菌體蛋白（MCP）、丁酸和戊酸含量逐漸升高；Ⅳ組pH顯著低于其他3組（Plt;0.05），I組丙酸含量顯著低于III組和IV組（Plt;0.05），I組乙酸/丙酸的比值極顯著高于III組和IV組（Plt;0.01）。2）瘤胃微生物物種多樣性結果表明，隨著飼糧能量水平的提高，Shannon和Simpson指數逐漸降低，而Chao1、faith_pd和observed_OTUs指數均呈現出先增加后降低的變化趨勢，I組和II組Chao1和observed_OTUs指數均顯著高于III組和IV組（Plt;0.05）。3）對瘤胃微生物的物種組成分析發現，擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria）是所有試驗羊瘤胃優勢菌門，且隨著飼糧能量水平的提高，擬桿菌門的相對豐度逐漸降低，厚壁菌門和變形菌門的相對豐度逐漸升高。普雷沃氏菌屬（Prevotella）和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）是所有試驗羊瘤胃優勢菌屬，且隨著飼糧能量水平的提高，普雷沃氏菌屬相對豐度逐漸降低，而瘤胃球菌屬相對豐度極顯著升高。4）瘤胃微生物的物種差異性方面：門水平上，IV組變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，且顯著高于其他3組（Plt;0.05），II組和III組TM7相對豐度極顯著高于I組和IV組（Plt;0.05），I組互氧菌門（Synergistetes）相對豐度顯著高于其他3組（Plt;0.05）；屬水平上，I組瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對豐度極顯著低于其他3組（Plt;0.01），I組和II組顫螺旋菌屬（Oscillospira）相對豐度極顯著低于III組和IV組（Plt;0.01），I組和III組未分類擬桿菌（Unspecified_Bacteroidales）相對豐度顯著高于II組和IV組（Plt;0.05），I組和II組解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、未分類韋榮氏球菌科（Unspecified_Veillonellaceae）、未分類毛螺菌科（Unspecified_Lachnospiraceae）和未分類梭菌（Unspecified_Clostridiales）相對豐度顯著高于III組和IV組（Plt;0.05），II組和IV組Unspecified_RF32相對豐度顯著高于I組和III組（Plt;0.05），II組和III組Unspecified_F16相對豐度顯著高于I組和IV組（Plt;0.05）。綜上所述，飼糧不同能量水平影響陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性，隨著飼糧能量水平的提高，瘤胃微生物的豐富度有逐漸降低的變化趨勢，顯著改變了變形菌門（Proteobacteria）、互氧菌門（Synergistetes）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）等細菌的相對豐度（Plt;0.05），且消化能水平為9.66MJ·kg^－1的飼糧能夠有效改善陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性和細菌組成。

關鍵詞：陜北白絨山羊；斷奶公羔；能量水平；瘤胃發酵特性；瘤胃菌群組成

中圖分類號：S827.5

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3011-13

Effects of Diets with Different Energy Levels on Rumen Fermentation Characteristics

and Microbial Composition of Weaned Male Shaanbei White Cashmere Goats

LILongping^1*，LITuo^1，2，CAOPeiwen³，ZHUHaijing¹，ZHANGXiaoling³，ZHANGChen¹，

XIAOPuhui⁴，DONGShuwei¹，FENGPing²，QULei^1*，BITaifei^1，2*

（1.Shaanxi Province Engineeringamp;Technology Research Center of Cashmere Goat，

Yulin University，Yulin719000，China; 2.College of Life Sciences，Yulin University，

Yulin719000，China; 3.Animal Husbandry and Veterinary Technology Promotion Station

in Hengshan District of Yulin City，Hengshan719199，China;

4.Shaanxi Provincial Animal Husbandry Technology Promotion Station，Xi’an710005，China）

Abstract：This experiment was conducted to investigate the effects of dietary energy level on rumen fermentation characteristics and microbial composition of weaned male Shaanbei white cashmere goats.A total of40healthy Shaanbei white cashmere goats with similar body weight（approximate（13.80±1.60）kg）were selected and randomly divided into4groups（I，II，III and IV）.The crude protein（CP）level was11.8%，and group I，II，III and IV were fed four diets with different digestible energy（DE）of9.16，9.66，10.16and10.66MJ·kg^－1，respectively.The feeding experiment lasted for60days，including7days of pre-experiment and53days of formal experiment.At the end of experiment，rumen fluid was collected to investigate rumen fermentation parameters，and total DNA was extracted from rumen fluid.After PCR amplification，high-throughput sequencing and analysis were performed on the V3-V4regions of16S rRNA to study the rumen microbial composition.The results were showed as follows：1）As the energy level increasing，pH，ammonia nitrogen（NH₃-N）content，and acetate to propionate ratio of rumen fluid decreased gradually.Total volatile fatty acid，acetate，and propionate content showed atrend of first increasing and then decreasing，while microbial crude protein（MCP）concentrations，butyrate and valerate content gradually increased; The pH of groupⅣwas significantly lower than the other three groups（Plt;0.05），the propionate in group Iwas significantly lower than that in groups III and IV（Plt;0.05），and the acetate to propionate ratio in group Iwas extremely significantly higher than that in groups III and IV（Plt;0.01）.2）Rumen microbial alpha diversity showed that with the increase of dietary energy levels，the Shannon and Simpson indices gradually decreased，while Chao1、faith_pd and observed_OTUs index showed atrend of first increasing and then decreasing，with Chao1and observed_OTUs index in groups Iand II were significantly higher than that of groups III and IV（Plt;0.05）.3）The analysis of rumen microbial community composition showed that the dominant bacterial phyla included Bacteroidetes and Firmicutes，followed by Proteobacteria; With the energy level increasing，the relative abundance of Bacteroidea gradually decreased，while the relative abundance of Firmicutes and Proteobacteria gradually increased; The dominant bacterial genera were Prevotella and Ruminococcus，with the energy level increasing，the relative abundance of Prevotella gradually decreased，while the abundance of Ruminococcus significantly increased.4）The analysis of differential abundance comparison of rumen microbiota showed that：At the phylum level，the relative abundance of Proteobacteria in group IV was the highest and significantly higher than that of the other three groups（Plt;0.05）.The relative abundance of TM7in group II and III was significantly higher than that in groups Iand IV（Plt;0.05），while the relative abundance of Synergistetes in group Iwas significantly higher than that in the other three groups（Plt;0.05）.At the genus level，the relative abundance of Ruminococcus in group Iwas extremely significantly lower than that of the other three groups（Plt;0.01），while the relative abundance of Oscillospira in groups Iand II were extremely significantly lower than that of groups III and IV（Plt;0.01）.The relative abundance of Unspecified Bacteroides in groups Iand III was significantly higher than that of groups II and IV（Plt;0.05），the relative abundance of Succinomycetes，Unspecified Veillonellaceae，Unspecified Lachnospiraceae，and Unspecified Clostridials in groups Iand II were all significantly higher than that of groups III and IV（Plt;0.05），the relative abundance of Unspecified_RF32in groups II and IV was significantly higher than that of groups Iand III（Plt;0.05），and the relative abundance of Unspecified_F16in group II and IIII was significantly higher than that of groups Iand IV（Plt;0.05）.In conclusion，the increased dietary energy level affected the rumen fermentation characteristics of weaned male Shaanbei white cashmere goats，with atrend towards reducing the richness of rumen bacteria，as well as significantly changed the relative abundance of Proteobacteria，Synergites，Ruminococcus and Succinococcus.And the diet with digestible energy level of9.66MJ·kg^－1can effectively improve the rumen fermentation characteristics and bacterial composition of weaned male Shaanbei white cashmere goats.

Key words：Shaanbei white cashmere goats; weaned male goats; energy level; rumen fermentation characteristics; composition of rumen microbiota

*Corresponding authors：LI Longping，E-mail：llp_315@163.com; QU Lei，E-mail：ylqulei@126.com; BI Taifei，E-mail：btf88709@163.com

養羊業作為陜北地區傳統農業和農村經濟的重要支柱產業，已成為助力革命老區鄉村產業發展和群眾增收致富的重要手段。《陜西省“十四五”鄉村產業發展規劃》中明確提出了圍繞陜北白絨山羊和肉綿羊的產業發展布局，《榆林市國民經濟和社會發展第十四個五年規劃和二〇三五年遠景目標綱要》中也提出了繼續推進絨山羊1000萬和肉綿羊1000萬的羊子“雙千萬”工程，進一步明確了陜北白絨山羊（絨肉兼用）和肉用綿羊是榆林市現代畜牧業發展的主導產業。其中，陜北白絨山羊具有鮮明的地理標志，是陜北地區畜牧產業發展和農戶增收的重要支撐。據統計，2019年度榆林市陜北白絨山羊飼養規模達800萬只左右，占陜西省羊只總飼養量的90%以上，成為陜西省乃至全國重要的羊肉（榆林“橫山羊肉”為國家地理標志產品）和羊絨（羊絨產量占全省的93%、全國的8.7%）生產區^[1-2]。

瘤胃是反芻動物重要的消化器官，瘤胃棲息著種類繁多且數量巨大的各種微生物，包括細菌、真菌、古生菌、原蟲和病毒等，這些微生物能夠將各種飼料物質轉化為宿主可吸收的化合物，如微生物蛋白質和揮發性脂肪酸（VFA）。瘤胃微生物協同作用，影響動物的營養代謝、生長和健康^[3]。瘤胃pH、氨態氮（NH₃-N）和VFA含量是衡量反芻動物瘤胃健康的重要參數。許多因素，如飼糧、年齡、品種、季節和地理環境等，都會對瘤胃微生物發酵和瘤胃健康產生直接或間接的影響^[4-6]。

日糧能量水平是影響動物對養分消化效率、生產性能、瘤胃發酵特性和瘤胃微生物構成的重要因素^[7]。韋肖等^[8]等通過設計低能量組（ME=8.83MJ·kg^－1）和高能量組（ME=10.84MJ·kg^－1）的兩組飼糧對湖羊的飼養試驗發現，提高日糧能量水平對瘤胃發酵特性影響不顯著，但是顯著降低了瘤胃菌群的豐富度和均勻度，并顯著提高了瘤胃球菌屬和厭氧弧菌屬的相對豐度。張海波等^[9]等通過飼喂宣漢黃牛凈能水平分別為7.49（低能組）、8.85（中能組）和10.19MJ·kg^－1（高能組）的精補料試驗發現，提高精補料能量水平，肉牛瘤胃中原蟲和牛鏈球菌增多，溶纖維丁酸弧菌減少，丙酸濃度升高，乙酸/丙酸的比值和NH₃-N濃度降低，微生物蛋白增加。本團隊前期開展了能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔^[10]和生長育肥期陜北白絨山羊^[11]生長和健康的影響，而關于飼糧不同能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃菌群結構影響的研究報道較少。因此，本試驗在前期研究的基礎上，以陜北白絨山羊斷奶公羔為研究對象，通過飼喂4種不同能量水平但等氮的日糧，研究飼糧不同能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性和瘤胃菌群組成的影響，為陜北白絨山羊斷奶公羔的培育和營養調控提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

選擇健康、平均體重為（13.80±1.60）kg的3月齡斷奶陜北白絨山羊公羔40只，隨機分為4組。飼糧營養水平參考NRC（2007）山羊營養需要量、肉羊飼養標準（NYT816—2004）和本實驗室前期實踐基礎，飼糧粗蛋白質（CP）水平設定為11.8%，消化能（DE）水平按照推薦的營養需要量10.16MJ·kg^－1的標準依次梯度增加或減少0.5MJ·kg^－1進行設定，即I、II、III、IV飼糧組的DE水平分別為9.16、9.56、10.16和10.66MJ·kg^-1[10]。飼糧配方及營養水平參考本團隊前期研究^[10]。飼養試驗持續60d，包括7d預試期和53d正試期。

1.2 飼養管理

試驗開始前對羊舍進行徹底消毒后，注射伊維菌素對所有試驗羊進行驅蟲，按照羊場免疫程序進行常規免疫。試驗期內于每天早晨8：00和下午17：30共飼喂2次，自由飲水，每次剩料量保證在10%左右。

1.3 樣品采集

試驗期第60天晨飼后2h，用胃管式瘤胃液采樣管采集所有試驗動物的瘤胃液，4層紗布過濾后立即測定瘤胃液pH；取約30mL瘤胃液分裝后用于測定氨態氮（NH₃-N）、揮發性脂肪酸（VFA）和微生物菌體蛋白（MCP）含量；另取2mL瘤胃液用于提取DNA和高通量測序分析。所有瘤胃液樣品迅速放入液氮，帶回實驗室后轉移至-80 ℃冰箱保存備用。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 瘤胃發酵參數測定

采集的瘤胃液立即使用Staidson手持式pH計（SG2）測定瘤胃液pH；瘤胃液氨態氮（NH₃-N）含量按照團體標準（T/NAIA0004—2020）方法用堿性次氯酸-苯酚分光光度法（722型分光光度計）測定；瘤胃液中揮發性脂肪酸（VFA）含量按照團體標準（T/NAIA005—2020）中的方法用GC102AF型氣相色譜儀測定；瘤胃液微生物菌體蛋白（MCP）含量采用考馬斯亮藍比色法測定^[12]。

1.4.2 瘤胃微生物檢測

1.4.2.1 DNA提取和PCR擴增：瘤胃液總DNA的抽提按照E.Z.N.A.^?soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）說明書進行，利用NanoDrop2000對DNA濃度和純度進行檢測，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量；使用338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）引物對16S rRNA的V3-V4可變區進行PCR擴增。擴增程序：95 ℃預變性5min；95 ℃變性30s、55 ℃退火30s、72 ℃延伸30s，30個循環；最后72 ℃終延伸10min（PCR儀：ABI GeneAmp^?9700型）。

1.4.2.2 Illumina MiSeq測序：利用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）對其進行純化，Tris-HCl洗脫，最后通過2%瓊脂糖電泳檢測，QuantiFluor^TM-ST（Promega，USA）進行定量檢測。根據Illumina MiSeq平臺（Illumina，San Diego，USA）標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE2×300的文庫。文庫構建步驟：1）連接“Y”字形接頭；2）使用磁珠篩選去除接頭自連片段；3）利用PCR擴增進行文庫模板富集；4）氫氧化鈉變性，產生單鏈DNA片段。利用Illumina公司Miseq PE300高通量測序平臺進行雙尾測序。

1.4.2.3 數據分析與處理：測序下機數據經過Barcode拆分樣本，運用QIIME2dada2進行質控、修剪、去噪、拼接以及去除嵌合體后，形成OTU^[13]。選取OTU的代表性序列，QIIME2feature-classifier插件將OTU代表序列與Greengenes Database13_8數據庫進行比對，按99%序列相似性聚類獲得物種注釋信息^[14]。基于物種注釋信息，用QIIME2feature-table插件剔除所有污染性的線粒體、葉綠體序列以及不能注釋到界級別的OTU及其包含的序列。基于OTU豐度及注釋信息，對每個樣品在界（Kingdom）、門（Phylum）、綱（Class）、目（Order）、科（Family）和屬（Genus）這7個分類水平上的序列數目占總序列數的比例進行統計。使用單因素方差分析（One-Way ANOVA）和Kruskal-Wallis方法鑒定各試驗組之間豐度有差異的細菌^[15]。利用QIIME2core-diversity進行Alpha多樣性（Observed OTU、Shannon、chao1和Faith’s Phylogenetic Diversity）指數和Beta多樣性（基于Bray-Curtis距離的主坐標PCoA）分析，評估樣本本身的多樣性程度以及樣本之間的微生物群落結構差異性^[16]。基于Qiime2\"qiime diversity beta-group-significance\"命令進行相似性分析（ANOSIM），比較在各個樣品分組之間的微生物組成結構是否存在顯著性差異。

1.5 數據統計與分析

所有試驗數據均以“平均值±標準誤（Mean±SEM）”的形式表示，數據分析采用IBM SPSS Statistics20統計軟件進行單因素方差分析（One-way ANOVA）或Kruskal-Wallis分析。Plt;0.05為差異顯著，Plt;0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 瘤胃發酵特性

由表1可知，隨著飼糧能量水平的升高，瘤胃液pH、NH₃-N含量和乙酸/丙酸的比值逐漸降低，MCP、丁酸、戊酸含量逐漸升高，乙酸、丙酸和總揮發性脂肪酸含量呈現出先增加后降低的變化趨勢。所有試驗組MCP、乙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸和己酸含量均沒有顯著性差異（Pgt;0.05）；IV組pH顯著低于其他3組（Plt;0.05）；I組和II組NH₃-N含量顯著高于III組和IV組（Plt;0.05）；I組丙酸含量顯著低于III組和IV組（Plt;0.05）；I組乙酸/丙酸的比值極顯著高于III組和IV組（Plt;0.01）。

2.2 樣品測序數據及共有物種分析

使用Qiime2軟件DADA2插件對所有樣品的全部原始序列（input）進行質量控制（filtered），去噪（糾正測序錯誤的序列，denoised），拼接（merged），并且去嵌合體（non-chimeric），形成OTU。本研究一共得到682873條有效序列（clean data），平均每個樣品含（37937±6514）條。將有效序列進行聚類，共得到3787個OTUs。四個試驗組共享OTU數為143個，I組特有的OTU數為477個，II組特有的OTU數為794個，III組特有的OTU數為650個，IV組特有的OTU數為557個（圖1）。

2.3 瘤胃細菌結構α多樣性分析

表2列出了α多樣性分析指數在4個試驗組之間的差異性分析結果。Chao1、faith_pd和observed_OTUs指數隨著飼糧能量水平的增加均呈現出先增加后降低的變化趨勢，II組Chao1和observed_OTUs均最高，且顯著高于III組和IV組（Plt;0.05）。Shannon和Simpson指數隨著飼糧能量水平的增加逐漸降低，但各組之間相互比較差異均不顯著（Pgt;0.05）。

2.4 瘤胃細菌結構β多樣性分析

相似性分析（ANOSIM）結果表明，I組和IV組的R值為0.969，P值為0.017；II組和IV組的R值為0.904，P值為0.013；III組和IV組的R值為0.856，P值為0.038。試驗結果表明I組和IV組、II組和IV組、III組和IV組之間菌群結構存在顯著差異。通過主坐標分析（PCoA）表明，各試驗組之間有較明顯的聚集（圖2）。

2.5 物種組成

2.5.1 門水平

優勢菌門主要以擬桿菌門（Bacteroidetes）[（46.22±9.11）%]、厚壁菌門（Firmicutes）[（44.83±5.43）%]和變形菌門（Proteobacteria）[（3.62±0.61）%]為主，三者占所有細菌結構的94%以上；次級優勢菌門有TM7[（1.29±0.12）%]和未分類細菌（Unspecified_Bacteria）[（1.12±0.66）%]、藍藻細菌門（Cyanobacteria）[（0.82±0.81）%]、放線菌門（Actinobacteria）[（0.85±0.56）%]、互氧菌門（Synergistetes）[（0.48±0.37）%]、疣微菌門（Verrucomicrobia）[（0.31±0.17）%]、軟壁菌門（Tenericutes）[（0.19±0.10）%]和螺旋體門（Spirochaetes）[（0.13±0.05）%]；其余門水平相對豐度低于0.1%（圖3）。

2.5.2 屬水平

屬水平上（圖4），普雷沃氏菌屬（Prevotella）[（32.66±9.13）%]和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）[（17.09±14.12）%]是所有試驗組相對豐度最高的優勢菌。次級優勢菌屬的相對豐度均低于10%，主要包括：未分類擬桿菌目（Unspecified_Bacteroidales）[（8.41±7.00）%]、未分類韋氏菌科（Unspecified_Veillonellaceae）[（8.12±5.95）%]、未分類梭菌目（Unspecified_Clostridiales）[（4.71±2.33）%]、未分類瘤胃球菌科（Unspecified_Ruminococcaceae）[（4.32±0.33）%]、顫螺菌屬（Oscillospira）[（2.15±0.75）%]、Unspecified_Lachnospiraceae[（1.92±0.15）%]、解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）[（1.74±0.14）%]、Unspecified_RF32[（1.58±0.19）%]、Unspecified_F16[（1.29±0.13）%]、丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）[（1.20±0.66）%]和未分類細菌（Unspecified_Bacteria）[（1.12±0.65）%]；其余屬水平相對豐度低于1%。

2.6 物種差異

表3列出了在門水平（相對豐度大于0.1%）和屬水平（相對豐度大于1%）上各試驗組之間相對豐度存在顯著差異的細菌。結果表明，門水平上，IV組變形菌門（Proteobacteria）相對豐度最高，且顯著高于其他3組（Plt;0.05），II組和III組變形菌門相對豐度顯著高于I組（Plt;0.05）；II組和III組TM7相對豐度極顯著高于I組和IV組（Plt;0.05）；I組互氧菌門（Synergistetes）相對豐度顯著高于其他3組（Plt;0.05）。屬水平上，I組瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對豐度極顯著低于其他3組（Plt;0.01）；I組和II組顫螺旋菌屬（Oscillospira）相對豐度極顯著低于III組和IV組（Plt;0.01）；I組和III組未分類擬桿菌（Unspecified_Bacteroidales）相對豐度顯著高于II組和IV組（Plt;0.05）；I組和II組解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）、未分類韋榮氏球菌科（Unspecified_Veillonellaceae）、未分類毛螺菌科（Unspecified_Lachnospiraceae）和未分類梭菌（Unspecified_Clostridiales）相對豐度均顯著高于III組和IV組（Plt;0.05）；II組和IV組Unspecified_RF32相對豐度顯著高于I組和III組（Plt;0.05）；II組和III組Unspecified_F16相對豐度顯著高于I組和IV組（Plt;0.05）。

3 討 論

3.1 飼糧能量水平對陜北白絨山羊瘤胃發酵特性的影響

反芻動物瘤胃是其重要的飼料消化器官，是有效降解纖維物質的天然發酵罐，對于反芻動物的健康和高效生產具有重要意義。常用來評價瘤胃內環境健康和瘤胃發酵狀態的指標包括pH、NH₃-N和VFAs等。瘤胃液pH是反映瘤胃健康和瘤胃微生物活性以及瘤胃發酵狀態的綜合指標，動物日糧結構、營養水平、生長環境、物種等因素均對瘤胃pH的變化產生一定影響。瘤胃正常發酵情況下，pH維持在5.5～7.5之間^[17]。瘤胃pH影響瘤胃微生物對飼料的利用效率，當反芻動物瘤胃pHlt;6.2時，瘤胃對日糧的利用效率和微生物蛋白合成效率降低^[18]。本研究中各試驗組動物瘤胃pH均在正常范圍內（6.68～7.17），且隨著飼糧能量水平的增加，瘤胃pH逐漸降低，說明本試驗設計的4種日糧適宜瘤胃微生物生長和功能發揮。李宏等^[19]對阿勒泰羊、韋肖等^[8]對湖羊、白大洋^[20]對西門塔爾牛、Rabelo等^[21]對奶牛以及霍路曼等^[22]對荷斯坦育成牛上的研究均發現，飼糧能量水平的提高降低了牛羊瘤胃pH，這些研究與本試驗結果一致。造成這一現象的原因，可能與日糧營養水平、日糧結構、瘤胃發酵產物和飼糧精料與粗料比值等相關，因為在生產實踐中，肉羊的育肥一般都通過提高日糧中精料比例，飼喂營養水平較高的日糧，或者增加日糧中非結構性碳水化合物比例等途徑來實現，更多的精料和易發酵碳水化合物在瘤胃內可以快速且大量產生乙酸、丙酸等VFA利于育肥，但也造成瘤胃pH的降低。結合本試驗設定的飼糧能量水平以及本團隊之前的研究結果^[8]，在維持瘤胃pH正常情況下，提高飼糧能量水平，有利于育肥，陜北白絨山羊斷奶公羔飼糧適宜的消化能水平為9.66MJ·kg^－1。

瘤胃中NH₃-N含量變化反映了蛋白質降解（氮降解）和微生物蛋白合成（氮吸收）之間的平衡狀態，飼糧蛋白質、微生物蛋白、非蛋白氮等均可以作為瘤胃內NH₃-N的來源^[23]。研究表明，瘤胃中適宜的NH₃-N濃度在5.0～30mg·dL^－1，瘤胃過高NH₃-N容易造成氨中毒，加重瘤胃負擔，過低NH₃-N限制了瘤胃微生物蛋白合成，降低飼料利用效率，影響動物生產^[24]。本研究中試驗羊的瘤胃NH₃-N濃度均在正常范圍內（9.98～17.65mg·dL^－1），且隨著飼糧能量水平的提高，瘤胃NH₃-N含量逐漸降低。韋肖等^[8]等通過設計低能量組（ME=8.83MJ·kg^－1）和高能量組（ME=10.84MJ·kg^－1）的兩組飼糧對湖羊的飼養試驗發現，高能量組湖羊瘤胃NH₃-N含量低于低能量組湖羊。張海波和王之盛^[9]通過宣漢黃牛飼喂凈能水平分別為7.49MJ·kg^－1（低能組）、8.85MJ·kg^－1（中能組）和10.19MJ·kg^－1（高能組）的精補料試驗發現，提高精補料能量水平，降低了肉牛瘤胃NH₃-N濃度。這些報道與本研究一致，可能的原因是適度提高飼糧能量水平，一定程度上促進了瘤胃微生物對NH₃-N的利用，導致瘤胃液中檢測到較低濃度的NH₃-N。本試驗結果表明，提高飼料能量水平對瘤胃微生物蛋白的合成和氮的利用具有正向的促進作用。另外，飼料在瘤胃中發酵后形成VFA，VFA為反芻動物提供70%～80%的能量需要。VFA中的乙酸和丙酸是日糧中纖維性碳水化合物和非纖維性碳水化合物分別在瘤胃發酵后的產物，因為瘤胃VFA中乙酸和丙酸的比例高達75%以上，所以瘤胃乙酸型發酵和丙酸型發酵對反芻動物生產，特別是對動物增重具有重要意義^[25]。本研究中，隨著飼糧能量水平的提高，乙酸和丙酸濃度先升高后降低，且III組和IV組丙酸含量顯著高于I組。Wang等^[26]對肉牛的研究、韋肖等^[8]對湖羊的研究以及王堯悅等^[27]對灘羊的研究均發現，飼喂高能量水平日糧的肉牛、湖羊和灘羊瘤胃中乙酸濃度均低于飼喂低能日糧組。相反，飼喂高能日糧組的肉牛和灘羊瘤胃中丙酸濃度均高于飼喂低能日糧組。另外，有研究證實，當瘤胃液pH≥7時，瘤胃上皮對各VFA的吸收存在優先級，即呈現出優先吸收乙酸、再吸收丙酸、最后吸收丁酸的順序^[28]，這也可能是造成低能組（I組pH=7.17）有較多乙酸被吸收，導致低能組試驗動物瘤胃液中乙酸濃度較低的原因。本研究中，提高飼料能量水平，增加了飼糧中玉米的比例，玉米中含有較多的淀粉屬于易消化可溶性碳水化合物，造成瘤胃發酵產生的丙酸相應增加，降低了乙酸/丙酸的值。結合瘤胃pH、NH₃-N、MCP、VFAs含量及本團隊之前關于飼糧不同能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔生長性能影響的研究結果^[10]，消化能為9.66MJ·kg^－1的飼糧能夠改善陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性，促進羔羊生長。

3.2 飼糧能量水平對陜北白絨山羊瘤胃菌群α多樣性的影響

本研究利用Illumina MiSeq平臺對飼喂不同能量水平的陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃液樣本進行雙端測序，研究了飼糧不同能量水平對陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃菌群組成的影響。之前唐鵬^[29]通過設計兩種不同蛋白和能量水平的日糧研究了陜北白絨山羊瘤胃微生物區系的變化，但是關于不同能量水平飼糧對陜北白絨山羊瘤胃微生物菌群結構影響的研究尚未見報道。本研究的Alpha多樣性稀釋曲線（Rarefaction Curve）趨于平緩，進入平臺期，表明測序深度合理，測序量已經能夠滿足后續的生物信息學分析需求。

本研究中，隨著飼糧能量水平的提高，Chao1和Observed-OTU均先升高后降低，II組顯著高于III組和IV組（Plt;0.05）。這兩個指標都是用來衡量菌群豐富度的重要指標，說明飼糧能量水平顯著影響陜北白絨山羊瘤胃菌群的豐富度，且高能量水平有顯著降低陜北白絨山羊瘤胃菌群豐富度的趨勢，這與Qiu等^[30]對荷斯坦育肥牛、唐鵬^[29]對8～9月齡陜北白絨山羊、韋肖等^[8]對湖羊和張振宇等^[31]對于牦牛的研究結果一致。Faith’s Phylogenetic Diversity、Shannon和Simpson指數衡量的是瘤胃微生物菌群的均勻度，本研究中II組這三個指數均高于其他3組，但各組之間相互比較并沒有顯著性差異，表明飼糧能量水平未顯著影響陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃菌群的均勻度。這一結果與之前對8～9月齡陜北白絨山羊^[29]和牦牛^[31]的研究結果一致，但不同于對湖羊^[8]的研究結果。造成這些差異的原因可能與飼糧結構和動物類型等相關，具體原因有待進一步探究。總之，本試驗條件下，飼糧消化能水平為9.66MJ·kg^－1時可提高瘤胃微生物α多樣性。

3.3 飼糧能量水平對陜北白絨山羊瘤胃微生物菌群結構的影響

3.3.1 門水平

對于反芻動物瘤胃菌群組成的絕大多數研究均發現，在門分類水平上，擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）是占比最高的兩類細菌^[32]。本研究一共發現23個細菌門類，其中有11個門的細菌相對豐度大于0.1%，優勢菌門主要包括擬桿菌門[（46.22±9.11）%]、厚壁菌門[（44.83±5.43）%]和變形菌門（Proteobacteria）[（3.62±0.61）%]。且隨著飼糧能量水平的升高，擬桿菌門相對豐度逐漸降低，厚壁菌門和變形菌門的相對豐度逐漸升高。擬桿菌門是革蘭陰性厭氧菌，被視為降解高分子有機化合物（即蛋白質和碳水化合物）的主要細菌，并因其在淀粉、果膠和木聚糖消化中的作用而廣為人知，而很多厚壁菌門的細菌則在能量利用中發揮重要作用^[33]。本研究提示，適當提高飼糧能量水平（II和III組），有利于維持瘤胃擬桿菌門的豐度和促進厚壁菌門類細菌的生長，結合本團隊前期的研究^[10]，飼糧能量水平為9.66MJ·kg^－1時，可以有效改善瘤胃擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度，從而有助于羔羊生產性能的提高。唐鵬^[29]通過飼喂兩種不同蛋白和能量水平（高能量高蛋白和低能量低蛋白對照組）的日糧研究了8～9月齡陜北白絨山羊瘤胃菌群結構，發現擬桿菌門（63.58%）和變形菌門（19.00%）的相對豐度遠高于本試驗結果，而厚壁菌門（19.03%）的相對豐度遠低于的本試驗結果，且高營養水平組擬桿菌門的相對豐度顯著高于低營養水平對照組，高營養水平組變形菌門的相對豐度顯著低于低營養水平對照組，高能量蛋白水平飼糧組普雷沃氏菌屬的相對豐度顯著高于低能量蛋白水平對照組。上述差異的可能的原因是，本研究在飼糧蛋白質水平一致的情況下只探討了飼糧能量水平的變化對陜北白絨山羊瘤胃菌群的影響，而韋肖等^[8]對湖羊的研究與本研究一致，這也說明了飼糧能量水平對反芻動物瘤胃菌群組成具有重要影響。另外，本研究中高能量水平飼糧組試驗動物瘤胃pH較低，而之前有研究表明，低pH的瘤胃環境有利于厚壁菌門細菌的生長^[34]。高能量飼糧組試驗動物瘤胃中變形菌門相對豐度較高的原因可能與高能量飼糧中淀粉含量較高有關，因為之前有研究證實，變形菌門在瘤胃淀粉的分解過程中發揮重要作用^[34]。林波等^[35]在對水牛瘤胃微生物和楊碩等^[36]對大青山絨山羊的研究也有相似的發現。另外，本研究還發現，飼糧能量水平顯著影響白絨山羊瘤胃互氧菌門的相對豐度，高能量水平飼糧顯著降低了互氧菌門的比例，這與楊碩等^[36]對大青山絨山羊的研究一致。有研究表明，互氧菌門是厭氧環境氨基酸降解菌，參與厭氧生態系統中氨基酸的利用和轉化^[37]。本研究中隨著飼糧能量水平的提高，互氧菌門相對豐度的降低是否影響白絨山羊瘤胃蛋白質利用和轉化有待于進一步深入研究。

3.3.2 屬水平

本研究在瘤胃細菌的屬水平上一共鑒定到203個細菌屬，其中有13個屬的相對豐度gt;1%，優勢菌屬有普雷沃氏菌屬（Prevotella）[（32.66±9.13）%]和瘤胃球菌屬（Ruminococcus）[（17.09±14.12）%]。且隨著飼糧能量水平的提高，普雷沃氏菌屬相對豐度逐漸降低，瘤胃球菌屬相對豐度極顯著升高，IV組試驗動物瘤胃球菌屬相對豐度達到了30.32%，與普雷沃氏菌屬的比例相當。很多研究表明，普雷沃氏菌屬主要參與非纖維性碳水化合物和蛋白質的代謝，以及精料飼喂較高的動物瘤胃中雷沃氏菌屬比例較高^[36，38]。但是，也有研究發現飼喂干草組山羊瘤胃普雷沃氏菌屬豐度高于精料組^[39]，這一研究結果與本試驗研究結果相似。普雷沃氏菌屬類細菌除了參與淀粉和蛋白質的利用，還參與半纖維素和果膠的降解^[40]，且很多研究表明，日糧結構的變化并不引起瘤胃普雷沃氏菌相對豐度規律性變化^[36，38-39]，不同種類的普雷沃氏菌對底物利用的偏好性存在差異，本研究結果提示，陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃微生物對不同結構和不同營養水平飼糧的發酵存在某種特殊的利用途徑，具體機理有待于進一步研究，且I和II組的飼糧能量水平具有改善瘤胃普雷沃氏菌屬相對豐度的作用。瘤胃球菌屬中研究較多的白色瘤胃球菌和黃色瘤胃球菌能夠在纖維底物的誘導下產生纖維素酶和半纖維素酶，對飼糧纖維的消化利用發揮重要作用^[41]。但也有研究證實，瘤胃球菌屬參與瘤胃淀粉分解代謝，且高精料日糧條件下有利于瘤胃球菌屬類細菌的生長^[42]，這可能是本研究中高能量飼糧試驗組動物瘤胃球菌屬相對豐度較高的原因。這些研究結果提示，陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃微生態系統中可能存在一些尚未報道具體功能的特殊物種。本研究表明，II、III和IV組飼糧能量水平顯著促進了瘤胃球菌屬細菌的生長。綜合來看，結合本團隊之前對飼糧不同能量水平影響陜北白絨山羊斷奶公羔生長性能的研究^[10]，飼糧能量水平為9.66MJ·kg^－1時可以有效改善瘤胃普雷沃氏菌屬和瘤胃球菌屬細菌的組成，從而有利于羔羊體重的增加。Succiniclasticum主要以淀粉、纖維或纖維二糖為發酵底物，主要代謝產物是琥珀酸和乙酸^[43]。本研究中I組Succiniclasticum的相對豐度最高，可能的原因是陜北白絨山羊在低能量水平飼糧飼喂條件下大量利用纖維類物質，促進了Succiniclasticum的繁殖。瘤胃毛螺菌和韋榮氏球菌科細菌與產琥珀酸絲狀桿菌有協同作用參與纖維素的消化過程^[44]。本研究中，未分類毛螺菌科和未分類韋榮氏球菌科隨著飼糧能量水平的提高顯著降低，提示這些細菌在纖維降解的過程中可能發揮了一定的作用，但是由于這些細菌分離培養較為困難，對其具體的生理特征和在纖維消化過程中的具體作用有待于進一步深入研究。

4 結 論

本試驗條件下，飼糧能量水平的提高顯著影響陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃pH、NH₃-N、丙酸含量和乙酸/丙酸的比值，降低了瘤胃菌群豐富度，顯著影響瘤胃變形菌門（Proteobacteria）、互養菌門（Synergistetes）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）和解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）的相對豐度，且飼糧消化能水平為9.66MJ·kg^－1時可有效改善陜北白絨山羊斷奶公羔瘤胃發酵特性和微生物組成。

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（編輯 范子娟）