貓1型皰疹病毒分離鑒定及部分生物學(xué)特性分析

摘 要：本試驗(yàn)旨在從臨床樣品中得到貓1型皰疹病毒（feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1）分離株，為FHV-1疫苗候選毒株的研究奠定基礎(chǔ)。從寵物醫(yī)院采集疑似感染FHV-1的貓的眼鼻拭子，用貓腎細(xì)胞（Crandell reese feline kidney，CRFK）進(jìn)行病毒分離，并進(jìn)行分離株的遺傳進(jìn)化分析、形態(tài)學(xué)電鏡觀察以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)等系統(tǒng)評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：用CRFK細(xì)胞對(duì)臨床樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)，經(jīng)PCR和間接免疫熒光方法鑒定為FHV-1，并命名為“FHV-ZH2202”株。經(jīng)高通量測(cè)序以及基因參考組裝拼接獲得病毒的全基因組序列后，將其與國內(nèi)流行毒株進(jìn)行SNP分析，發(fā)現(xiàn)非同義突變SNP主要集中分布在UL22和US7基因。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對(duì)FHV-ZH2202與國內(nèi)外流行株進(jìn)行分析，F(xiàn)HV-ZH2202株與國內(nèi)外流行株在UL22基因的同源性較高，但對(duì)于US7基因具有相對(duì)較遠(yuǎn)的親緣性。動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果表明，F(xiàn)HV-ZH2202株感染組貓全部發(fā)病，出現(xiàn)打噴嚏、眼鼻分泌物等典型癥狀，但無死亡病例出現(xiàn)。感染后第2天開始，感染組貓通過眼鼻向外界排毒，持續(xù)6～8d。本研究成功分離到1株FHV-1病毒，并對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定，證明FHV-ZH2202株具有一定的致病性，為FHV-1疫苗候選毒株的研究提供一定的參考。

關(guān)鍵詞：貓1型皰疹病毒；分離鑒定；生物學(xué)特性分析；高通量測(cè)序；動(dòng)物回歸試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S852.659.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3040-09

收稿日期：2023-09-12

基金項(xiàng)目：山東省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2022TSGC1078）

作者簡介：鄭煥琴（1999-），女，山東濰坊人，碩士生，主要從事病毒分子生物學(xué)研究，E-mail：lud15684196671@163.com

*通信作者：朱洪偉，主要從事重要人獸共患病分子進(jìn)化與致病機(jī)制研究，E-mail：hwzhu@ldu.edu.cn

Isolation，Identification and Partial Biological Characteristics Analysis of Feline

Herpesvirus-1

ZHENGHuanqin¹，JIANGXiaomin²，YUEHong¹，WANGBaoyan^1，3，LIUYang¹，

ZHANGXingxiao^1，4，ZHANGJianlong^1，3，ZHUHongwei^1，4*

（1.School of Life Sciences，Ludong University，Yantai264025，China;

2.Yantai Muping District Hospital of Traditional Chinese Medicine，Shandong Province，

Yantai264100，China; 3.Key Laboratory of Animal Pathogenic Microbiology and Immunology，

Yantai264025，China; 4.Collaborative Innovation Center for the Pet Infectious Diseases

and Public Health in the Middle and Lower Stream Regions of the

Yellow River，Yantai264025，China）

Abstract：This study aimed to obtain feline herpesivirus-1（FHV-1）isolates from clinical samples through subculture and systematic identification，which laid the foundation for the study of FHV-1vaccine.Ocular and nasal swabs of suspected FHV-1infection cats were collected from pet hospitals.Crandell reese feline kidney（CRFK）were used to isolate virus，and evolutionary genetics analysis，ultrastructural observation via electron microscopy and animal regression test were performed on the isolates.The samples were isolated and sub cultured with CRFK cells，followed by identification as FHV-1by PCR and immunofluorescence，and finally named as\"FHV-ZH2202\"strain.After the complete gene sequence of the virus was obtained by High-throughput sequencing and gene reference assembly，SNP analysis was conducted between the virus and domestic endemic strains.It was found that the non-synonymous mutant SNPS were mainly distributed in UL22and US7genes.Through phylogenetic analysis，F(xiàn)HV-ZH2202and domestic endemic strains shared high homology in UL22gene.However，US7gene harbered by FHV-ZH2202was with arelatively far relationship with the other domestic endemic strains.The results of animal regression test showed that all cats in infection groups were with typically clinical symptoms such as sneezing，ocular and nasal discharge.However，there was no death case in infection groups.Cats in the FHV-ZH2202group shed viral DNA in ocular and nasal secretions to from the second day post infection（dpi）to6-8days post infection.One FHV-1virus strain was successfully isolated and part of biological characteristics were analyzed.It was proved that FHV-ZH2202strain had certain pathogenicity，which laid afoundation for the study of FHV-1vaccine.

Key words：feline herpesvirus-1; isolation and identification; biological characteristics analysis; high-throughput sequencing; animal regression test

*Corresponding author：ZHU Hongwei，E-mail：hwzhu@ldu.edu.cn

貓1型皰疹病毒（feline herpesvirus-1，F(xiàn)HV-1）屬于皰疹病毒科，α-皰疹病毒亞科，水痘皰疹病毒屬。基因組為線性雙鏈DNA，全長為134～137kb，G+C含量為50%左右。病毒粒子直徑130～180nm，有囊膜，呈二十面體對(duì)稱^[1-2]。該病毒可引起貓科動(dòng)物急性、高度接觸性上呼吸道疾病，即貓傳染性鼻氣管炎（feline infectious rhinotracheitis，F(xiàn)IR）。FIR是嚴(yán)重影響貓健康的重要疾病之一，約占貓群病毒性疾病的16.3%^[3]。臨床癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、結(jié)膜炎、打噴嚏、食欲不振、眼鼻分泌物增多等^[4]。FHV-1呈全球性流行，主要感染貓科動(dòng)物，幼貓極易感染，對(duì)幼貓致死率約為50%，如在患病期間混合其他病原感染，死亡率將會(huì)更高^[5-6]。感染后病毒將潛伏于三叉神經(jīng)、扁桃體、鼻甲等，造成潛伏感染并且持續(xù)向外排毒，因此一旦感染將終生攜帶病毒^[7]，成為傳染源，給該病的防治帶來極大的困難^[8]。

對(duì)易感貓進(jìn)行免疫接種和合理的管理措施是預(yù)防該病最主要的方式。目前，我國預(yù)防FHV-1的主要手段為接種由FHV-1、貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）以及貓細(xì)小病毒（feline parvovirus，F(xiàn)PV）制成的三聯(lián)疫苗。該疫苗主要依賴進(jìn)口，國內(nèi)尚無自主研發(fā)的針對(duì)FHV-1的特效疫苗^[9-10]。因此，加強(qiáng)對(duì)國內(nèi)FHV-1的研究，尋找合適的疫苗株至關(guān)重要。

本文通過對(duì)臨床疑似FHV-1的病料進(jìn)行分離鑒定，得到一株FHV-1分離株，并通過對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性分析以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)，為國內(nèi)篩選合適的疫苗候選毒株以及攻毒標(biāo)準(zhǔn)毒株提供相應(yīng)的試驗(yàn)依據(jù)，為研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣品、細(xì)胞、病毒與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

12月齡橘貓，于2022年在煙臺(tái)市某寵物醫(yī)院就診，經(jīng)獸醫(yī)臨床診斷為貓傳染性鼻氣管炎。貓的主要臨床癥狀為打噴嚏，并伴有眼鼻膿液性分泌物出現(xiàn)，采集貓眼部和鼻部的拭子作為臨床樣品，于冷藏條件下在2h內(nèi)運(yùn)輸至魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室；貓腎細(xì)胞（CRFK）由魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室保存；貓1型皰疹病毒FHV-zh01株、貓細(xì)小病毒FPV-027株和貓杯狀病毒FCV-013株均由魯東大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與免疫實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存；2～4月齡健康易感貓（經(jīng)中和試驗(yàn)方法檢測(cè)，F(xiàn)HV-1、FCV、FPV的中和抗體水平均小于1∶4）購自煙臺(tái)拉斐爾生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養(yǎng)基購自VivaCell公司；胎牛血清（FBS）購自ZETA Life公司；胰酶消化液、核酸染料SuperRed、50×TAE緩沖液購自Biosharp公司；青霉素-鏈霉素溶液購自Beyotime公司；PBS粉末、DAPI溶液購自Solarbio公司；2×Taq Master Mix、HiScript II One Step RT-PCR Kit購自Vazyme公司；PrimeSTAR HS（Premix）購自TaKaRa公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒（EasyPure^?Viral DNA/RNA Kit）、Trans DNA Marker II購自Trans公司；FHV單克隆抗體購自EastCoast Bio公司；貓皰疹病毒1型探針法熒光定量PCR試劑盒購自天恩澤公司；山羊抗小鼠IgG Hamp;L（Alexa Fluor488）購自Abcam公司；FHV、FPV、FCV鑒定引物由北京六合華大基因科技有限公司合成；CO₂培養(yǎng)箱（3311CTS）、低速離心機(jī)（ST8）和熒光定量PCR儀（ABI7500）購自Thermo Scientific公司；PCR儀（Mastercycle x50 s）購自Eppendorf公司；紫外光凝膠成像分析系統(tǒng)（GelDoc-It2315）購自UVP公司；電泳儀（JY600C）購自君意公司；倒置熒光顯微鏡購自Nikon公司。

1.3 樣品處理及病毒分離

1.3.1 樣品預(yù)處理

取眼鼻拭子，加入1mL無菌PBS（10mmol·L^-1，pH為7.4）充分渦旋震蕩，經(jīng)3000r·min^-1離心5min。取上清，用0.22μm濾器過濾除菌。

1.3.2 病毒分離培養(yǎng)

將濾液接種于生長狀態(tài)良好的CRFK細(xì)胞單層中，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中吸附1h。同時(shí)設(shè)置陽性對(duì)照（FHV-zh01株）和正常健康細(xì)胞對(duì)照。棄掉接種液，用無菌PBS洗滌1次，補(bǔ)充7mL維持培養(yǎng)基（含有2%FBS的DMEM），置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中，逐日觀察有無細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。

1.3.3 傳代培養(yǎng)

若出現(xiàn)CPE，則將細(xì)胞反復(fù)凍融3次，將細(xì)胞培養(yǎng)物以3000r·min^-1離心15min，取上清作為第一代病毒，用維持培養(yǎng)基將其按照1∶1000稀釋后，接種于一瓶生長狀態(tài)良好CRFK細(xì)胞單層中，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞狀態(tài)，同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照。若無CPE，則在感染3～4d后收取細(xì)胞培養(yǎng)物上清，繼續(xù)按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)，若傳至第3代仍無病變時(shí)，判為陰性，停止分離。

1.4 病毒鑒定

1.4.1 病毒PCR/RT-PCR鑒定

按照病毒DNA/RNA提取試劑盒說明書對(duì)樣品/病毒培養(yǎng)物進(jìn)行核酸提取，按照文獻(xiàn)[2]中的引物用PCR/RT-PCR方法對(duì)FHV-1、FPV和FCV進(jìn)行檢測(cè)，各引物序列見表1。用2×Taq Master Mix對(duì)FHV和FPV進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系：2×Taq Master Mix10μL，上下游引物各0.8μL，ddH₂O6.4μL，模板DNA或陰性對(duì)照2μL。用HiScript II One Step RT-PCR Kit對(duì)FCV進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)體系為：2×One Step Mix10μL，上、下游引物各0.8μL，ddH₂O4.4μL，One Step Enzyme Mix1μL，模板DNA3μL。各反應(yīng)程序設(shè)置見表1。將各PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析，判定檢測(cè)結(jié)果。

1.4.2 間接免疫熒光試驗(yàn)

將病毒培養(yǎng)物與DMEM按照1∶1000進(jìn)行稀釋后，接種于含有CRFK單層細(xì)胞的12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，1mL·孔^-1，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育1h，同時(shí)設(shè)置FHV-zh01陽性對(duì)照。棄上清，用無菌PBS洗滌1次，補(bǔ)充1mL維持培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置正常CRFK細(xì)胞對(duì)照，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約24h。棄上清，用無菌PBS清洗3次，加入預(yù)冷的丙酮，500μL·孔^-1，置于-20℃固定15min。棄掉丙酮，用PBST清洗3次，加入FHV-1單克隆抗體，室溫孵育1h。PBST清洗3次，加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，室溫避光孵育1h，PBST清洗3次，加入DAPI溶液，于倒置熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.3 病毒形態(tài)學(xué)鑒定

取第3代細(xì)胞培養(yǎng)物，依次以3000、5000、8000r·min^-1分別離心15min以去除細(xì)胞碎片，然后在4℃以10000r·min^-1離心1h。棄上清，將沉淀用200μL PBS重懸，用20g·L^-1磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，在電鏡下觀察粒子形態(tài)。

1.5 病毒滴度測(cè)定

取第3代病毒，用DMEM按照10^-1～10^-10進(jìn)行10倍系列稀釋，依次加入至含有CRFK細(xì)胞單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，第1～10列加入病毒，第11～12列作為對(duì)照，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中吸附1h。棄掉病毒液，用PBS洗滌1次，補(bǔ)充200μL維持培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中，觀察出現(xiàn)CPE的孔數(shù)，按照Reed-Muench公式計(jì)算TCID₅₀值。

1.6 高通量測(cè)序

將無FPV和FCV污染的病毒提取病毒基因組DNA后，送北京諾禾致源科技股份有限公司對(duì)病毒全基因組進(jìn)行二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）。測(cè)序時(shí)以NCBI中的C-27株病毒（GenBank登錄號(hào)為NC_013590.2）為參考序列，使用Illumina方法進(jìn)行DNA文庫的構(gòu)建，采用PE150雙向末端測(cè)序（paired-end，PE）策略，測(cè)序深度為2G。測(cè)序完成后，對(duì)測(cè)得的濾過后的讀長（reads）以參考基因組為模板用Seqman軟件進(jìn)行映射比對(duì)組裝（map to reference assembly）拼接，獲取完整的病毒基因組序列。

1.7 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

用Megalign軟件將拼接好的全基因組序列與NCBI上傳的國內(nèi)外分離株進(jìn)行比對(duì)分析。選取的國內(nèi)分離株分別為WH2020（GenBank登錄號(hào)為OQ623 324.1）、CH-B（GenBank登錄號(hào)為MT813047.1）和GD2018（GenBank登錄號(hào)為MT500582.1）。用Mega7.0軟件的最大似然（maximum likelihood method，ML）法以Boot Strap=1000進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.8 動(dòng)物接種試驗(yàn)

將第3代病毒以及陽性對(duì)照FHV-zh01病毒用DMEM稀釋至1×10⁶TCID₅₀·mL^-1，滴鼻5只2～4月齡貓，1mL·只^-1。同時(shí)設(shè)3只陰性對(duì)照，每只滴鼻相同劑量的DMEM。每組采取自由飲食，試驗(yàn)組貓和對(duì)照組貓隔離飼養(yǎng)，觀察14d，逐日記錄有無臨床癥狀，根據(jù)文獻(xiàn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)^[11]進(jìn)行評(píng)分。同時(shí)每2d采集貓眼鼻拭子，提取拭子浸出液的基因組DNA，用貓皰疹病毒1型探針法熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行眼鼻拭子排毒檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離鑒定

將處理好的病料接種至CRFK細(xì)胞后，約12h開始出現(xiàn)CPE。細(xì)胞變圓，逐漸聚集成團(tuán)，呈葡萄串狀。隨感染時(shí)間延長細(xì)胞聚集增多，后期細(xì)胞變圓，并逐漸脫落。未處理的正常CRFK細(xì)胞無明顯病變。將第1代細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后離心取上清，經(jīng)病毒DNA/RNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示FHV-1為陽性，F(xiàn)CV和FPV均為陰性，證明所分離病毒為FHV-1，沒有FCV和FPV污染（圖1），將此病毒命名為“FHV-ZH2202”。

2.2 間接免疫熒光鑒定

以FHV-1單克隆抗體為一抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為二抗，對(duì)病毒進(jìn)行間接免疫熒光鑒定，結(jié)果顯示接種FHV-zh01與FHV-ZH2202病毒的細(xì)胞出現(xiàn)特異性綠色熒光，而對(duì)照細(xì)胞無特異性熒光，證明所分離的病毒為貓1型皰疹病毒（圖2）。

2.3 病毒形態(tài)學(xué)電鏡觀察

在電鏡下可觀察到病毒粒子呈圓形，外周有囊膜包裹，內(nèi)部有核心和衣殼，病毒粒子直徑大約為150nm（圖3），與FHV-1病毒粒子一致。

2.4 高通量測(cè)序和系統(tǒng)發(fā)育分析

以FHV標(biāo)準(zhǔn)株C-27（GenBank登錄號(hào)為NC_013 590.2）作為參考基因組對(duì)過濾后的讀長（reads）進(jìn)行拼接得到FHV-ZH2202的全基因組，共135830bp。以FHV C-27株為參考序列，發(fā)現(xiàn)FHV-ZH2202基因組有18個(gè)SNP以及2個(gè)插入和缺失（Indel），其中編碼區(qū)SNP有13個(gè)，非編碼區(qū)SNP有5個(gè)。將FHV-ZH2202全基因組與國內(nèi)流行株全基因組進(jìn)行SNP分析，發(fā)現(xiàn)FHV-ZH2202病毒基因組與國內(nèi)流行株在毒力相關(guān)基因UL44、UL22、US7和US8均有多個(gè)堿基發(fā)生非同義突變（表2）。對(duì)非同義突變位點(diǎn)集中的UL22基因以及US7和US8基因用Mega7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，用Megalign軟件進(jìn)行基因相似性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FHV-ZH2202病毒與國內(nèi)外流行株UL22基因親緣關(guān)系較近，但在US7和US8基因的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)（圖4）。

2.5 動(dòng)物接種試驗(yàn)

通過滴鼻方式接種1×10⁶TCID₅₀·mL^-1的病毒液，F(xiàn)HV-zh01陽性對(duì)照組與FHV-ZH2202組貓均出現(xiàn)發(fā)熱、眼鼻分泌物增多、打噴嚏和精神沉郁等典型的FHV-1感染的臨床癥狀；FHV-zh01陽性對(duì)照組在感染后第9、11、12天均有貓死亡，而FHV-ZH2202組貓無死亡病例出現(xiàn)；對(duì)照組均無明顯臨床癥狀。與未感染組相比，F(xiàn)HV-zh01陽性對(duì)照組與FHV-ZH2202組貓具有較高的臨床癥狀評(píng)分，但是FHV-ZH2202組臨床評(píng)分低于陽性對(duì)照組。對(duì)貓的眼鼻拭子進(jìn)行排毒檢測(cè)，結(jié)果顯示，感染后第2天開始，F(xiàn)HV-zh01陽性對(duì)照組與FHV-ZH2202組貓通過眼鼻向外界排毒，并且隨時(shí)間的增加排毒量逐漸增多，持續(xù)6～8d后排毒量逐漸降低（圖5）。

3 討 論

近年來，隨著國民生活水平不斷提高，貓作為伴侶動(dòng)物逐漸成為城市生活非常重要的一部分。截至2022年，寵物貓數(shù)量已經(jīng)超過寵物犬^[12]占據(jù)寵物行業(yè)的大部分市場(chǎng)。傳染性疾病仍是造成寵物貓患病和死亡的主要根源，給寵物行業(yè)帶來巨大損失。由FHV-1引起的FIR就是嚴(yán)重危害貓科動(dòng)物健康的主要傳染病之一。該病感染率和死亡率均較高，幼貓極易感染，臨床癥狀主要包括結(jié)膜腫脹、眼鼻分泌物增多、打噴嚏、發(fā)熱等一系列上呼吸道癥狀^[13-14]。該病流行范圍廣泛，呈全球性分布，感染后病毒將潛伏在呼吸道上皮細(xì)胞、眼部上皮細(xì)胞以及三叉神經(jīng)中，持續(xù)向外排毒，成為傳染源^[8，13]，給該病的防控造成巨大困難。

目前，國內(nèi)對(duì)FIR的預(yù)防主要是依靠疫苗接種，但是接種的三聯(lián)疫苗主要依靠進(jìn)口，成本較高，給國內(nèi)貓傳染病的防控造成一定壓力。由于在三聯(lián)苗中對(duì)FHV-1的保護(hù)效果常常是最弱的^[15]，很容易造成對(duì)FHV-1的免疫失敗，增加貓患FHV-1的概率。因此研發(fā)更有效的FHV-1疫苗具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究從病料中分離到一株FHV-1病毒，將其命名為FHV-ZH2202。經(jīng)PCR方法檢測(cè)，F(xiàn)HV-ZH2202株純凈性良好，無FCV和FPV污染，并通過間接免疫熒光和形態(tài)學(xué)電鏡對(duì)其部分生物學(xué)特性進(jìn)行了初步鑒定。

動(dòng)物回歸試驗(yàn)表明，感染FHV-ZH2202株病毒后，組內(nèi)貓均出現(xiàn)明顯貓病毒性鼻氣管炎的典型臨床癥狀，與國內(nèi)報(bào)道的FHV-1分離株感染貓后出現(xiàn)眼鼻分泌物增多、發(fā)熱以及打噴嚏等癥狀相一致。但是，F(xiàn)HV-ZH2202株感染組貓未出現(xiàn)死亡。在相似劑量下，F(xiàn)HV-zh01株感染組貓以及國內(nèi)其他分離株感染試驗(yàn)中感染組貓均有死亡病例出現(xiàn)，致死率分別為25%～100%^[1，9，16]。因此，F(xiàn)HV-ZH2202株具有一定的致病性且有相對(duì)較低的毒力，具有作為臨床疫苗的潛在開發(fā)價(jià)值。

為了分析FHV-ZH2202株的分子生物學(xué)特征，本研究對(duì)該病毒全基因組進(jìn)行高通量測(cè)序，并將FHV-ZH2202株與國內(nèi)已知序列的三株流行株進(jìn)行全基因組SNP分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)HV-ZH2202株基因組在UL44、UL22、US7和US8基因有多處堿基發(fā)生非同義替換，且集中于UL22和US7。UL44、UL22、US7和US8基因分別編碼FHV-1糖蛋白gC、gH、gI和gE，研究表明，以上4個(gè)基因均為FHV-1的主要毒力基因，其蛋白功能與病毒吸附、病毒復(fù)制以及病毒毒力密切相關(guān)^[5，17]。由于US7和US8基因編碼的糖蛋白gE和gI常以二聚體的形式存在，因此對(duì)UL22基因以及US7和US8基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FHV-ZH2202病毒與國內(nèi)外流行株UL22基因親緣關(guān)系較近，但在US7和US8基因親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。因此，F(xiàn)HV-ZH2202株具有較低的毒力表型可能與其主要毒力基因US7和US8基因發(fā)生多處堿基非同義替換相關(guān)，但具體的機(jī)制還有待于更深層次的研究。

4 結(jié) 論

本研究成功分離到一株FHV-1病毒，可作為研發(fā)減毒活疫苗的候選毒株，為FHV-1疫苗毒株篩選的研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)（References）：

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（編輯 白永平）