一株豬流行性腹瀉病毒強(qiáng)毒株的分離與鑒定

摘 要：為了掌握豬流行性腹瀉病毒（PEDV）最新流行毒株的病原特征與致病性，開(kāi)展了PEDV的分離與鑒定。將PEDV陽(yáng)性病料樣品接種Vero細(xì)胞連續(xù)盲傳，分離PEDV流行毒株，并開(kāi)展了分離毒株的培養(yǎng)特性、全基因組序列分析和仔豬致病性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：傳至第3代（P3）分離出一株病毒，病毒在細(xì)胞上形成典型的“合胞體”樣病變；電鏡下病毒大小60～110nm；P10到P35代滴度從10^4.7TCID₅₀·mL^-1升至10^6.43TCID₅₀·mL^-1；CHN-SC2021（P5）基因組全長(zhǎng)28014bp（GenBank收錄號(hào)：OM505025.1），與中國(guó)地區(qū)、歐美地區(qū)、亞洲其他國(guó)家毒株的相似性分別為99.16%～96.32%、99.01%～96.57%、98.94%～96.33%；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示CHN-SC2021株與江西CH/JXJA/2017（MF375374.1）、河南CH/HNAY/2015（KT199103.1）、CH/HNKF-16（KY649107.1）毒株親緣關(guān)系較近，屬于GⅡa型毒株。S基因序列與參考毒株相似度在98.7%～93.4%。將CHN-SC2021病毒液以每頭3mL10⁵TCID₅₀·mL^-1的劑量口服感染6日齡哺乳仔豬，12h開(kāi)始出現(xiàn)食欲不振，20h時(shí)嘔吐，24h出現(xiàn)劇烈嘔吐和黃色水樣腹瀉；剖檢病變主要是胃腸臌氣、空腸和回腸透明；組織病變顯示各腸段均有不同程度的腸絨毛病變、脫落、結(jié)締組織疏松、黏膜肌層與肌層間距增寬等；免疫組化結(jié)果顯示小腸各段均有病毒，回腸中病毒最多。本研究分離獲得一株GⅡa型的PEDV強(qiáng)毒株，有助于豐富我國(guó)PEDV的流行毒株信息及為臨床防控提供參考。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；分離；鑒定；序列分析；哺乳仔豬；致病性

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.659.6

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3049-15

收稿日期：2023-05-08

基金項(xiàng)目：四川省“十四五”川豬重大科技專(zhuān)項(xiàng)（2021ZDZX0010）；成華豬保護(hù)基地生物危害防控經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目（ZZSS-2024-193）；云南省重大科技專(zhuān)項(xiàng)計(jì)劃（202102AE090039）；四川省產(chǎn)教融合示范項(xiàng)目“飼料工業(yè)全產(chǎn)業(yè)鏈轉(zhuǎn)型升級(jí)產(chǎn)教融合創(chuàng)新示范”

作者簡(jiǎn)介：劉維哲（1998-），女，黑龍江海倫人，碩士生，主要從事動(dòng)物傳染病研究，E-mail：douzo_o@163.com；羅成剛（1964-），男，四川成都人，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)臨床技術(shù)應(yīng)用研究，E-mail：2979874080@qq.com。劉維哲和羅成剛為同等貢獻(xiàn)作者

*通信作者：黃小波，主要從事豬的重大傳染病研究，E-mail：rsghb110@126.com

Isolation and Identification of aHighly Pathogenic Strain of Porcine Epidemic

Diarrhea Virus

LIUWeizhe¹，LUOChenggang³，YUANRong³，LIAOYijie¹，WENYimin¹，SUNYing¹，

YUEnbo¹，CAOSanjie^1，2，HUANGXiaobo^1，2*

（1.Research Center for Swine Diseases，College of Veterinary Medicine，Sichuan Agricultural

University，Chengdu611130，China; 2.Sichuan Science-observation Experiment Station of

Veterinary Drugs and Veterinary Diagnostic Technology，Ministry of Agriculture，

Chengdu611130，China; 3.Chengdu Live Stork and Poultry Genetic

Resources Protection Center，Chengdu610081，China）

Abstract：To understand the pathogenic characteristics and pathogenicity of the latest epidemic strain of porcine epidemic diarrhea virus（PEDV），isolation and identification of PEDV were conducted this study.PEDV positive samples were inoculated into Vero cells for continuous transmission for isolating PEDV epidemic strains.Then the culture characteristics，whole genome sequence of the isolated strains were analyzed，and their pathogenicity in piglets were evaluated.Results showed that aPEDV strain（named CHN-SC2021）was isolated from the3rd passage（P3）Vero cells of continuous inoculation of PEDV positive sample.Under the electron microscope，the diameter of the virus was about60-110nm，forming classic\"syncytium\"on the cell; The virus titer from P10to P35generations increased from10^4.7TCID₅₀·mL^-1to10^6.43TCID₅₀·mL^-1; The whole genome sequence of CHN-SC2021（P5）（GenBank accession number：OM505025.1）is28014bp，and its nucleotide sequence homology about99.16%-96.32%，99.01%-96.57%and98.94%-96.33%compared with the reference strains from China，Europe and America，and other Asian countries，respectively; The phylogenetic analysis showed that the CHN-SC2021strain is closely related to Jiangxi CH/JXJA/2017（MF375374.1），Henan CH/HNAY/2015（KT199103.1），and CH/HNKF-16（KY649107.1）strains，belonging to the GⅡa genotype type.The similarity between the Sgene sequence and other strains ranges from98.7%to93.4%.Oral infection of6-day-old suckling piglets with3mL of10⁵TCID₅₀·mL^-1per pig of CHN-SC2021virus solution resulted in loss of appetite at12hours，vomiting at20hours，and severe vomiting and yellow watery diarrhea at24hours; The main pathological changes during dissection are gastrointestinal distension，transparent jejunum and ileum; Histopathological changes showed that each segment of the intestine had varying degrees of intestinal villus lesions，shedding，loose connective tissue，and widened space between the muscularis mucosae and the muscle layer; Immunohistochemistry showed that viruses were present in all segments of the small intestine，with the most viruses present in the ileum.In conclusion，a genotype GⅡa PEDV virulent strain was isolated，which will contribute to enriching the information of PEDV circulating strains in China and be helpful for clinical prevention and control of PED.

Key words：porcine epidemic diarrhea virus; isolation; identification; sequence analysis; sucking piglets; pathogenicity

*Corresponding author：HUANG Xiaobo，E-mail：rsghb110@126.com

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是一種主要引起仔豬腹瀉的腸道傳染病，嚴(yán)重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）首次發(fā)現(xiàn)于1971年，隨后在歐洲、亞洲等養(yǎng)豬地區(qū)廣泛流行。2013年，美國(guó)暴發(fā)PED^[1-2]，隨后加拿大、墨西哥等國(guó)也相繼報(bào)道本病^[3]，目前，本病全球分布。我國(guó)最早于1984年在上海檢出PED^[4]。自2006年后，PEDV變異毒株開(kāi)始出現(xiàn)，特別是2010年以后我國(guó)許多養(yǎng)豬地區(qū)出現(xiàn)以哺乳仔豬高發(fā)病率和高病死率為主要特征的“頑固性腹瀉”^[5]。近年，PEDV仍然在我國(guó)不斷蔓延。2011—2015年，我國(guó)南方地區(qū)18個(gè)豬場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示PED全年均有發(fā)生，且S基因變異率為0～6.29%，具有免疫逃避的可能性，加劇了臨床防控難度^[6]。在2011—2015年，調(diào)查顯示我國(guó)29個(gè)省份有PEDV疫情，樣本陽(yáng)性率為61.10%～78.49%，而豬場(chǎng)的陽(yáng)性率為71.43%～83.47%^[6]。2014—2016年，華南四省平均陽(yáng)性率為58%^[7]。2018—2020年，對(duì)湖北地區(qū)豬場(chǎng)進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，檢出率為74.3%，且呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，且春季冬季多發(fā)^[8]。2019—2021年，山東地區(qū)腹瀉臨床樣品中檢出PEDV率為47.73%，其中腹瀉病毒混合感染率為21.4%^[9]。2020—2021年，全國(guó)7個(gè)省份采集的250份病料陽(yáng)性率為72.8%^[10]。流行病學(xué)調(diào)查顯示PEDV仍然是我國(guó)豬場(chǎng)當(dāng)前面臨的最突出的問(wèn)題之一。

PEDV是單股正鏈的RNA病毒，病毒粒子在95～190nm，基因組大小27～32kb，包括5′、3′端UTR和7個(gè)開(kāi)放閱讀框ORF1a、ORF1b、S、ORF3、M、E、N基因^[11]。目前，PEDV主要分為GⅠ和GⅡ兩大基因組^[12]，GⅠ型中又分為了GⅠa、GⅠb兩種亞群，GⅡ型分為GⅡa、GⅡb和重組型PEDV亞群^[13]。GⅠ型PEDV屬于經(jīng)典毒株，主要分布于歐洲和亞洲地區(qū)，毒力相對(duì)于GⅡ型較弱^[14]。與經(jīng)典GⅠ型不同的是，GⅡ具有更多的突變和重組^[15-17]。GⅡa亞型毒株源自美洲，但部分也源自中國(guó)和日本或其他地區(qū)的零星疫情；GⅡb亞型主要流行于亞洲，尤其是中國(guó)、韓國(guó)和日本；重組PEDV亞群毒株主要來(lái)自歐洲，部分來(lái)自美國(guó)和中國(guó)^[18]。目前，PEDV基因分型為GⅠ和GⅡ兩大基因類(lèi)群，其中GⅡa型的毒力較其他基因型毒力更強(qiáng)，且不同基因型間保護(hù)性較差，對(duì)于不同基因型的防治研究也是重要問(wèn)題^[18]。

PEDV的傳播途徑廣，主要經(jīng)糞-口傳播、鼻腔黏膜傳播^[19]、母乳傳播給仔豬^[20]、精液傳播^[21]。空氣也中存在PEDV，可通過(guò)氣溶膠感染宿主，臨床癥狀消退后還存在持續(xù)排毒^[22]。Li等^[23]的噴鼻感染發(fā)現(xiàn)PEDV在鼻腔上皮細(xì)胞中低水平復(fù)制后，通過(guò)淋巴細(xì)胞遷移至腸道中接觸腸黏膜方式感染宿主。因此，PEDV的臨床防控難度較大。

近十年來(lái)，我國(guó)多省市PEDV感染率居高不下且呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)^[8]。PEDV還存在跨省市傳播、不同基因型毒株感染情況，而不同基因型毒株之間的交叉保護(hù)力有限。PED在全國(guó)范圍內(nèi)流行普遍，四川地區(qū)發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。因此，持續(xù)開(kāi)展PEDV流行毒株的分離鑒定，了解我國(guó)PEDV毒株的最新分子特征及致病性，對(duì)指導(dǎo)我國(guó)PEDV的科學(xué)防控具有重要意義。本研究從四川地區(qū)分離獲得一株GⅡa型的最新PEDV流行強(qiáng)毒株，系統(tǒng)鑒定其病毒特性、全基因組序列分析和仔豬致病性，有助于豐富我國(guó)PEDV的流行毒株信息及為臨床防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、材料及試驗(yàn)動(dòng)物

Vero細(xì)胞、鼠多克隆抗PEDV N蛋白抗體由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)豬病研究中心提供。

腹瀉樣品：2021年2月，四川某規(guī)模種豬場(chǎng)（3000頭種豬規(guī)模），突然暴發(fā)腹瀉疫情，后備母約40％出現(xiàn)厭食和水樣腹瀉（灰褐色糞便）；產(chǎn)房10日齡哺乳仔豬約70％發(fā)生嘔吐和水樣腹瀉，病死率高達(dá)80％以上。調(diào)查發(fā)現(xiàn)該場(chǎng)發(fā)病前執(zhí)行了PEDV-TGEV二聯(lián)滅活疫苗免疫程序，但仍然暴發(fā)了本次腹瀉。本研究樣品為后備母豬腹瀉糞便和腹瀉仔豬的腸道內(nèi)容物與糞便。

動(dòng)物：攻毒用6日齡哺乳仔豬購(gòu)自成都某豬場(chǎng)：該場(chǎng)未接種病毒性腹瀉疫苗（PEDV和TGEV），也無(wú)腹瀉發(fā)病史，使用間接ELISA方法檢測(cè)購(gòu)買(mǎi)仔豬PEDV、TGEV、PDCoV抗體^[24-25]和抗原，均為陰性。

主要試劑與儀器：DMEM高糖培養(yǎng)基干粉，購(gòu)自Thermo公司；青霉素-鏈霉素-兩性霉素B，購(gòu)自索萊寶公司；總RNA抽提試劑盒，購(gòu)自碧云天公司；PCR儀My Cycler^TM，購(gòu)自BIO-RAD公司；高速冷凍離心機(jī)Sorvall ST16R，購(gòu)自Thermo公司。

1.2 病毒分離

樣品加入液氮迅速反復(fù)研磨，加DMEM維持液混勻，12000r·min^-1離心20min，0.22μm過(guò)濾，濾過(guò)液1mL接種于單層Vero細(xì)胞，37℃吸附1.5h后棄過(guò)濾液，加7.5μg·mL^-1胰酶的培養(yǎng)液6mL，置37℃CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)每12h觀察一次細(xì)胞病變，每代連續(xù)觀察4d，收樣后凍融三次，除去細(xì)胞碎片后繼續(xù)用于盲傳。

1.3 病毒鑒定

1.3.1 RT-PCR鑒定

按常規(guī)方法進(jìn)行鑒定，引物序列PEDV-F：TTCGGTTCTATTCCCGTTGATG; PEDV-R：CCCATGAAGCACTTTCTCACTATC，產(chǎn)物大小663bp。

1.3.2 間接免疫熒光（IFA）鑒定

將病毒接種于12孔培養(yǎng)板中Vero細(xì)胞觀察，細(xì)胞有明顯的多合胞體現(xiàn)象且細(xì)胞未脫落時(shí)，用鼠抗N蛋白多克隆抗體為一抗，進(jìn)行IFA制片染色，鏡檢。

1.3.3 負(fù)染透射電鏡鑒定

將病毒分裝至1.5mL EP管中，5000r·min^-14℃離心15min，棄去上清液，用吸管沿管壁緩慢加入1∶5（3%戊二醛：0.1mol LPB緩沖液）稀釋的固定液，重懸細(xì)胞，4℃靜置5min，負(fù)染制片后，電鏡觀察病毒形態(tài)。

1.3.4 病毒滴度（TCID₅₀）測(cè)定

使用96孔板培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行滴度測(cè)定，每隔12h觀察一次，每天記錄CPE孔數(shù)，直至不再產(chǎn)生新CPE，且對(duì)照組細(xì)胞良好，按Reed-Muench法計(jì)算TCID₅₀。

1.4 全基因組測(cè)序及分析

提取第5代病毒RNA，送往上海伯杰醫(yī)療科技有限公司用sanger法測(cè)定全基因序列。選擇國(guó)內(nèi)外PEDV毒株或商品疫苗序列進(jìn)行比對(duì)分析，用mafft軟件序列對(duì)比以及序列兩端對(duì)齊，用MEGA7.0中NJ法比對(duì)序列，自展值設(shè)置為1000分析，分析遺傳距離，并繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，Itol在線網(wǎng)站進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的美化設(shè)計(jì)、繪制熱圖。

1.5 仔豬致病性分析

將6日齡哺乳仔豬3頭分為兩組，感染組2頭（P1、P2），對(duì)照組1頭（C1）。感染組每頭口服10⁵TCID₅₀·mL^-1P20病毒液3mL，對(duì)照組口服同劑量DMEM培養(yǎng)液。口服攻毒后，每日觀察仔豬精神狀態(tài)，記錄排便并評(píng)分：固體0分、半固體1分、糊狀2分、液體3分，出現(xiàn)嘔吐加1分^[26]。當(dāng)出現(xiàn)劇烈腹瀉時(shí)安樂(lè)死處理仔豬，進(jìn)行如下試驗(yàn)：1）剖檢拍攝記錄；2）取組織及血液等用qRT-PCR檢測(cè)病毒分布與含量；3）病理檢測(cè)：組織樣本處理后進(jìn)行免疫組化和HE染色分析，測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度（VH）與隱窩深度（CD），計(jì)算絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值（VH：CD），Graph Pad分析差異性。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離與鑒定

2.1.1 病毒傳代及RT-PCR鑒定

病毒盲傳至第三代時(shí)，在接毒后72h時(shí)細(xì)胞產(chǎn)生病變，主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜融合、邊界不明顯、變圓、裂解、脫落（圖1A，紅色箭頭標(biāo)注處）病毒傳到第五代，用RT-PCR鑒定均能獲得大小約663bp的特異性PEDV條帶（圖1B）。

2.1.2 間接免疫熒光（IFA）和負(fù)染透射電鏡鑒定

病毒主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，融合后未見(jiàn)兩種顏色熒光重疊，證明病毒未在細(xì)胞核中分布，能夠明顯觀察到細(xì)胞質(zhì)融合，形成典型的合胞體細(xì)胞病變，對(duì)照組未見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)綠色熒光，證明該病毒為PEDV（圖2A）。

電鏡下病毒粒子呈球型，直徑為60～110nm，病毒粒子表面有明顯的囊膜和纖突（圖2B），與文獻(xiàn)報(bào)道的PEDV基本一致，進(jìn)一步證實(shí)所分離病毒為PEDV，將分離到的病毒命名為CHN-SC2021。

2.1.3 TCID₅₀測(cè)定

分離PEDV毒株在Vero細(xì)胞連續(xù)傳代，并觀察記錄病變時(shí)間（表1），每隔5代進(jìn)行TCID₅₀測(cè)定，盲傳到35代。結(jié)果表明病毒病變時(shí)間從48h變?yōu)?4h，病毒滴度從10^4.7TCID₅₀·mL^-1上升至10^6.43TCID₅₀·mL^-1（圖3）。

2.2 生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)分析

P5、P35代病毒接種細(xì)胞后，0～6h時(shí)無(wú)明顯病變產(chǎn)生；12～18h病變逐漸增多；24h時(shí)P35相較P5病變更多；36h P35病變達(dá)50%，P5為20%；48h P35完全病變達(dá)；P5在96h完全病變與P3548h一致（圖4A）。qRT-PCR檢測(cè)病毒拷貝數(shù)結(jié)果與鏡下觀察基本保持一致（圖4B）。

2.3 序列分析

2.3.1 全基因組序列

CHN-SC2021全基因序列全長(zhǎng)28014bp（收錄號(hào)：OM505025.1）。用mafft、MEGA7.0、ITOL繪制全基因及S基因進(jìn)化樹(shù)。全基因結(jié)果顯示：CHN-SC2021與中國(guó)毒株、歐美地區(qū)毒株、亞洲其他國(guó)家毒株的相似性分別為99.16%～96.32%、99.01%～96.57%、98.94%～96.33%；與江西CH/JXJA/2017（MF375374.1）、河南CH/HNAY/2015（KT199103.1）、CH/HNKF-16（KY649107.1）毒株親緣關(guān)系較近，屬于GⅡa型毒株，與美國(guó)韓國(guó)等國(guó)家毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖5A）。

2.3.2 S基因序列分析

核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)分析，CHN-SC2021屬于GⅡa型（圖5B）。根據(jù)CHN-SC2021的S基因與其他毒株同源性結(jié)果繪制熱圖（圖6A），發(fā)現(xiàn)與其他PEDV毒株相似性為98.7%～93.4%，與GⅠ、GⅡa、GⅡb代表毒株CV777、AH2012、AJ1102相似度分別為92.72%、97.98%和97.33%，且與韓國(guó)株KNU1305（KJ662 670.1）、美國(guó)株IA2（KF468 754.1）、USA_Colorado_2013（KF272 920.1）相似度最高。在S蛋白中和抗原表位COE、SS2、SS6區(qū)，與CV777、AH2012、AJ1102相比分別有11、2、3個(gè)核苷酸突變位點(diǎn)（圖6B）。

2.4 病毒在仔豬上的致病性評(píng)價(jià)

2.4.1 臨床癥狀及剖檢結(jié)果

口服攻毒6日齡哺乳仔豬，12h仔豬P1出現(xiàn)腹瀉，24h兩頭仔豬均腹瀉，32h安樂(lè)死處理。臨床腹瀉情況進(jìn)行評(píng)分（圖7A），攻毒12h后，兩頭感染組仔豬發(fā)生食欲不振；20h時(shí)P1排水樣腹瀉，P2仔豬嘔吐、肛門(mén)腫大、腹圍增加情況；24h仔豬P1水樣腹瀉并伴有嘔吐，P2仔豬排出半干狀糞便、吐出黃色顆粒狀乳凝塊；32h兩頭仔豬均排出水樣糞便并伴有嘔吐癥狀（圖7B）。

臨床觀察到感染組存在不同時(shí)間仔豬肛門(mén)情況（圖8A）。剖檢后可見(jiàn)感染組仔豬的空腸、回腸、結(jié)腸有不同程度的臌氣、半透明的情況，腸系膜淋巴結(jié)腫大，胃臌氣等癥狀，對(duì)照組仔豬正常（圖8B）。其他臟器可見(jiàn)試驗(yàn)豬的肺、肝顏色較紅、胃部明顯膨大、腸道臌氣透明、腸系膜充血、淋巴結(jié)顏色變?yōu)樯詈稚▓D8C）。

2.4.2 組織中病毒載量分析

取P1、P2、C1仔豬的心、肝、脾等器官及消化道組織檢測(cè)PEDV。對(duì)照仔豬C1未檢測(cè)到病毒，感染組仔豬消化道及腸系膜淋巴結(jié)中檢測(cè)出含量不等的病毒，其中回腸中檢測(cè)的病毒含量最高為10^9.4copies·g^-1（圖9），血液、心、肝、脾、肺和腎中均未檢測(cè)到病毒。

2.4.3 組織病變

組織病變顯示：感染組仔豬P1各腸段發(fā)生不同程度的腸絨毛萎縮，頂端上皮細(xì)胞壞死、脫落，其中空腸、回腸最為嚴(yán)重，大量絨毛細(xì)胞壞死、病變脫落；十二指腸、空腸、回腸、盲腸發(fā)現(xiàn)結(jié)締組織排列疏松、黏膜肌層與肌層間距增寬、部分腸段存在多處水腫，其中空腸中還存在大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。黑色箭頭指出腸絨毛萎縮、壞死、脫落位置，綠色箭頭為結(jié)締組織病變、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)位置（圖10）。對(duì)照組仔豬C1各腸段均保持健康形態(tài)、腸絨毛完整、結(jié)締組織健康無(wú)病變。

根據(jù)HE染色結(jié)果，測(cè)量腸絨毛長(zhǎng)度（VH）與隱窩深度（CD），計(jì)算絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度比值（VH：CD），結(jié)果顯示攻毒仔豬VH：CD比值低于對(duì)照組仔豬（表2），用單向方差分析（ANOVA）和t檢驗(yàn)分析組間差異，感染組十二指腸、空腸與對(duì)照組差異顯著（Plt;0.05），回腸無(wú)差異性。

2.4.4 免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：感染組仔豬腸道存在明顯的褐色病毒顆粒（圖11）。P1中三段小腸中均存在病毒，其中回腸最為明顯，幾乎所有腸絨毛上皮細(xì)胞中均存在，偶見(jiàn)病毒存在于腸腺中；空腸部分腸絨毛存在病毒，已脫落的絨毛被病毒顆粒包圍；十二指腸中病毒均存在于絨毛中。P2與P1相似，也是回腸中病毒最多，病毒大多存在于黏膜絨毛上皮細(xì)胞中。對(duì)照組C1的十二指腸、空腸、回腸中未見(jiàn)褐色病毒顆粒。

3 討 論

PEDV的體外分離培養(yǎng)條件要求較高，最終研究者在培養(yǎng)液中添加胰蛋白酶培養(yǎng)的Vero細(xì)胞上成功培養(yǎng)^[27-28]，胰酶能夠促進(jìn)感染細(xì)胞中的病毒粒子釋放^[29]。因此，本研究使用該種方法開(kāi)展PEDV分離。首先鑒定了所收集樣品為PEDV單獨(dú)感染，隨后在含7.5μg·mL^-1胰酶維持液的Vero細(xì)胞中嘗試分離病毒，盲傳至到第3代時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞呈現(xiàn)特征性“合胞體”樣病變，與王飛等^[30]的報(bào)道相似。IFA檢測(cè)PEDV N蛋白，觀察到PEDV僅存在于胞質(zhì)中，本研究結(jié)果與王亞文等^[31]所檢測(cè)的變異性PEDV毒株結(jié)果相似。將所分離的病毒命名為CHN-SC2021，其生長(zhǎng)曲線顯示P35代在48h拷貝數(shù)達(dá)到最高，病毒滴度變化趨勢(shì)與PEDV-LJX毒株相似^[32]，但與CH-HK-2021毒株出現(xiàn)峰值時(shí)間不同^[33]，說(shuō)明不同毒株間培養(yǎng)特性有差異。

目前，全球的PEDV毒株基因分型大致可分為GⅠ和GⅡ兩大類(lèi)群，不同基因型間不能提供完全的交叉保護(hù)效力，這是PEDV臨床防控面臨的重要問(wèn)題^[18]。本研究分離毒株與參考毒株全基因比對(duì)后發(fā)現(xiàn)CHN-SC2021屬于GⅡa基因型，且與江西CH/JXJA/2017、河南CH/HNAY/2015、CH/HNKF-16毒株在遺傳信息學(xué)上相近，疑似跨地區(qū)傳播進(jìn)入四川。S基因與參考毒株比對(duì)的相似度為98.7%～93.4%，與韓國(guó)株KNU1305、美國(guó)株IA2、USA_Colorado_2013關(guān)系密切，結(jié)果與Cui等^[34]報(bào)道的相似，說(shuō)明中國(guó)部分地區(qū)GⅡa型毒株可能由這幾種毒株變異而來(lái)。CHN-SC2021與GⅠ、GⅡa、GⅡb代表毒株核苷酸相似度分別為92.72%、97.98%和97.33%，相似度的差異可能與交叉保護(hù)效果有關(guān)，若開(kāi)發(fā)能夠針對(duì)主要流行毒株或交叉保護(hù)效果更強(qiáng)的疫苗更具有臨床價(jià)值。不同基因型的S蛋白核苷酸存在突變，CHN-SC2021的中和抗原表位COE、SS2、SS6區(qū)中所存在的突變情況及位置與同基因型毒株HAXX基本相似，但612位的G突變?yōu)閂，可能因此影響毒力或其他特性^[26]。

GⅡa基因型毒株比其他基因型致病性較強(qiáng)，其他研究人員發(fā)現(xiàn)在攻毒試驗(yàn)中GⅡa型腹瀉率為100%，而GⅡb型為80%和40%^[35]。PEDV主要引起10日齡內(nèi)的哺乳仔豬發(fā)病，尤其是7日齡以?xún)?nèi)的哺乳仔豬病死率高達(dá)80％～100％，因此7日齡內(nèi)的哺乳仔豬是評(píng)估PEDV最佳動(dòng)物模型。本研究利用3頭6日齡哺乳仔豬對(duì)病毒致病性進(jìn)行評(píng)價(jià)。攻毒后12h仔豬食欲不振、精神沉郁，24h時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)烈胃腸道癥狀。CHN-SC2021與同為GⅡa型的HNXX毒株相比，嘔吐的發(fā)病情況一致，腹瀉情況更為嚴(yán)重^[26]。病毒組織嗜性發(fā)現(xiàn)病毒主要存在于消化道組織，小腸中數(shù)量最多，回腸病毒拷貝數(shù)高達(dá)10^9.5copies·g^-1。王金坡等^[36]發(fā)現(xiàn)PEDV感染后小腸出現(xiàn)嚴(yán)重空泡化，但本研究中未觀察到，可能與攻毒方式和感染時(shí)間有關(guān)。與對(duì)照組相比空腸、十二指腸V：C值存在顯著性差異，回腸無(wú)顯著性差異，這與Li等^[26]的結(jié)果相似。本研究免疫組化結(jié)果顯示病毒存在于十二指腸、空腸、回腸中，其中回腸中病毒含量最高，但在V：C中無(wú)顯著差異，由于攻毒后32h進(jìn)行了安樂(lè)死且固定樣本，回腸絨毛中的病毒還未脫落，導(dǎo)致病毒在絨毛中還未釋放。切片中可觀察到空腸脫落的腸絨毛中存在大量病毒顆粒，黏膜絨毛表面存在大量豬氨肽酶（pAPN），據(jù)報(bào)道pAPN可能是PEDV的受體之一^[37]。以上結(jié)果證明GⅡa型的CHN-SC2021毒株為高致病性毒株，與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果較一致^[35]。

4 結(jié) 論

本研究從四川地區(qū)分離了一株GⅡa型的PEDV流行強(qiáng)毒株CHN-SC2021，豐富了PEDV的毒株的分子生物學(xué)信息，為PEDV的疫苗開(kāi)發(fā)和防控提供了重要的參考。

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（編輯 孟 培）