2022年中國南方部分地區豬肺炎支原體感染狀況的調查與分析

摘 要：豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是豬地方性肺炎（EP）的原發性病原，可導致豬咳嗽、氣喘、消瘦，并因豬的飼料轉化率升高、日增重減少、出欄時間延長，從而使養殖成本大大增加，給養豬業造成重大經濟損失。本研究旨在對中國南方部分地區豬肺炎支原體的感染狀況進行調查與分析。從中國南方部分地區21個規模化種豬場定點采樣，首先通過病原檢測比較鼻拭子和喉拭子的采樣效果，隨后以簡單隨機抽樣結合分層抽樣確定各豬場樣本量。共收集母豬喉拭子樣品1478份，并將調查的豬群按胎次分為“0～1胎母豬”和“≥2胎母豬”，通過實時熒光定量PCR進行病原檢測，通過多位點序列分型（MLST）結合保守的p36基因及非保守的p97和p146基因進行分子流行病學分析。檢測結果表明，鼻拭子樣品的檢出率為16.67%，喉拭子樣品的檢出率為56.67%，且Ct值更低。豬肺炎支原體感染的場檢出率為66.67%，但各場感染壓力較小，檢出率為1.39%～18.57%。其中“0～1胎母豬”檢出率為10.05%；“≥2胎母豬”檢出率為2.17%。分子流行病學結果顯示，7個豬場的流行菌株均為同一序列類型（ST128），不同豬場間的流行菌株高度同源。對于豬肺炎支原體的病原學檢測，喉拭子是比鼻拭子更靈敏且有效的活體樣品類型，母豬胎次和生豬調運引種是規模化種豬場感染豬肺炎支原體的重要因素。本研究為豬肺炎支原體的防控和凈化工作提供理論基礎。

關鍵詞：豬肺炎支原體；定點采樣；感染狀況；分子流行病學

中圖分類號：S852.62

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3064-11

收稿日期：2023-08-28

基金項目：國家重點研發計劃（2022YFD1800900）；國家生豬產業技術體系崗位科學家項目（CARS-35）

作者簡介：高一鳴（1995-），男，山西太原人，碩士，主要從事動物傳染病研究，E-mail：gym1994@webmail.hzau.edu

*通信作者：譚 臣，主要從事豬重要疫病病原學與流行病學、動物細菌病原微生物致病與免疫機理研究，E-mail：tanchen@mail.hzau.edu.cn；莫玉鵬，主要從事豬病相關研究，E-mail：741623673@qq.com

Investigation and Analysis of Infection Status of Mycoplasma hyopneumoniae in Pigs

in Selected Areas of Southern China，2022

GAOYiming^1，2，CHENGuosheng^1，2，NIShiting^1，2，TONGZe^1，2，WANGHaonan³，

YANGFan^1，2，YANGLijun^1，2，MOYupeng^3*，TANChen^1，2*

（1.College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Wuhan430070，China;

2.The Collaborative Innovation Centre for Sustainable Pig Production，Wuhan430070，China;

3.Guilin Li Yuan Grain and Oil Food Group Co.，Ltd，Guilin541012，China）

Abstract：Mycoplasma hyopneumoniae（Mhp）is the primary pathogen of endemic pneumonia（EP）in pigs，which causes coughing，shortness of breath，and wasting，resulting in higher feed conversion ratio，lower daily weight gain，longer farrowing time，and much higher farming costs，which cause significant economic losses to the pig farming industry.The aim of this study was to investigate and analyze the infection status of Mycoplasma hyopneumoniae in selected areas of southern China.A total of21large-scale pig farms in southern China were fixed-point sampled，and the sampling efficiency of nasal swabs and laryngeal swabs was compared through pathogen detection.Subsequently，the sample size for each farm was determined using simple random sampling combined with stratified sampling.A total of1478laryngeal swab samples from sows were collected，and the surveyed pig populations were divided into“0-1parity sows”and“≥2parity sows”.Pathogen detection was performed using real-time fluorescence quantitative PCR，and molecular epidemiological analysis was conducted using multi-locus sequence typing（MLST）combined with conserved p36gene and non-conserved p97and p146genes.The results showed that the detection rate of nasal swab samples was16.67%，and the detection rate of laryngeal swab samples was56.67%，with lower Ct values.The detection rate of Mycoplasma hyopneumoniae infection in the field was66.67%，but the infection pressure in each field was relatively low，with detection rates ranging from1.39%to18.57%.Among them，the detection rate of“0-1parity sows”was10.05%; the detection rate of“≥2parity sows”was2.17%.Molecular epidemiological results showed that the prevalent strains in7farms were of the same sequence type（ST128），and the genetic variation of the prevalent strains among the different farms was small and highly homogeneous.For the pathogen detection of Mycoplasma hyopneumoniae，laryngeal swabs are amore sensitive and effective sample type in vivo than nasal swabs.Parity of sows and the transportation of pigs are important factors for the infection of Mycoplasma hyopneumoniae in large-scale breeding farms.This study provides atheoretical basis for the prevention and control of Mycoplasma hyopneumoniae.

Key words：Mycoplasma hyopneumoniae; fixed-point sampling; infection status; molecular epidemiology

*Corresponding authors：TAN Chen，E-mail：tanchen@mail.hzau.edu.cn; MO Yupeng，E-mail：741623673@qq.com

豬氣喘病是由豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）感染引起的豬的呼吸道疾病。該病流行廣泛^[1]，尤以寒冷天氣多發。Mhp不同菌株的毒力有差異，豬感染后潛伏期較長，發病后的臨床癥狀為咳嗽、氣喘；病理變化為肺的心葉、尖葉的邊緣發生“肉樣”對稱性病變，部分豬肺泡萎縮，呈化膿性或卡他性支氣管肺炎。主要發生在仔豬斷奶至育肥階段，導致豬消瘦和生產性能的下降，如平均日增重降低、死淘率和飼料轉化率升高，從而使育肥豬出欄時間延長，并增加藥物治療和疫苗成本。更為嚴重的是，Mhp是引起豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要病原之一，被稱作“鑰匙病”，其感染后導致的豬呼吸道纖毛損傷，使機體不能阻止其它呼吸道病原，引起繼發感染和/或混合感染，造成PRDC，加重肺部損傷，進一步削弱豬的生產性能、增加養殖成本，帶來更大的經濟損失^[2]。

Mhp的感染呈世界性分布，全球家豬群平均患病率為30%～80%^[3]。但是Mhp在各國、各地區豬群流行率的相關數據甚少。肺部病變評分是評估Mhp的常用方法，但無法準確了解病原感染狀況。獸醫調查Mhp的感染情況，通常采集屠宰豬的肺病變樣品或病死豬的氣管肺泡灌洗液進行PCR檢測和系統發育分析。如王貴平等^[4]從湖南省長沙市5個縣（市、區）的中小豬場和散養戶收集的205份豬肺，PCR檢出率為24.4%；于淼等^[5]在山東省規模化豬場收集到有肺炎癥狀的豬肺組織213份，PCR檢出率為32.39%，其中免疫場的檢出率為15.22%，未免疫場的檢出率為37.13%；李新蘋等^[6]從新疆5個地區的規模化屠宰場采集913份豬肺臟，進行臨床肺病變評分，80.0%有豬支原體肺炎（MPS）病（730/913）；對MPS病變高于10分的肺77份檢測全部為Mhp陽性（100%）；Zhang等^[7]對中國27個省份出現多種臨床癥狀的989份臨床標本進行采樣，Mhp陽性率2018年為7.2%（35/494），2019年為18.4%（38/207），2020年為43.8%（126/288），MLST總共成功檢測了47份樣品，揭示了來自中國不同省份的Mhp分離株的高度基因型多樣性。若想了解Mhp在某地區豬群中的感染狀況，則要對豬群采集活檢樣品。活檢樣品包括鼻拭子、口腔液（口咽刷取物）、喉拭子、氣管/支氣管拭子和肺泡灌洗液等樣品類型，其中，喉拭子和肺泡灌洗液樣品的檢測敏感性最高，但是喉拭子樣品比肺泡灌洗液更為簡便；鼻拭子的檢測敏感性一般，且病原檢測結果與發病的一致性有限；口腔液（口咽刷取物）的檢測敏感性和一致性最低^[8-12]。

闡明病原基因組的多樣性，對于傳染病流行情況和致病機制的研究以及防控措施的改進有重要意義。目前支原體常用的分型方法有可變數目串聯重復序列（variable number tandem repeat，VNTR）測序、多位點數目可變串聯重復序列分析（multiple loci VNTR analysis，MLVA）、脈沖電場凝膠電泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）和多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST）^[3]。其中MLST重復性好、操作簡便，具有在線數據庫（如PubMLST.org）且易于實驗室間比較，已被廣泛應用于細菌的流行病學分析和進化研究^[13]。Felde等^[14]比較了MLVA、MLST和p146基因分型這三種方法，提出單獨的p146基因分型不能可靠地確定Mhp不同菌株間的親緣關系，但是可作為MLST和MLVA方法的補充以細化更緊密的遺傳關系。

本研究基于對適用于Mhp病原檢測的活體樣品類型的比較，通過對2022年中國南方部分地區規模化種豬場Mhp感染狀況進行調查和分子流行病學分析，進一步優化Mhp的基因分型方法，以期加深對Mhp臨床流行特征的認識，豐富Mhp在大規模豬群中的感染相關數據，為Mhp的防控提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 陽性模板及主要試劑

豬肺炎支原體ES-2株陽性模板為本實驗室制備保存，1×PBS磷酸鹽緩沖溶液購自廣州和為醫藥科技有限公司，AceQ Universal U+Probe Master Mix V2、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DL2000DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.1.2 主要實驗材料和儀器

豬用一次性植絨咽拭子購自深圳市鑫牧科技有限公司。高速離心機（型號：Centrifuge5424R）、PCR擴增儀（型號：Mastercycler nexus）購自德國Eppendorf公司。實時熒光定量PCR儀（型號：MA-688）購自蘇州雅睿生物技術股份有限公司。干式恒溫器（型號：K30）購自杭州奧盛儀器有限公司。

1.1.3 試驗動物

丹系杜長大配套系種豬，來自廣西、廣東、海南、湖南、云貴川等省（區）的21個規模化、封閉式豬舍、自動化料線飼養種豬場，存欄數600～7000頭。2022年3—5月采樣。

1.2 方法

1.2.1 鼻拭子和喉拭子的采樣效果比較

確定流行病學調查的采樣方法，首先在本次調查的豬場A和B的后備舍，分別對14頭和16頭觀察到有咳嗽癥狀的后備豬進行采樣，每頭豬同時采集鼻拭子和喉拭子。通過實時熒光定量PCR檢測比較鼻拭子和喉拭子的采樣效果。

鼻拭子的采樣方法：參考《GB/T35909—2018豬肺炎支原體PCR檢測方法》，使用一次性植絨鼻拭子采集豬鼻拭子樣品。將豬保定后，用拭子輕輕插入鼻腔，稍作拐彎，繞過骨狀瓣膜，與鼻中隔平行方向插入2～5cm，輕輕旋轉拭子，當豬出現噴嚏反射后，輕輕抽出拭子，將鼻拭子樣品端置于含有2mL PBS溶液的采樣管中^[15]。

喉拭子的采樣方法：參考Pieters的采樣方法，使用豬用一次性植絨咽拭子采集豬喉拭子樣品。將豬保定后，將拭子沿豬上顎伸入喉部20～30cm，待豬出現聲調變化，輕輕旋轉后抽出拭子^[11]。將拭子沿頭部斷點折斷置于含有2mL PBS溶液的采樣管中。將樣品置于裝有冰袋的泡沫箱運送至實驗室，隨后立即提取DNA并進行實時熒光定量PCR檢測。

1.2.2 樣品DNA的提取

采用水煮法提取細菌DNA：將樣品振蕩15s后，4℃靜置2h。從采樣管底部吸取1mL沉淀混合液，轉移至新的1.5mL離心管，室溫下13000r·min^-1離心20min。棄上清，沉淀用50μL滅菌水重懸，于干式恒溫器100℃加熱10min后立即置于-20℃冰箱冷卻5min。室溫下13000r·min^-1離心5min，將上清小心轉移至新的1.5mL離心管，-20℃保存作為DNA模板。

1.2.3 樣本量的確定

以簡單隨機抽樣結合分層抽樣的方法確定樣本量^[16]。取50%預期流行率、90%置信區間、10%絕對精度下的近似樣本量，則每個豬場采集70份樣品。根據相關研究報道，母豬在哺乳期可通過鼻對鼻直接接觸將Mhp傳播給仔豬，并且隨著胎次的增長，這一傳播的比例會降低^[17-18]，因此結合分層抽樣，將各場樣本量按胎次進一步分為“0～1胎母豬”和“≥2胎母豬”兩個層次，并按各場不同胎次母豬存欄量占比計算分層樣本量。

1.2.4 實時熒光定量PCR

本實驗室根據GenBank上發布的豬肺炎支原體ES-2株（GenBank登錄號：NZ_CP038641.1）的p36全基因序列設計引物及探針，建立了探針法實時熒光定量PCR檢測方法。引物及探針序列如下，P36real-F：5′-GATCGGAAAATCCAGAAGCAT-3′，P36real-R：5′-GATTAGTGTCTCCAGTTATGAATATA-3；P36probe：5′-FAM-TTACAGCGGGAAGACCACAAAAACC-BHQ1-3′。產物大小：242bp；引物及探針由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。

PCR擴增體系：總體積20μL，10μL的2×AceQ Universal U+Probe Master Mix，上下游引物各0.4μL，探針0.5μL，模板2μL，ddH₂O補至20μL。參考AceQ Universal U+Probe Master Mix V2說明書設置PCR擴增程序：37℃污染消化2min；95℃預變性5min；95℃變性10s，60℃一步退火延伸30s，共45個循環。退火延伸階段采集FAM熒光。

1.2.5 分子流行病學分析

從實時熒光定量PCR檢測的陽性樣品中篩選出可用于分子流行病學分析的樣品（Ct值＜30），參考發布于PubMLST在線數據庫的方法，利用3個管家基因（adk、rpoB、tpiA）進行豬肺炎支原體的分子流行病學分析^[19]。為提高測序的準確性和簡便性，根據NCBI數據庫中發布的ES-2株全基因組序列（GenBank登錄號：NZ_CP038 641.1），利用Primer-BLAST重新設計了管家基因的擴增引物和測序引物。為了更準確地評估流行菌株的分子流行病學特征，本研究還選擇了1個保守基因（p36基因全長），和2個非保守基因（p97基因R1編碼區和p146基因多絲氨酸重復序列編碼區）進行核苷酸和氨基酸序列分析（表1）。

PCR擴增體系：總體積50μL，25μL的2×Phanta Max Buffer，1μL的dNTP Mix，上下游引物各3μL，1μL的Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase，模板5μL，ddH₂O補至50μL。反應程序：95℃預變性5min；95℃變性15s，59℃退火15s，72℃延伸60s，40個循環；72℃延伸5min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。陽性樣品送武漢金開瑞生物工程有限公司測序。將管家基因的測序結果提交至PubMLST數據庫，獲取每個管家基因的等位基因號和ST。使用MEGA、BioEdit和Jalview等軟件分析測序結果。

2 結 果

2.1 鼻拭子和喉拭子的采樣效果比較

實時熒光定量PCR檢測結果可見，豬場A喉拭子樣品的檢出率為100.00%，鼻拭子樣品的檢出率為35.71%；豬場B喉拭子樣品的檢出率為18.75%，鼻拭子樣品的檢出率為0.00%; 綜合2個豬場的檢測結果，鼻拭子樣品的檢出率為16.67%，喉拭子樣品的檢出率為56.67%。同時，喉拭子樣品比鼻拭子樣品的Ct值低（表2）。對于同一頭豬進行Mhp活體采樣，喉拭子比鼻拭子的敏感性更高，且能收集到更多的病原。由此確定豬用一次性植絨咽拭子采集豬喉拭子為本研究的采樣方法。

2.2 病原檢測情況

通過實時熒光定量PCR檢測，本研究掌握了各個種豬場Mhp的感染狀況（表3）。共收集到來自21個種豬場的1478份母豬喉拭子樣品，其中檢出陽性83份，檢出率為5.62%；有14個豬場檢出陽性，場檢出率為66.67%。分層抽樣結果顯示，647份0～1胎母豬樣品檢出陽性65份，檢出率為10.05%；831份≥2胎母豬樣品檢出陽性18份，檢出率為2.17%。盡管各豬場的免疫程序中包括了Mhp滅活疫苗，但是Mhp的感染廣泛存在。

雖然有2/3的豬場是陽性，但是陽性豬場的感染壓力較小，檢出率為1.39%～18.57%。按照胎次來看，各場的0～1胎母豬檢出率比2胎以上母豬的要高（圖1）。這說明Mhp的感染與胎次有關，低胎次母豬更易感。

2.3 多位點序列分型

從“2.2”中的陽性樣品篩選出可用于分子流行病學分析的樣品，來自7個不同豬場（豬場A/B/I/M/O/P/T）共12份，擴增管家基因、p36基因全長、p97基因R1編碼區和p146基因多絲氨酸重復序列編碼區。其中，除樣品O18和P32的p36基因擴增失敗外，其他全部擴增成功。

將管家基因的測序結果提交PubMLST在線數據庫獲取等位基因號和序列類型（ST）。結果顯示，這7個陽性豬場的流行菌株均為序列類型ST128。根據MLST結果構建系統發育樹，采用ClustalW算法比對管家基因的串聯序列，以鄰接法（neighbor-joining method）、Kimura兩參數模型（Kimura2-parameter model）構建系統發育樹，自展1000次，并與來自于NCBI數據庫的豬肺炎支原體參考菌株序列：J株（GenBank登錄號：NC_007295.1），232株（GenBank登錄號：NC_006360.1），ES-2株（GenBank登錄號：NZ_CP038641.1），168株（GenBank登錄號：NC_017509.1），7448株（GenbBank登錄號：NC_007332.1）進行比較，發現ST128菌株與ES-2株處于同一分支（圖2）。

2.4 分子流行病學分析

將p36基因全長、p97基因R1編碼區和p146基因多絲氨酸重復序列編碼區的測序結果分別進行ClustalW算法比對，并構建核苷酸序列距離矩陣。不同豬場流行菌株之間，p36基因全長的核苷酸序列相似性為100.0%；p97基因R1編碼區和p146基因多絲氨酸重復序列編碼區的核苷酸序列相似性較高，分別為86.5%～100.0%和98.5%～100.0%。但與J株等具有代表性的菌株相比，豬場流行菌株具有更高的變異水平。

將根據支原體密碼表翻譯后的P97R1區和P146多絲氨酸重復區的氨基酸序列進行ClustalW比對，并通過Jalview軟件將結果可視化。統計兩種蛋白的重復特征次數，12個臨床分離株P97R1區的AAKPV（E）重復次數為12次或14次，P146蛋白多絲氨酸重復次數為17或18次，且序列比對結果均高度相似，但與參考菌株相比差異較大（圖3）。

3 討 論

Mhp在全球范圍內廣泛分布，但在我國的流行病學相關報道較少，且缺乏在豬場大群體中的流行數據。臨床通常采集屠宰豬的肺病變樣品或病死豬的氣管肺泡灌洗液，進行PCR檢測和系統發育分析^[7，20]。Mhp的病原學檢測結果與樣品來源的選擇有很大相關性。Mhp定植于氣管、支氣管等呼吸道纖毛上皮細胞，而典型的肉樣病變位于肺尖葉、心葉、中間葉等部位。因此獸醫通常采集病變肺的氣管/支氣管拭子或肉變區組織勻漿進行PCR檢測，檢出率可達100%；與氣管/支氣管拭子相比，肺組織勻漿通常不可能出現假陰性結果，是最理想的樣品類型^[21]。目前有研究證明各種活體診斷樣品采集類型中喉拭子最為可靠，尤其適用于感染早期的診斷，但是有關報道較少。本研究進一步比較了鼻拭子和喉拭子的采樣效果。對于觀察到咳嗽癥狀的豬，喉拭子樣品的檢測敏感性和一致性更高。根據Mhp的致病機制，病原主要定植的部位是氣管、支氣管的纖毛，因此使用植絨拭子在此部位采樣，比在鼻腔采樣可收集到更多的病原。

Mhp感染率根據調查方法、樣本選擇、采樣時間的不同，所獲得的流行病學調查結果不同，本研究通過科學的獸醫流行病學方法確定了合理的樣本量，收集了1478份活體喉拭子樣品，獲得豬肺炎支原體在豬群中的活體感染狀況，但國內外的相關Mhp活體樣本流行病學相關報道較少。本研究與以往國內外對Mhp的感染狀況調查研究相比，制定了科學的調查方案，并獲得了較為真實反映規模化種豬場Mhp感染狀況的數據。調查結果顯示，在21個豬場中，Mhp的流行率從0.00%～18.57%不等，場檢出率為66.67%，盡管各場的免疫程序使用了Mhp疫苗，但感染仍廣泛存在。本研究調查的21個規模化種豬場中有2/3是陽性場，但是陽性場的感染壓力較小。這與Calsamiglia和Pijoan^[17]及Fano等^[18]的研究結果一致，母豬在哺乳期可通過鼻對鼻直接接觸將Mhp傳播給仔豬，并且母豬散播Mhp至鼻腔分泌物的比例隨胎次的增加而降低。本研究進一步證實了低胎次母豬對Mhp的易感性更高，其所產仔豬在哺乳階段也更容易通過母子直接接觸感染該病原。因此，低胎次母豬和哺乳期仔豬是Mhp防控的兩個關鍵群體。提高對低胎次母豬和哺乳期仔豬的生產管理水平或許可以改善Mhp的控制。根據以上研究發現，分胎次生產似乎是降低斷奶時豬肺炎支原體流行率的有效措施^[22]。此外，在妊娠末期為母豬接種疫苗既能減少母豬對后代的傳播，又能通過母體免疫力為仔豬提供保護^[23]。但是這一策略還需要更多的數據來驗證。

本研究通過重新設計引物，優化了MLST流程，在PCR擴增管家基因后直接對產物測序即可，無需構建載體測序。MLST分型表明，來自7個豬場的12個流行菌株具有相同的序列類型（ST128）。Zhang等^[7]于2018—2020年檢測為陽性的26個豬群中，ST128的豬群占比最多（23.08%），分布于江蘇、廣東、河南、廣西等4個省份，表明我國Mhp基因型具有一定的獨特性，因此ST128可能是我國的主要流行型。此外通過構建系統發育樹，發現ST128菌株與目前國內流行的ES-2株親緣關系較近。這提示臨床獸醫在進行Mhp免疫工作時，或許可以選擇相似性較高的疫苗菌株以提高免疫效果。

MLST是一種成熟且常用的細菌基因分型方法。但是由于管家基因的保守性，當樣品來源較為單一時，MLST缺乏高度精確的分型分辨率。本研究進一步選擇了一個保守基因p36和兩個非保守基因p97及p146，進行核苷酸和氨基酸序列分析，以彌補MLST分辨率的不足。對于非保守的p97和p146基因分析表明，其黏附蛋白P97R1區和P146多絲氨酸重復區的氨基酸序列在不同豬場間差異很小。這提示各豬場流行的菌株可能出自同一來源。進一步調查發現，豬場A的母豬是從某種豬公司引種的，其余6個豬場（B、I、M、O、P、T）都是從A場引種的，進一步證明了Mhp可隨引種等生產行為在不同豬場間、甚至跨區域傳播。生豬調運和引種是導致陰性豬群感染Mhp的重要因素。

4 結 論

本研究通過鼻拭子和喉拭子采樣效果的比較，以進一步驗證了喉拭子是Mhp的病原學檢測更靈敏且有效的活體樣品類型。通過病原檢測和分子流行病學分析，掌握了2022年中國南方部分地區規模化種豬場Mhp的感染狀況和流行菌株的遺傳變異特征，加深了獸醫臨床對Mhp流行特征的認識，豐富了流行病學調查和分子流行病學分析的技術手段，為Mhp的防控和凈化工作奠定理論基礎。

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（編輯 白永平）