三株新型鴨源微RNA病毒分離毒株的全基因組序列分析

摘 要：分離新型鴨源微RNA病毒進行全基因組測序并進行遺傳進化分析。對本實驗室2021年不同來源的種鴨和肉鴨病料進行PCR檢測，初步確定存在一種未知分類的新型微RNA病毒感染。取病死鴨病料組織處理后接種SPF雞胚分離病毒，設計引物對分離到的病毒進行PCR檢測，通過重疊PCR方法進行全基因組擴增測序。將分離病毒各蛋白氨基酸序列兩兩比對，同時選取GenBank數據庫中微RNA病毒代表毒株序列繪制系統進化樹，并對主要蛋白P1、2C、3D序列比對分析。結果顯示：共分離到三株微RNA病毒，分別命名為21101株、21016株和21075株（GenBank登錄號：OQ927377～OQ927379）。基因組長度分別為7445、7445和7447bp，均包含一個編碼2141個氨基酸的開放閱讀框（ORF），可劃分為P1、P2、P3三個部分，符合微RNA病毒序列特征。基于全基因組序列遺傳進化分析發現，三株分離病毒與本實驗室前期分離的Duck/FC22/China/2017（GenBank登錄號：MN102111）毒株及上海獸醫研究所分離的Duck/AH15/CHN/2015（GenBank登錄號：MT681985）位于同一分支，與鴨甲型肝炎病毒（Duck hepatitis Avirus，DHAV）遺傳距離最近。分離的三株鴨源微RNA病毒進行全基因組測序及遺傳進化分析發現，與目前已知的兩株微RNA毒株為同一類新型鴨源微RNA病毒。

關鍵詞：新型微RNA病毒；分離鑒定；基因組測序；遺傳進化分析

中圖分類號：S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3075-10

收稿日期：2023-10-07

基金項目：中韓國際合作項目（122014-2）；山東省家禽產業技術體系（SDAIT-11-01）；國家自然科學基金（32002286）；山東省自然科學基金（ZR2020QC195）

作者簡介：李繼桐（1998-），男，回族，山東棗莊人，碩士生，主要從事禽病學研究，E-mail：lijitong618@163.com

*通信作者：李玉峰，主要從事禽病學研究，E-mail：dicpd@163.com

Isolation and Identification of Novel Picornavirus from Ducks and Whole Genome

Sequence Analysis

LIJitong^1，2，ZHUTong¹，LüJunfeng¹，GAOYuehua¹，HUFeng¹，YUKexiang¹，

SONGMinxun¹，WANGJianlin²，LIYufeng^1*

（1.Institute of Poultry，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan250100，China;

2.School of Animal Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109，China）

Abstract：The aim of this study was to isolate novel duck-derived picornavirus for whole genome sequencing and genetic in order to perform whole genome sequencing and genetic evolutionary study.In2021，we identified the presence of an unknown class of novel picornavirus infection in the diseased materials of breeding ducks and meat ducks submitted for inspection.By inoculating the diseased material into specific pathogen-free（SPF）chicken embryos，we isolated the virus.And the isolated viruses were further detected by PCR with primers designed from sequences available and sequenced the whole genome by overlapping PCR method.The amino acid sequences of each protein of the isolated virus were compared.At the same time，the sequences of the representative strains of small RNA viruses in the GenBank database were selected to draw the phylogenetic tree，and the sequences of the main proteins P1，2C and3D were analysed in comparison with each other.Three small RNA virus strains were isolated and named21101，21016and21075（GenBank ID：OQ927377-OQ927379），with genome lengths of7445，7445，and7447bp.These sequence encompasses an open reading frame（ORF）that encodes atotal of2141amino acids.The ORF can be divided into three distinct parts：P1，P2and P3.These protein divisions align with the characteristic features observed in picornaviruses.The genetic evolutionary analysis，conducted through the utilization of whole genome sequences，demonstrated that the three isolates were positioned within the same branch as the Duck/FC22/China/2017strain（GenBank ID：MN102111）previously separate inour laboratory and Duck/AH15/CHN/2015strain（GenBank ID：MT681985）at the Shanghai Veterinary Research Institute.Furthermore，these isolates exhibited the highest degree of genetic similarity to the Duck hepatitis Avirus（DHAV）.Three strains of duck-derived picornavirus were isolated，and whole genome sequencing and genetic evolution analysis revealed that the three isolated viruses belong to the same class of the two currently known novel duck-derived picornavirus.

Key words：novel picornavirus; isolation and identification; genome sequence; genetic evolutionary analysis

*Corresponding author：LI Yufeng，E-mail：dicpd@163.com

微RNA病毒（Picornavirus）屬于微RNA病毒科，為單股正鏈RNA病毒，病毒衣殼蛋白呈二十面體^[1-3]，病毒粒子直徑約為30nm，在RNA病毒中直徑最小且無囊膜。根據病毒粒子的物理特性及基因組結構等特征將微RNA病毒分為68個屬158個種^[4-5]。其中，腸道病毒屬的脊髓灰質炎病毒、腸道病毒；肝病毒屬的甲型肝炎病毒；口蹄疫病毒屬的口蹄疫病毒；心病毒屬的腦心肌炎病毒；柯薩奇病毒屬的柯薩奇A型病毒、柯薩奇B型病毒是微RNA病毒科的典型代表。目前來自禽類的微RNA病毒至少有16種，劃分為8個屬^[6]。一些禽類來源的微RNA病毒尚未被歸類為一個屬^[7-10]。到目前為止，已報道的鴨源微RNA病毒有4種，即鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis Avirus，DHAV）（包括DHAV-A、DHAV-B和DHAV-C）^[11-13]、禽腸病毒（avian sapelovirus1，ASV-1）^[14]、鴨梅格里病毒（duck megrivirus，DuMV）^[6]和鴨類禽肝病毒（duck aalivirus，DuAV）^[15]，分別屬于Avihepatovirus、Sapelovirus、Megrivirus和Aalivirus。微RNA病毒基因組由5′非編碼區、一個大的開放閱讀框和3′非編碼區及末端一個poly A尾組成，編碼一個多聚前蛋白，并由自身編碼的蛋白切割成3個前體蛋白，即P1、P2和P3蛋白。其中，P1為結構蛋白，包括VP0、VP3和VP1蛋白；P2和P3均為非結構蛋白，P2包括2A、2B和2C蛋白；P3包括3A、3B、3C和3D蛋白。各蛋白分工協作參與病毒各項生命活動，比如VP1是主要的免疫原性蛋白^[16]，可產生特異性的中和抗體，在致病、毒力等方面有重要作用^[17-19]。2A蛋白對于不同成員有不同的生物學功能^[20]，比如其可促進細胞凋亡^[21-22]、促進病毒RNA的復制^[23-25]和抑制宿主細胞蛋白的合成^[26]。2C蛋白具有AAA+族解旋酶活性^[27-29]，同時可利用自噬通路入侵細胞^[30-31]以及誘導細胞炎癥反應和細胞凋亡^[32-33]。不同的微RNA病毒蛋白功能略有不同，使得不同病毒在感染動物后引起的發病癥狀也不盡相同。微RNA病毒家族成員眾多，近年來不斷有新病原被發現。本實驗室從不同來源的鴨群中分離獲得三株病毒，經全基因組測序和分析發現均屬于同一種未確定分類地位的新型微RNA病毒，現報道如下。

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

2021年，本實驗室共接收來自泰安及德州三家不同鴨場送檢病料，發病鴨均表現扭頸、癱瘓等神經癥狀，取病鴨肝、腎及腦等組織進行實驗室檢測和病毒分離。

1.1.2 主要試劑

AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒購自AXYGEN公司；2×Taq PCR StarMix試劑盒購自康潤誠業生物科技（北京）公司；PrimeScript IV1st strand cDNA Synthesis Mix試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司；Phanta HS Super-Fidelity DNA Polymerase試劑盒購自諾唯贊生物科技（南京）有限公司；EasyScript^?One-Step RT-PCR SuperMix試劑盒購自北京全式金生物技術股份有限公司。

1.1.3 引物的設計及合成

本試驗所用鴨常見病原檢測通用引物均由本實驗室根據各病毒保守區域設計，包括鴨甲型肝炎病毒1型（duck hepatitis Avirus1，DHAV-1）、鴨甲型肝炎病毒3型（duck hepatitis Avirus3，DHV-3）、鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus，DTMUV）、鴨星狀病毒（duck astrovirus，DAstV）、番鴨細小病毒（muscovy duck parvovirus，MDPV）、禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）、番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus，MDRV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）、鴨瘟病毒（duck plague virus，DPV）、微RNA病毒（Picornavirus）引物（表1），其中，微RNA病毒特異性引物參照Duck/FC22/China/2017（GenBank登錄號MN102111）和Duck/AH15/CHN/2015（GenBank登錄號MT681985）基因組序列設計（表2），各引物均交由北京華大公司合成。

1.2 方法

1.2.1 可疑病原的核酸檢測

采集病鴨的肝、腎等組織約0.5g，剪碎后按1∶4比例加入PBS，研磨勻漿反復凍融3次后8000r·min^-1離心5min，取上清液經0.22μm無菌過濾器過濾除菌分裝后于-80℃凍存備用。按照病毒基因組提取試劑盒操作說明提取上清液中的DNA及RNA，取病毒RNA核酸混合物使用反轉錄試劑盒進行反轉錄反應。將獲得的DNA及cDNA樣品凍存于-20℃備用。以反轉錄獲得的cDNA樣品為模板使用DHAV-1、DHV-3、DTMUV、DAstV、MDPV、AIV、MDRV、NDV、DPV、Picornavirus引物進行PCR擴增檢測。PCR擴增體系20μL，其中，2×PCR Mix預混液10μL，上下游引物各1μL，模板2μL，ddH₂O6μL。按照95℃預變性3min；95℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸20s共30循環；72℃延伸2min條件進行PCR反應。將獲得的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.2 病毒的分離鑒定

將“1.2.1”中經PCR鑒定為陽性的樣品經0.22μm濾膜過濾后，接種9日齡SPF雞胚3枚，每枚雞胚接種100μL，同時設置陰性對照，石蠟封孔后置于37℃溫箱孵育。逐日觀察雞胚健康狀況，棄掉24h內死亡的雞胚，收集接毒后7d內死亡雞胚尿囊液。將病毒在SPF雞胚上連續傳代3次，收集死亡雞胚尿囊液，離心取上清凍存于-80℃備用。同時為鑒定分離到的病毒是否單一，提取第3代雞胚尿囊液核酸，反轉錄后按照“1.2.1”步驟進行常見禽類病原及特異性引物檢測，同時取尿囊液涂板檢測是否有細菌污染。

1.2.3 新型鴨源微RNA病毒全基因組測序

參照GenBank中已發表的Duck/FC22/China/2017毒株及Duck/AH15/CHN/2015毒株核酸序列設計引物用于擴增微RNA病毒全基因組序列，引物具體信息見表3。使用5′RACE及3′RACE試劑盒進行病毒基因組5′端及3′端擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至北京華大公司進行測序。

1.2.4 新型鴨源微RNA病毒全基因組序列分析

將“1.2.3”中測序結果使用SnapGene軟件進行拼接，確定其基因組構成，并比對分析各蛋白基因序列。通過檢索GenBank數據庫中近年來收錄的微RNA病毒代表毒株序列，使用BLAST比對分析所鑒定毒株與其他微RNA病毒間的同源性。通過MEGA5.0程序繪制進化樹，確認本次分離病毒的遺傳演化情況。

2 結 果

2.1 微RNA病毒的分離

提取三份病料核酸進行反轉錄后使用常見病原檢測引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，僅Picornavirus處出現特異性條帶條帶，其余病原引物均未擴增出特異性條帶。將鑒定為微RNA病毒陽性的三份病料處理后分別接種9日齡SPF雞胚各三枚，72h內接種雞胚均全身出血死亡，取各雞胚尿囊液接種LB固體培養基37℃溫箱過夜培養后無菌落出現。分離病毒分別命名為21101、21016和21075，取病毒感染死亡的雞胚尿囊液檢測確定微RNA病毒陽性后繼續傳代至第三代。提取死亡雞胚尿囊液核酸，使用常見鴨病原引物及微RNA病毒特異性引物進行RT-PCR擴增后產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，可見僅Picornavirus引物擴增出現特異性條帶，其他引物均未擴增到目的片段（圖1A、1B）。

2.2 新型微RNA病毒全基因組序列分析

三株微RNA病毒PCR產物進行測序驗證及序列拼接后確定病毒基因組長分別為7445、7445、7447bp。包含一個由6423個核苷酸組成的開放閱讀框（ORF），共編碼2141個氨基酸^[34]，GenBank登錄號分別為OQ927377～OQ927379。同所有微RNA病毒基因組結構一致，三株分離毒株ORF也劃分為P1、P2、P3三個部分，P1為結構蛋白，推測包括VP0、VP3和VP1蛋白，分別包含268、248、165個氨基酸；P2和P3均為非結構蛋白，P2包括2A、2B和2C蛋白，分別包含218、118、331個氨基酸；P3包括3A、3B、3C和3D蛋白，分別包含121、33、184、454個氨基酸（圖2）。

將三株病毒各蛋白氨基酸序列兩兩比對，2B、2C、3B、3C蛋白相似性為100%，其它蛋白相似性均在98%以上。其中，21101株第2016位氨基酸突變，21016株第1467位氨基酸突變，21075株分別于第151、160、278、309、352、373、597、701、725、1355、2018位氨基酸突變（表4）。選取GenBank數據庫中微RNA病毒代表毒株序列與三株新分離微RNA病毒主要蛋白P1、2C、3D序列比對分析，可知其與Aalivirus屬、Avihepatovirus屬成員關系相對較近，與Avihepatovirus屬P1蛋白氨基酸相似性為31%～37.3%；2C蛋白相似度為41.4%～44.5%；3D蛋白相似度為43.6%～44.9%（表5）。

2.3 新型微RNA病毒遺傳進化分析

基于全基因組繪制系統進化樹對三株微RNA病毒親緣關系進行分析，結果顯示21101株、21016株、21075株與微RNA病毒科中Avihepatovirus屬親緣關系較近，核苷酸相似性為53.8%～55.3%。與Aalivirus屬、Avisivirus屬等禽類微RNA病毒存在一定的遺傳距離，核苷酸相似性為52.6%、48.0%、51.1%。確定此次分離到的三株微RNA病毒同FC22、AH15共屬一個新的微RNA病毒分支（圖3）。

3 討 論

近年來國內禽類飼養廠數量大幅增加，疾病的發生頻率也逐年增高，相較于細菌病，病毒病的防治難度及失敗率較高。其中RNA病毒因基因組較易突變，對人類及動物的健康造成的危害極大。微RNA病毒是RNA病毒里的一個重要分支，可使人和動物中樞神經系統、心、肝、呼吸道和胃腸道產生疾病。禽源微RNA病毒分別屬于Avihepatovirus、Sapelovirus、Megrivirus和Aalivirus。以鴨甲型肝炎病毒（duck hepatitis Avirus，DHAV）為例，國內于1963年由黃均首次報道了鴨甲型肝炎（DVH）的發生^[35]。近年來，中國臺灣和韓國的學者相繼分離出了與Ⅰ型DHV相近的被稱為“臺灣新型”和“韓國新型”的DHV毒株，這些新的毒株與經典毒株之間不存在血清交叉中和反應^[36]，且“臺灣新型”和“韓國新型”毒株之間也無血清交叉中和反應^[37]。目前，根據基因組的遺傳進化關系，“經典型”“臺灣新型”和“韓國新型”分別對應鴨甲型肝炎病毒基因的A型、B型和C型^[38]。

2015年，我國部分櫻桃谷鴨群中出現一種新型疾病，感染此病毒的櫻桃谷鴨出現短喙、舌頭突出、生長遲緩及脛骨易骨折等癥狀，上海獸醫研究所從具有此臨床癥狀的鴨臟器中分離出一種新型鴨源微RNA病毒^[39]；本實驗室2017年于出現頸部扭曲和癱瘓等神經性癥狀的鴨子肝脾臟器中分離到一株全新的微RNA病毒，通過基因組序列及系統發育分析認為此株病毒同屬于新的鴨源微RNA病毒，兩株毒株在基因組遺傳進化關系上極為相似。通過分析兩株病毒基因組序列設計合成檢測此類微RNA病毒的通用引物，在山東地區新檢測出三株微RNA病毒，并基于全基因組測序進行序列比對及使用MEGA5.0繪制進化樹。此次分離的微RNA病毒與兩株已知鴨源微RNA病毒為同一種屬。親緣關系與Avihepatovirus屬的duck hepatitis Avirus（DHAV）相對較近，與Aalivirus屬、Avihepatovirus屬成員也有一定親緣關系。通過序列比對及進化樹分析三株新分離病毒雖與DHAV親緣關系較為接近，但其主要蛋白與DHAV相似度均小于50%。其中P1蛋白氨基酸相似性為31%～37.3%；2C蛋白相似度為41.4%～44.5%；3D蛋白相似度為43.6%～44.9%。故此類分離到的微RNA病毒極有可能屬于一類新的種屬。對分離病毒進行氨基酸比對發現21075株相較21101株、21016株突變較多且多數突變集中在VP3蛋白區域（278位R→K；309位D→E；352位T→N；373位A→V）。微RNA病毒的VP3蛋白的氨基端含有主要的抗原決定簇，可誘導機體產生保護性免疫反應^[40]，21075株在VP3區域的多位點突變可能會影響機體對病毒的特異性識別，應引起重視。通過本試驗檢測，似乎此類微RNA病毒感染正在國內零星發生。而目前對于該新型微RNA病毒的致病機制、流行規律及防控措施研究并不深入，后續還需對此類微RNA病毒進行細致探究以防出現大面積流行造成損失的情況發生。

4 結 論

本研究新發現并分離到三株微RNA病毒，分別命名為21101株、21016株和21075株（GenBank登錄號：OQ927377～OQ927379）。進行全基因組測序及遺傳進化分析發現，三株分離病毒與本實驗室先前發表的Duck/FC22/China/2017（登錄號MN102111）毒株及上海獸醫研究所分離的Duck/AH15/CHN/2015（GenBank登錄號：MT681985）位于同一分支，為同一類新型鴨源微RNA病毒。

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（編輯 白永平）