犬新孢子蟲miRNAs的鑒定與分析

摘 要：為鑒定犬新孢子蟲（Neospora caninum）特異表達的miRNAs，并研究其在宿主細胞中的表達情況，本研究收集N.caninum速殖子感染的山羊子宮內膜上皮細胞（caprine endometrial epithelial cells，EECs）24和48h的樣本，用Illumina高通量測序平臺和生物信息學分析犬新孢子蟲特異表達的miRNAs及其體外表達情況，并研究了一個上調的miRNA novel3_mature對犬新孢子蟲在山羊EECs增殖的影響。結果發現，共鑒定出3404個犬新孢子蟲特異表達的miRNAs（155個新預測miRNAs），其中77個（47個上調和30個下調）miRNAs顯著差異表達；隨機選取7個顯著差異表達的miRNAs進行實時熒光定量PCR分析，結果與高通量測序結果一致；預測分析發現61個miRNAs的3978個靶基因，功能富集分析發現這些靶基因可能主要參與MAPK信號通路、突觸導向、黏著斑、cMAP信號通路、鈣信號通路等；轉染novel3_mature的模擬物顯著促進犬新孢子蟲在山羊EECs中的增殖。犬新孢子蟲存在多個特異表達的miRNAs，其在蟲體增殖中發揮重要作用，研究成果為深入理解犬新孢子蟲胞內生存提供了新的思路。

關鍵詞：犬新孢子蟲；山羊子宮內膜上皮細胞；miRNAs；novel3_mature；增殖

中圖分類號：S852.723

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3085-09

收稿日期：2023-10-23

基金項目：國家自然科學基金（32373040）

作者簡介：李京宇（2000-），女，山東菏澤人，碩士，主要從事分子病原學和獸醫免疫學研究，E-mail：ljy@nwafu.edu.cn

*通信作者：趙光輝，主要從事分子病原學和獸醫免疫學研究，E-mail：zgh083@nwsuaf.edu.cn

Identification and Analysis of miRNAs of Neospora caninum

LIJingyu，CHENJinming，ZHANGMingyi，ZHAOShanshan，TAODeliang，

SONGJunke，YANGXin，FANYingying，ZHAOGuanghui^*

（College of Veterinary Medicine，Northwest Aamp;F University，Yangling712100，China）

Abstract：To identify specific expressed miRNAs of Neospora caninum and to investigate their expression in host cells，the samples of caprine endometrial epithelial cells（EECs）infected with tachyzoites of N.caninum at24and48h were collected.Specific expressed miRNAs of N.caninum and their in vitro expression were analyzed by using Illumina highthroughput sequencing technology and bioinformatics analysis.The effect of an up-regulated miRNA，novel3_mature，on the propagation of N.caninum in caprine EECs was also studied.The results showed that atotal of3404specific expressed miRNAs（155novel predicted miRNAs）of N.caninum were identified.Of them，77（47up-and30down-regulated）miRNAs were significantly differentially expressed.The consistent results were found with highthroughput sequencing by using quantitative real-time PCR analysis of seven significantly differentially expressed miRNAs randomly selected.Predictive analysis found3978target genes of61miRNAs.Functional enrichment analysis showed that these target genes were possible involved in MAPK signaling pathway，axon guidance，focal adhesion，cAMP signaling pathway，calcium signaling pathway.Transfection of novel3_mature mimics significantly promoted the propagation of N.caninum in caprine EECs.Many specific expressed miRNAs were encoded by N.caninum and they played important roles in the propagation of N.caninum，providing anovel way to understand the intracellular survival of N.caninum.

Key words：Neospora caninum; caprine endometrial epithelial cells; miRNAs; novel3_mature; propagation

*Corresponding author：ZHAO Guanghui，E-mail：zgh083@nwsuaf.edu.cn

犬新孢子蟲（Neospora caninum）可感染牛、羊、犬等多種動物，引起新孢子蟲病（neosporiasis），導致孕畜流產、死胎以及新生幼畜的運動障礙和神經系統疾病^[1]，給我國養殖業的發展造成較為嚴重的危害^[2]。但是，目前尚缺乏針對新孢子蟲病的特異性藥物和疫苗^[3]。犬新孢子蟲的發育階段包括包囊（cyst）、卵囊（oocyst）、速殖子（tachyzoite）、裂殖體（schizont）和配子體（gametophyte）^[1]，其中速殖子、內含緩殖子（bradyzoites）的包囊和孢子化卵囊是其感染性階段^[4]。目前，這些感染性階段與宿主的互作機制知之甚少。

miRNA是一類非編碼小分子RNA，大小約為22個堿基，主要通過與靶mRNA的3′非翻譯區（untranslated region，UTR）結合發揮負調控靶基因的表達^[5]，參與細胞增殖^[6]、分化^[7]、凋亡^[8]、遷移^[9]等眾多生理過程，也參與許多疾病的發生發展^[10]。研究發現，miRNAs不僅存在于宿主細胞，多種病原微生物也可以編碼miRNAs，其可通過調控病原或宿主的基因表達參與病原的致病和胞內生存^[11]。2021年，Liu等^[12]利用高通量測序技術對純化的犬新孢子蟲速殖子的miRNAs表達譜進行了研究，發現犬新孢子蟲速殖子編碼了300個miRNAs，包括10個與后生動物同源的miRNAs和290個新的miRNAs。本研究旨在利用高通量測序技術鑒定在宿主細胞中增殖的犬新孢子蟲特異表達的miRNAs，分析其表達情況，并初步分析犬新孢子蟲源miRNAs對蟲體胞內增殖的影響，為揭示犬新孢子蟲miRNAs對蟲體胞內生存的機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株與細胞

犬新孢子蟲NC-1株速殖子由中國農業大學劉群教授惠贈，非洲綠猴腎細胞（African green monkey kidney epithelial cells，Vero細胞）由西北農林科技大學齊雪峰教授惠贈，山羊子宮內膜上皮細胞（caprine endometrial epithelial cells，EECs）由西北農林科技大學靳亞平教授惠贈。

1.2 主要試劑和儀器

胎牛血清購自上海依科賽生物制品有限公司；高糖DMEM培養基、DMEM/F-12培養基購自上海源培生物科技股份有限公司；胰酶購自西安米鼠生物科技有限公司；Trizol購自美國A.G.Scientific公司；mirVana miRNA分離試劑盒購自美國Ambion公司；TruSeq小RNA樣品制備試劑盒購自美國Illumina公司；miRNA反轉錄試劑盒、TB Green Mix購自大連寶生物工程有限公司；opti-MEM培養基、Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

Nanodrop2000超微量分光光度計購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Agilent2100生物分析儀購自美國Agilent Technology公司；Illumina HiSeq XTen測序儀購自美國Illumina公司；PCR擴增儀購自杭州米歐儀器有限公司；實時熒光定量PCR儀購自西安天隆科技有限公司。

1.3 犬新孢子蟲的細胞培養

Vero細胞和山羊EECs分別用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養基和DMEM/F-12培養基培養，待細胞密度達到80%時按常規方法用胰酶消化傳代。犬新孢子蟲速殖子在Vero細胞中用含2%胎牛血清的高糖DMEM培養基中傳代培養。

1.4 樣品的制備與RNA提取

按照蟲體∶細胞=3∶1將犬新孢子蟲速殖子接種至山羊EECs，分別在感染24和48h收集細胞，命名為TZ_24 h和TZ_48 h，保存于Trizol中，每組三個生物學重復。利用mirVana miRNA分離試劑盒提取總RNA，通過Nanodrop2000超微量分光光度計測定總RNA濃度，Agilent2100生物分析儀檢測RNA的完整性，選取28S/18S≥0.7和RNA完整性數≥7的RNA樣品進行下一步分析。

1.5 小RNA文庫構建

每個樣品取1μg總RNA，用TruSeq小RNA樣品制備試劑盒構建小RNA文庫。首先在總RNA的3′和5′端連接接頭，反轉錄為cDNA進行PCR擴增，回收片段大小為140～160nt的PCR產物，構建小RNA文庫，在Agilent2100生物分析系統上使用DNA高靈敏度芯片評估文庫質量。

1.6 高通量測序和生物信息學分析

通過Illumina HiSeq XTen平臺對合格的小RNA文庫進行測序，獲得raw reads。隨后去除raw reads的接頭序列和含有N堿基的序列并進行Q20質控，獲得長度為15～41nt并且Q20達到80%及以上的高質量的clean reads。將clean reads分別與犬新孢子蟲基因組（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl？org=all-animal）和山羊基因組（http：//www.mirbase.org/cgi-bin/browse.pl？org=chi）進行比對，統計能比對上的reads及其比例。利用bowtie軟件將比對上的reads基于Rfam（version10.0）數據庫注釋rRNA、scRNA、Cis-reg、snRNA、tRNA等序列并過濾，獲得序列長度在15～24nt的RNA，將其與miRBase數據庫比對，分析已知miRNAs和新miRNAs，將同時在犬新孢子蟲基因組和山羊基因組比對上的miRNA去除，以分析犬新孢子蟲特異表達的miRNAs。

1.7 差異表達miRNAs的篩選與驗證

采用TPM（transcript per million）計算犬新孢子蟲特異miRNAs的表達量，使用Q值lt;0.05和log₂（fold change，FC）gt;0為標準，篩選顯著差異表達的miRNAs。

隨機挑選7個顯著差異表達的miRNAs進行實時熒光定量PCR驗證。分別收集犬新孢子蟲感染山羊EECs24和48h的細胞樣品，按照反轉錄試劑盒說明書進行miRNA的反轉錄，用加尾法設計引物（表1），以u6為內參，按照TB Green Mix說明書配制反應體系，反應程序：95℃10min；95℃15s，58℃30s，40個循環。每個樣品重復3次，采用2^-ΔΔCt法計算各miRNAs的相對轉錄水平。

1.8 顯著差異表達miRNAs的靶基因預測及功能分析

使用miranda（v3.3a）軟件進行miRNAs靶基因預測，閾值參數為S≥150、ΔG≤-126kJ·mol^-1和嚴格的5′種子配對。將預測的靶基因提交至基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數據庫進行功能富集分析。

1.9 顯著差異表達miRNAs對犬新孢子蟲體外增殖的影響

為探索犬新孢子蟲特異表達miRNAs對蟲體在山羊EECs中增殖的影響，本研究選取了一個上調的miRNA（novel3_mature），根據其序列由上海吉瑪制藥技術有限公司合成其模擬物novel3_mature mimics（5′-GCGCAUGCGCGUCAAGCCCUUCCU-3′）以及陰性對照control mimics（5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′），使用Lipofectamine2000分別將其轉染至山羊EECs，轉染24h后按照蟲體：細胞=3∶1感染犬新孢子蟲速殖子，在感染24和30h時記錄100個納蟲泡中速殖子的數量，以及含有2、4、8、16和32個速殖子的納蟲泡數量，進行3次生物學重復。

1.10 統計分析

采用GraphPad Prism5.0軟件（http：//www.graphpad.com）和Excel軟件分析數據，參數檢驗采用雙尾t檢驗，***表示Plt;0.001，差異極極顯著；**表示0.001lt;Plt;0.01，差異極顯著；*表示0.01lt;Plt;0.05，差異顯著。

2 結 果

2.1 犬新孢子蟲miRNAs鑒定

鑒定發現3404個犬新孢子蟲特異表達的miRNAs，包括3249個已知miRNAs和155個新預測的miRNAs。其中，犬新孢子蟲感染24h特異表達671個（包括658個已知和13個新預測）miRNAs，感染48h特異表達642個（包括571個已知和71個新預測）miRNAs，2091個（包括2020個已知和71個新預測）miRNAs在2個時間點均有表達。

2.2 犬新孢子蟲特異miRNAs差異表達分析

對比TZ_48 h與TZ_24 h分析發現，1739個（包括1691個已知和48個新預測）miRNAs差異表達，包括上調表達的885個miRNAs和下調表達的854個miRNAs。以Q值lt;0.05和log₂（fold change）gt;0為標準，篩選到77個（包括60個已知和17個新預測）顯著差異表達的miRNAs，包括47個顯著上調表達的miRNAs和30個顯著下調表達的miRNAs（圖1）。其中，17個新預測miRNAs均顯著上調表達（表2）。

2.3 顯著差異表達miRNAs的實時熒光定量PCR驗證

對隨機選取的7個顯著差異表達miRNAs的實時熒光定量PCR驗證顯示，與TZ_24 h組相比，TZ_48 h組樣品中的cfa-miR-219-3p、novel105_mature、novel114_mature和novel97_mature的轉錄顯著上調，而pma-miR-29d-3p、sha-miR-24和aca-let-7f-1-3p的轉錄顯著下調，與測序結果一致，表明測序數據可靠（圖2）。

2.4 顯著差異表達miRNAs的靶基因預測及其功能分析

對顯著差異表達的miRNA進行靶基因預測分析發現，其中61個miRNAs預測到3978個靶基因。

GO功能分析發現（圖3），這些靶基因共富集到6321個GO條目，其中生物過程包括調控Rho蛋白信號轉導、微管細胞骨架組織、調控微管形成過程和中間纖維細胞骨架組織等，細胞組分主要是橫紋肌肌球蛋白粗絲、細胞質膜等，主要分子功能與鈣調結合蛋白、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子活性、肌聯蛋白結合等有關。

KEGG通路富集分析發現（圖4），這些靶基因共富集于244個信號通路，主要包括MAPK信號通路、突觸導向、黏著斑、cMAP信號通路、鈣信號通路等。

2.5 novel3_mature對犬新孢子蟲體外增殖的影響

感染24h時，與轉染control mimics的對照組相比，轉染novel3_mature mimics組的山羊EECs中犬新孢子蟲速殖子數量顯著（Plt;0.05）增加，含有4個速殖子的納蟲泡數量顯著（Plt;0.05）減少。感染30h時，轉染novel3_mature mimics組的山羊EECs中犬新孢子速殖子數量極顯著（Plt;0.01）增加，含有8個速殖子的納蟲泡數量顯著（Plt;0.05）減少。這些結果表明，novel3_mature顯著促進犬新孢子蟲在山羊EECs中的增殖（圖5）。

3 討 論

本研究通過高通量測序技術鑒定出3404個犬新孢子蟲特異表達的miRNAs，其數量遠高于Liu等^[12]鑒定到的300個犬新孢子蟲速殖子miRNAs。Liu等直接收集蟲體樣本進行測序，而本研究收集蟲體和細胞混合樣本進行測序，通過與山羊基因組比對保留犬新孢子蟲特異表達的miRNAs，但此方法不能保證完全剔除山羊的miRNAs，且miRNA長度短，測序和分析可能存在誤差，因此本研究所獲得的犬新孢子蟲miRNAs的特異性有待進一步驗證。其次，本研究鑒定了犬新孢子蟲感染24和48h的樣本，存在不同時間點特異性表達的miRNAs，而Liu等鑒定犬新孢子蟲蟲體單一時間點樣本，獲得的miRNAs相對較少。

本研究發現了77個miRNAs在犬新孢子蟲感染山羊EECs的24和48h時顯著差異表達，為了探究這些差異表達miRNAs的功能，預測到了3978個靶基因，這些靶基因主要富集于調控Rho蛋白信號轉導、微管細胞骨架組織、調控微管形成過程、中間纖維細胞骨架組織、橫紋肌肌球蛋白粗絲、細胞質膜、鈣調結合蛋白、Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子活性、肌聯蛋白等GO條目，KEGG分析發現這些靶基因可能主要參與MAPK信號通路、突觸導向、黏著斑、cMAP信號通路、鈣信號通路等。其中GO功能和KEGG通路分析均富集到了鈣離子相關基因，已有研究表明鈣離子與犬新孢子蟲入侵、運動等生理活動相關^[13-14]。GO功能還富集到微管細胞骨架組織、調控微管形成過程和中間纖維細胞骨架組織等生物過程，這些都與細胞骨架系統有密切關系，而已有研究表明在與犬新孢子蟲高度同源的弓形蟲感染過程中，觸發宿主細胞骨架重塑是弓形蟲入侵宿主細胞并引起細胞線粒體向納蟲泡聚集所必需的^[15]。KEGG分析富集到MAPK等信號通路，而MAPK信號通路在犬新孢子蟲入侵中可能發揮正向調節作用^[13，16-17]。這些研究結果提示，犬新孢子蟲源miRNAs可能在犬新孢子蟲胞內生存過程中發揮重要的調節作用。

有研究表明，病原體源miRNAs在病原體與宿主相互作用中發揮重要功能。例如，人類皰疹病毒編碼的病毒微RNA（v-miR）可使形成口腔黏膜免疫的關鍵宿主細胞功能失調，進而加劇疾病的嚴重程度和進展^[18]；日本血吸蟲源miR-10靶向MAP3K7，下調NF-κB活性和Th2細胞分化和功能的關鍵轉錄因子的表達，部分解釋了血吸蟲病降低宿主Th2細胞效應的機制^[19]；肝片形吸蟲的fhe-miR-125b在感染時傳遞至巨噬細胞的Argonaut蛋白（Ago-2），負向調節炎性細胞因子的產生，可能與蠕蟲逃逸宿主早期免疫反應的機制有關^[20]；馬來布魯線蟲釋放的細胞外囊泡可下調宿主mTOR通路，以調節宿主抵御反應，可能有助于建立寄生蟲感染^[21]；多形螺旋線蟲所分泌細胞外囊泡中的miRNAs可被宿主細胞整合以調節宿主先天免疫反應相關基因的表達^[22]。本研究中，轉染novel3_mature的模擬物顯著促進犬新孢子蟲速殖子在山羊EECs中的增殖，為寄生蟲源miRNAs跨物種調控宿主細胞提供了依據。

4 結 論

本研究通過高通量測序技術成功鑒定了犬新孢子蟲速殖子感染山羊EECs24和48h蟲體特異表達的miRNAs，篩選出77個顯著差異表達miRNAs，并對篩選出的miRNAs進行了表達分析、靶基因預測和功能富集分析，發現了轉染novel3_mature模擬物顯著促進犬新孢子蟲在山羊EECs中的增殖。本研究結果為深入理解蟲體源miRNAs在犬新孢子蟲胞內生存中的作用及其機制提供了新思路。

參考文獻（References）：

[1]蔣金書.動物原蟲病學[M].北京：中國農業大學出版社，2000：294-295.

JIANG JS.Veterinary protozoology[M].Beijing：China Agricultural University Press，2000：294-295.（in Chinese）

[2]王建中，張 恒，李曉光，等.奶牛犬新孢子蟲流產診療防[J].中國乳業，2023（9）：18-27.

WANG JZ，ZHANG H，LI XG，et al.The diagnosis and treatment of Neospora caninum-induced abortion in cows[J].China Dairy，2023（9）：18-27.（in Chinese）

[3]梁馨一，葛冰潔，趙 鵬.抗新孢子蟲病藥物研究進展[J].吉林畜牧獸醫，2020，41（11）：11-12，14.

LIANG XY，GE BJ，ZHAO P.Research progress of anti-neosporiasis drugs[J].Jilin Animal Husbandry and Veterinary Medicine，2020，41（11）：11-12，14.（in Chinese）

[4]DUBEY JP，BUXTON D，WOUDA W.Pathogenesis of bovine neosporosis[J].J Comp Pathol，2006，134（4）：267-289.

[5]FILIPOWICZ W，BHATTACHARYYA SN，SONENBERG N.Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs：are the answers in sight？[J].Nat Rev Genet，2008，9（2）：102-114.

[6]CHENG LC，TAVAZOIE M，DOETSCH F.Stem cells：from epigenetics to microRNAs[J].Neuron，2005，46（3）：363-367.

[7]SUH MR，LEE Y，KIM JY，et al.Human embryonic stem cells express aunique set of microRNAs[J].Dev Biol，2004，270（2）：488-498.

[8]CIMMINO A，CALIN GA，FABBRI M，et al.miR-15and miR-16induce apoptosis by targeting BCL2[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（39）：13944-13949.

[9]LIU YS，LIN HY，LAI SW，et al.MiR-181b modulates EGFR-dependent VCAM-1expression and monocyte adhesion in glioblastoma[J].Oncogene，2017，36（35）：5006-5022.

[10]DE CORREIA MC，GJORGJIEVA M，DOLICKA D，et al.Deciphering miRNAs’action through miRNA editing[J].Int JMol Sci，2019，20（24）：6249.

[11]HE X，PAN WQ.Host-parasite interactions mediated by cross-species microRNAs[J].Trends Parasitol，2022，38（6）：478-488.

[12]LIU G，JIA LJ，SHAO QY，et al.MicroRNA profiling of Neospora caninum tachyzoites（NC-1）using ahigh-throughput approach[J].Parasitol Res，2021，120（6）：2165-2174.

[13]陶德良，趙姍姍，陳 曦，等.宿主抗新孢子蟲感染的免疫機制研究進展[J].動物醫學進展，2022，43（12）：104-108.

TAO DL，ZHAO SS，CHEN X，et al.Progress on immune mechanisms of hosts against infection with Neospora caninum[J].Progress in Veterinary Medicine，2022，43（12）：104-108.（in Chinese）

[14]LARSON ET，OJO KK，MURPHY RC，et al.Multiple determinants for selective inhibition of apicomplexan calcium-dependent protein kinase CDPK1[J].J Med Chem，2012，55（6）：2803-2810.

[15]吳 亮，王 曉，蘇丹華，等.弓形蟲入侵的宿主細胞骨架重塑觸發線粒體重新分布[J].中國人獸共患病學報，2015，31（11）：1001-1004.

WU L，WANG X，SU DH，et al.Cytoskeleton rearrangement and mitochondria re-distribution of host cells in Toxoplasma gondii invasion[J].Chinese Journal of Zoonoses，2015，31（11）：1001-1004.（in Chinese）

[16]MOTA CM，OLIVEIRA AC M，DAVOLI-FERREIRA M，et al.Neospora caninum activates p38MAPK as an evasion mechanism against innate immunity[J].Front Microbiol，2016，7：1456.

[17]LI S，GONG PT，ZHANG N，et al.14-3-3protein of Neospora caninum modulates host cell innate immunity through the activation of MAPK and NF-κB pathways[J].Front Microbiol，2019，10：37.

[18]NAQVI AR，SHANGO J，SEAL A，et al.Viral miRNAs alter host cell miRNA profiles and modulate innate immune responses[J].Front Immunol，2018，9：433.

[19]MENINGHER T，BARSHESHET Y，OFIR-BIRIN Y，et al.Schistosomal extracellular vesicle-enclosed miRNAs modulate host Thelper cell differentiation[J].EMBO Rep，2020，21（1）：e47882.

[20]TRAN N，RICAFRENTE A，TO J，et al.Fasciola hepatica hijacks host macrophage miRNA machinery to modulate early innate immune responses[J].Sci Rep，2021，11（1）：6712.

[21]RICCIARDI A，BENNURU S，TARIQ S，et al.Extracellular vesicles released from the filarial parasite Brugia malayi downregulate the host mTOR pathway[J].PLoS Negl Trop Dis，2021，15（1）：e0008884.

[22]BUCK AH，COAKLEY G，SIMBARI F，et al.Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity[J].Nat Commun，2014，5：5488.

（編輯 白永平）