一株牛呼吸道冠狀病毒的分離鑒定及部分生物學特征

摘 要：牛冠狀病毒（bovine coronavirus，BCoV）是引起牛呼吸道疾病和消化道疾病的重要病原之一。本研究旨在分離牛呼吸道冠狀病毒（BRCV）并研究其部分生物學特性。采集暴發(fā)呼吸道疾病的肉牛鼻拭子，經(jīng)熒光定量PCR鑒定為BCoV陽性。將陽性樣本接種人盲腸腺癌細胞（HCT-8），分離純化后，對引起細胞病變的病毒分離株的S和HE基因進行序列測定和系統(tǒng)發(fā)育分析，并將病毒分離株接種BALB/c小鼠進行致病性研究。結(jié)果顯示，成功分離到1株致細胞病變的毒株，經(jīng)熒光定量PCR、間接免疫熒光和電鏡觀察鑒定為BRCV，蝕斑純化后計算病毒TCID₅₀為10^-8.46·0.1mL^-1。S基因和HE基因序列分析表明兩種基因均發(fā)生重組事件；S蛋白具有2個獨特的氨基酸突變（A33G和A975V），分別位于S1亞基的受體結(jié)合域和S2亞基；HE基因具有2個獨特的氨基酸突變（L235R和L365F），分別位于凝集素域和近膜端域。分離株對4周齡BALB/c小鼠具有較強的致病性，能夠引起小鼠呼吸加快和腹瀉等臨床癥狀，剖檢和組織病理學顯示肺和腸道出血，病毒主要分布在肺和腸組織，以肺組織中病毒載量最高。本研究首次在國內(nèi)肉牛中分離到1株BRCV，S和HE基因分子有獨特氨基酸突變，成功建立了小鼠感染模型，為進一步研究BCoV的生物學特性和遺傳進化提供了參考。

關(guān)鍵詞：牛呼吸道冠狀病毒；S基因；HE基因；小鼠；致病性

中圖分類號：S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3094-11

收稿日期：2023-07-24

基金項目：西南民族大學“雙一流”項目資助（XM2023014）；“十四五”國家重點研發(fā)計劃課題（2021YFD1600203）

作者簡介：班瑪王清（1997-），男，藏族，四川壤塘人，碩士生，主要從事病原快速診斷技術(shù)研究，E-mail：1121337057@qq.com

*通信作者：湯 承，主要從事動物病原生物學研究，E-mail：tangcheng101@163.com，Tel：028-85528276

Isolation，Identification and Partial Biological Characteristics of

a Bovine Respiratory Coronavirus

BAN MA Wangqing^1，2，CHENXi¹，YUEYi¹，SUYurong¹，YUEHua¹，TANGCheng^1*

（1.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Southwest Minzu University，

Chengdu610041，China; 2.Animal Disease Prevention and Control Center of

Aba Prefecture，Sichuan Province，Aba624011，China）

Abstract：Bovine coronavirus（BCoV）is one of the important pathogens causing respiratory and digestive tract diseases in cattle.The objective of this study was to isolate and investigate its partial biological characteristics of the bovine respiratory coronavirus（BRCV）.Nasal swabs were collected from beef cattle with outbreak of respiratory diseases，and the samples tested positive for BRCV by real-time qPCR were inoculated into human cecal adenocarcinoma cells（HCT-8）for virus isolation and purification.Then sequencing and phylogenetic analysis were performed on the Sand HE gene of the isolates which could cause cytopathic effect（CPE）.Furthermore，the pathogenicity of the BRCV isolate was evaluated in BALB/c mice.The results showed that one strain exhibiting noticeable CPE was successfully isolated，and was confirmed as BRCV through real-time qPCR，indirect immunofluorescence（IF）assay and transmission electron microscopy（EM）.After plaque purification，the TCID₅₀of the BRCV isolate was10^-8.46·0.1mL^-1.The complete Sand HE gene sequences of the isolate were successfully obtained，and recombination events were observed in both genes.Comparative analysis with all available Sand HE genes in GenBank revealed two unique amino acid（aa）mutations（A33G and A975V）in the Sprotein，which were located in the S1subunit receptor binding domain and S2subunit，and HE gene had two unique amino acid mutations（L235R and L365F），which were located in the lectin domain and near membrane terminal domain，respectively.The BRCV isolate demonstrated strong pathogenicity in4-week-old BALB/c mice，causing clinical symptoms such as accelerated respiration and diarrhea.Postmortem examination and histopathological analysis revealed hemorrhage in lung and intestinal tissues.Tissue distribution analysis revealed that the virus predominantly localized in the lung and intestinal tissues，with the highest viral load observed in the lung tissue.This study reports the first isolation of aBRCV from beef cattle with respiratory disease outbreak in China.The Sand HE proteins of the isolate exhibit unique amino acid mutations.Moreover，a mouse infection model was successfully established，providing avaluable reference for further investigation into the biological characteristics and genetic evolution of BCoV.

Key words：bovine respiratory coronavirus; S gene; HE gene; mouse; pathogenicity.

*Corresponding author：TANG Cheng，E-mail：tangcheng101@163.com

牛冠狀病毒（Bovine coronavirus，BCoV）為不分段的單股正鏈RNA病毒，屬于套病毒目（Nidoviraes），冠狀病毒科（Coronaviridae），β冠狀病毒屬（β-Coronavirus）成員^[1]。BCoV具有肺腸雙嗜性^[2]，是引起牛呼吸道疾病和消化道疾病的重要病原之一^[3]。BCoV在全世界廣泛流行，對養(yǎng)牛業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失^[4]。BCoV基因組全長約31000bp，可編碼5種主要結(jié)構(gòu)蛋白：核衣殼蛋白（N）、跨膜蛋白（M）、血凝素/酯酶蛋白（HE）、刺突蛋白（S）和小膜蛋白（E）^[1，5]。BCoV的S蛋白具有受體識別功能、抗原性和免疫原性，對病毒與細胞的結(jié)合及病毒對細胞的侵入具有重要作用^[1，5]。S蛋白分為S1和S2兩個亞基：S1是球狀亞基有兩個主要功能結(jié)構(gòu)域，分別是受體結(jié)合域（S1-NTD）和免疫反應(yīng)域（S1A和S1B），負責病毒與宿主細胞受體結(jié)合、誘導中和抗體表達和血凝素活性；S2是跨膜亞基有兩個主要功能結(jié)構(gòu)域，分別是第一疏水域（HP）和七肽重復（HR-N和HR-C），可以促進病毒和宿主膜的融合，從而使病毒進入宿主細胞^[5]。HE蛋白結(jié)構(gòu)主要包括了近膜端域（MP）、凝集素域（R）和乙酰酯酶域（E），具有受體識別和受體破壞功能，還具有凝集作用和誘導產(chǎn)生中和抗體的能力，對病毒初期感染具有重要作用^[6]。BCoV的S基因的重組事件已經(jīng)廣泛報道^[7]。本實驗室首次發(fā)現(xiàn)HE重組毒株并證實該重組毒株已經(jīng)在我國部分地區(qū)腹瀉奶牛和牦牛中流行^[8-9]。事實上，冠狀病毒S基因和HE基因的重組和氨基酸突變在病毒的進化過程中發(fā)揮著重要作用，可能導致病毒毒力和傳播速度的改變，也可能引起新型病毒出現(xiàn)和跨種間傳播^[10-14]。

根據(jù)臨床癥狀及采樣部位不同，BCoV分為牛呼吸道冠狀病毒（bovine respiratory coronavirus，BRCV）和牛腸道冠狀病毒（bovine enteric coronavirus，BECV）^[2，15-16]。Saif等^[17]用BECV分離株感染犢牛后能夠引起明顯腹瀉癥狀和腸道病變，但沒有出現(xiàn)任何呼吸道癥狀；Soules等^[18]用BRCV分離株感染犢牛后能夠引起明顯腹瀉和呼吸加快，且出現(xiàn)明顯的肺腸病理變化。目前，國內(nèi)關(guān)于BECV的分離已有報道^[19-22]，然而沒有關(guān)于BRCV的分離報道及其相關(guān)致病性的研究。因此，本研究旨在從患有牛呼吸道疾病綜合征（bovine respiratory disease syndrome，BRDC）的犢牛中分離鑒定BRCV，分析S基因和HE基因分子特征并進行BALB/c小鼠致病性試驗，為BRCV的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本、細胞系和實驗動物

2020年11月四川省某肉牛場暴發(fā)犢牛呼吸道疾病，患畜為3～4月齡犢牛，主要表現(xiàn)為體溫升高、食欲減退、精神沉郁并且出現(xiàn)明顯的咳嗽、流鼻涕、呼吸困難等呼吸道臨床癥狀，患病犢牛病程期間均未出現(xiàn)腹瀉癥狀。采集10份發(fā)病犢牛深部鼻腔棉拭子低溫保存運輸至實驗室，將樣本與DMEM按照1∶3的體積比例混合，渦旋混勻后，置于4 ℃的離心機中5000r min^-1離心10min，離心后，吸取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ嗣つc腺癌細胞（HCT-8）購自ATCC，由本實驗室保存。36只4周齡SPF級雌性BALB/c小鼠，體重（15±3）g，購自成都達碩實驗動物有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

主要試劑：DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Trypsin均購自Gibco；戊二醛（25%）購于默克sigma-aldrich；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗兔IgG、DAPI購自Abcam；TRIzol^TM試劑盒購自TaKaRa生物；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自成都蓉為生物；T3Super PCR Mix購自北京擎科生物；Marker DL500、Marker DL2000購自南京諾唯贊生物；核酸染料Golden View購自西安赫特生物；熒光定量PCR2×Premix Green Ex Taq酶購自寶生物工程（大連）有限公司；兔抗BCoV重組S2蛋白陽性血清由本實驗室制備。

主要儀器：恒溫培養(yǎng)箱購買于Thermoforma；高速冷凍離心機5804購買于Eppendorf；Doc2000凝膠成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；熒光定量PCR儀購自中國BIOER公司；金屬浴購自杭州博日科技；超純水儀Milli-Q購自Millipore；熒光顯微鏡購自TOKYO。

1.3 核酸提取和cDNA的合成

取10份呼吸道樣本上清液300μL用TRIzol方法提取總RNA，按照成都蓉為生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 BCoV的檢測

本研究采用譚爍等^[23]建立的熒光定量PCR檢測方法對呼吸道樣本進行檢測，簡述如下：引物序列：nsp10-F：5′-AGTAGTGTCAGTGC-TAAC-3′/nsp10-R：5′-CAAGTGCCTGTAGGTATA-3′。qPCR Premix Ex Taq10μL，上、下游引物各0.8μL（10μmol·L^－1），模板2μL，dd H₂O補足到20μL。反應(yīng)程序為：95℃2min；95℃15s、54℃20s，40個循環(huán)。

1.5 病毒的分離純化

病毒的分離純化參考何琪富等^[20]的方法。簡述如下：經(jīng)PCR鑒定為陽性的樣本以1∶1加入含終濃度為1μg·mL^－1Trypsin，顛倒混勻后置于37 ℃5%CO₂培養(yǎng)箱中激活30min，接種于HCT-8細胞系，置于37 ℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中孵育60min，最后以1∶1補充DMEM培養(yǎng)基維持細胞生長，待細胞病變效應(yīng)（CPE）達到80％以上時收集病毒。將產(chǎn)生CPE毒株穩(wěn)定傳三代后，利用蝕斑純化病毒。

1.6 BCoV分離株的鑒定

1.6.1 熒光定量PCR鑒定

收集到的病毒液，提取核酸后用“1.4”方法進行熒光定量PCR鑒定。

1.6.2 間接免疫熒光

取純化后的病毒液接種于HCT-8細胞，設(shè)置2個重復孔，同時設(shè)置一孔為HCT-8細胞陰性對照孔，出現(xiàn)病變后用80％冰丙酮固定，用兔抗BCoV重組S2蛋白陽性血清作為一抗，F(xiàn)ITC標記的羊抗兔IgG作為二抗，DAPI作為熒光染色劑，利用倒置熒光顯微鏡觀察。

1.6.3 電鏡觀察

將收集到的病毒液置于4℃5000r·min^－1離心10min，上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾后送成都里來生物技術(shù)有限公司進行透射電鏡觀察。

1.7 分離株完整S基因與HE基因的克隆與分析

設(shè)計6對引物，對分離株S基因及HE基因進行分段擴增，通過使用SeqMan7.1（version7.0；DNASTAR，USA）拼接，將獲得的完整S基因和HE基因在NCBI中的BLAST進行序列比對；利用MEGA7.0軟件中的Clustal W將多個序列進行比對，并采用鄰近法建立核苷酸系統(tǒng)發(fā)育樹；利用RDP4.101軟件對分離株完整的S基因和HE基因進行重組分析。

1.8 分離株對小鼠的致病性

將36只雌性BALB/c小鼠隨機分為4組，每組9只，設(shè)置2組感染組和2組對照組分別通過灌胃、滴鼻2種方式攻毒。試驗前小鼠隔夜禁食禁水12～16h后，2組感染組小鼠用劑量為50μL TCID₅₀5×10^7.46病毒液分別通過灌胃和滴鼻感染，2組對照組小鼠用同體積的細胞液分別灌胃和滴鼻。攻毒后，每天監(jiān)測小鼠臨床表現(xiàn)，分別在感染后3、6、9d分別處死每組3只小鼠，剖檢觀察小鼠組織器官病理變化，無菌采取小鼠肺、十二指腸、結(jié)腸等組織樣本并分為2份，1份用于提取核酸檢測BCoV病毒后計算其病毒拷貝數(shù)，另1份用10%甲醛溶液固定后用于HE染色，觀察其組織病理學變化。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離鑒定結(jié)果

將7份陽性樣本經(jīng)過6代盲傳后，其中有1株在第1代就產(chǎn)生細胞病變（cytopathic effect，CPE），3至6代CPE穩(wěn)定，24h出現(xiàn)大小不一拉絲狀的CPE，將CPE穩(wěn)定的6代病毒蝕斑純化3代。純化后的毒株經(jīng)熒光定量PCR檢測為BCoV陽性，經(jīng)間接免疫熒光鑒定，出現(xiàn)了明亮的特異性綠色熒光；通過透射電鏡觀察到分離株病毒粒子直徑約90nm，外周突起排列成皇冠狀（圖1），鑒定該分離株為BCoV，對該毒株命名為BCoV/SWUN/HXD4/2021，通過Reed-muench法計算分離株的TCID₅₀為10^-8.46·0.1 mL^-1。

2.2 BCoV/SWUN/HXD4/2021的S基因分子特征

成功獲得了全長為4092bp的S基因，編碼1363個氨基酸，裂解位點位與768和769位氨基酸之間，參考GenBank數(shù)據(jù)庫中全部482條BCoV完整S基因序列，未觀察到移位、缺失或插入，核苷酸的相似性為96.5%～99.68%，氨基酸相似性為89.9%～99.4%。基于GenBank數(shù)據(jù)庫中全部S基因的核苷酸序列，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)114株中國毒株位于4個分支上，其中101株中國毒株聚為一大支，本研究中的毒株BCoV/SWUN/HXD4/2021（GenBank登錄號：OL456 213.1）位于該分支，與奶牛毒株（GenBank登錄號：MW711 301.1）單獨聚為一小支（圖2）；基于GenBank數(shù)據(jù)庫中全部S基因，本研究毒株有2個獨特的氨基酸突變，分別位于的S1亞基受體結(jié)合域（S1-TND）的A33 G突變和S2亞基中的第一疏水域（HP）的A975V突變。

基于GenBank數(shù)據(jù)庫中全部482條S基因的核苷酸序列，采用SimPlot3.5.1和RDP4.101中RDP、GENECONV、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq等6種方法進行重組分析，結(jié)果均支持本研究毒株S基因發(fā)生重組事件（CI：0.486），RDP4.101顯示重組區(qū)域在1135～1686bp，SimPlot3.5.1顯示重組區(qū)域在1235～1613bp，盡管略有區(qū)別，但都位于S基因S1亞基的免疫反應(yīng)域S1B，預測其主要親本株是美國株7-16-23（GenBank登錄號：MH043955.1），次要親本株韓國株Wisent10/01（GenBank登錄號：HM573326.1）（圖3）。

2.3 BCoV/SWUN/HXD4/2021的HE基因分子特征

成功獲得全長為1275bp的HE基因，編碼424個氨基酸，與GenBank數(shù)據(jù)庫中所有的337條BCoV完整HE基因相比，未觀察到移位、缺失或插入，核苷酸的相似性為96.0%～99.92%，氨基酸相似性為93.5%～99.5%。基于GenBank數(shù)據(jù)庫中全部HE基因的核苷酸序列采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，40株中國毒株位于3個分支上，其中28株與本實驗室發(fā)現(xiàn)的HE重組中國毒株同聚為一大支，本研究中的毒株BCoV/SWUN/HXD4/2021（GenBank登錄號：OL456213.1）HE基因位于該分支但單獨聚為一小支（圖4）；基于GenBank數(shù)據(jù)庫中全部HE基因，本研究分離的毒株HE基因有2個獨特的氨基酸突變，位于近膜端域（MP）中的氨基酸突變（L365F）和凝集素域（R）中的氨基酸突變（L235R）。

基于GenBank數(shù)據(jù)庫中全部337條HE基因的核苷酸序列采用SimPlot3.5.1和RDP4.101中RDP、GENECONV、MaxChi、Chimaera、SiScan、3Seq等6種方法進行重組分析，結(jié)果均支持本研究毒株中的HE基因發(fā)生重組事件（CI：0.632），RDP4.101顯示重組區(qū)域在150～724bp，SimPlot3.5.1顯示重組區(qū)域在283～656bp，盡管略有區(qū)別，但都位于HE基因乙酰酯酶域E與凝集域R之間，預測其親本株是中國株B224_2021（GenBank登錄號：OP762 511.1），次要親本株是韓國株SUN5（GenBank登錄號：EU401 978.1）（圖5）。

2.4 致病性試驗結(jié)果

小鼠致病性結(jié)果顯示，攻毒12h后2組感染組小鼠開始出現(xiàn)精神沉郁、聚集扎堆的臨床癥狀，并且采食量和飲水量明顯減少，12～24h后采用灌胃的感染組小鼠呼吸加快，48h后2組感染組小鼠表現(xiàn)出不同程度的呼吸困難，并且排出稀疏、黏稠的黃色糞便，整個試驗過程無死亡病例；感染組小鼠剖檢可觀察到肺和十二指腸組織有出血點，胃、十二指腸鼓氣，十二指腸腸壁變薄、透明，腸管內(nèi)可見黃色稀薄的內(nèi)容物并含有氣泡；HE染色結(jié)果顯示，感染組小鼠肺局部區(qū)肺泡隔增厚，間質(zhì)內(nèi)見少量炎性細胞浸潤，十二指腸黏膜固有層內(nèi)可見大量細胞變性壞死，壞死區(qū)可見炎性細胞浸潤，以淋巴細胞和中性粒細胞為主，見黏膜上皮細胞和黏膜固有層明顯分離，黏膜固有層內(nèi)細胞成分減少，壞死區(qū)見炎性細胞浸潤，以淋巴細胞為主（圖6），根據(jù)不同感染途徑、不同組織的病理變化嚴重程度進行分級評分，結(jié)果見表2；小鼠部分組織的熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，感染組小鼠的肺、十二指腸、結(jié)腸均檢出病毒陽性，在相同感染時間里肺組織的檢出率與病毒拷貝數(shù)明顯高于十二指腸和結(jié)腸組織（表3）。整個試驗過程對照組小鼠無明顯臨床癥狀，組織樣本的熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示均為陰性，病毒拷貝數(shù)為0。

3 討 論

BRCV是BRDC的重要病原，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，目前已在世界范圍內(nèi)廣泛流行^{[7，15，18，24-25]}。國內(nèi)流行病學資料顯示，BRCV在我國具有廣泛的地域分布^[26-28]，但目前關(guān)于我國BRCV分離鑒定及其致病性的研究未見報道。本研究成功獲得了1株BRCV毒株，該毒株對小鼠表現(xiàn)出了較強的致病性，為進一步研究BRCV的致病性和評價疫苗保護效果等提供了參考。值得注意的是，該分離株的S基因和HE基因均發(fā)生重組事件，表明重組在該毒株的遺傳進化中扮演了重要角色。事實上，在冠狀病毒中重組是一個高頻率現(xiàn)象^[5-6，8]，重組可能會導致新型毒株出現(xiàn)^[9]。由于S基因和HE基因均涉及到受體結(jié)合、宿主范圍和組織嗜性，因此S基因和HE基因的重組可能會導致新型毒株的生物學特性的改變^[8]。另外，本研究獲得的毒株的HE基因重組事件與本實驗室之前報道的在國內(nèi)部分地區(qū)腹瀉奶牛和牦牛中廣泛流行的BCoV毒株重組事件相同^[8-9]，表明HE基因重組毒株也已在我國牛呼吸道BCoV中存在，其生物學特性需要進一步關(guān)注。

S基因與細胞表面受體結(jié)合、宿主范圍、組織嗜性及中和抗體產(chǎn)生有關(guān)^[29]。S1亞基包括受體結(jié)合域（S1-NTD，位于1～300aa）和免疫反應(yīng)域（S1A和S1B，351～403aa和517～621aa）兩個主要功能結(jié)構(gòu)域，S2亞基包括第一疏水域（HP，954～992aa）和七肽重復域（HR-N和HR-C，1043～1086aa和1267～1297aa）兩個主要功能結(jié)構(gòu)域^[10]。與GenBank中所有完整的482條S基因相比，本研究獲得的毒株有2個獨特的氨基酸突變，位于在S1亞基S1-TND的氨基酸突變（A33G）和S2亞基中HP的氨基酸突變（A975V），表明該S基因具有獨特的進化趨勢。S1-NTD具有識別糖受體的功能，能夠影響病毒進入細胞的能力^[10，30]，因此S1-NTD的氨基酸突變可能會對該毒株的組織嗜性和致病性產(chǎn)生影響；S2的HP可以促進病毒和宿主細胞膜的融合，從而使病毒進入宿主細胞^[10，30]，因此HP的氨基酸突變可能會對病毒復制的速度或誘導細胞病變產(chǎn)生影響，有必要對該毒株的生物學特性進一步研究。

HE蛋白具有受體識別和受體破壞功能，同時也具有誘導產(chǎn)生中和抗體的能力^[6]。HE蛋白包括小膜近端域（MP，19～24aa和342～376aa）、凝集素域（R，140～282aa）和乙酰酯酶域（E，25～139aa和283～342aa）三個主要功能結(jié)構(gòu)域^{[6，14，31]}。與GenBank中所有完整的337條HE基因相比，本研究毒株HE基因有2個獨特的氨基酸突變位于凝集素域（R）中的氨基酸突變（L235R）和近膜端域（MP）中的氨基酸突變（L365F）。HE蛋白的凝集素域（R）具有受體識別功能和凝集功能^[14]，R域發(fā)生的氨基酸突變可能會對該毒株的凝集作用和致病性產(chǎn)生影響。本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn)，HE基因存在重組并且在受體結(jié)合部存在氨基酸插入、缺失，這些現(xiàn)象表明國內(nèi)HE基因存在復雜的進化趨勢^[19]。

BCoV具有肺腸雙嗜性，能夠引起犢牛腹瀉、成年牛冬季痢疾以及各年齡段牛呼吸道疾病^[1]。Saif等^[17]用BECV分離株感染犢牛后能夠引起明顯腹瀉癥狀和腸道病變，但沒有出現(xiàn)任何呼吸道癥狀；Soules等^[18]用BRCV分離株感染犢牛后能夠引起明顯腹瀉和呼吸加快，出現(xiàn)明顯的肺部和腸道的病理變化。盡管BCoV可以引起不同類型的臨床表現(xiàn)，但并未發(fā)現(xiàn)BECV和BRCV存在特異性的分子差異^[15-16]。關(guān)于β冠狀病毒屬中SARS-CoV-2、SARS-CoV、MERS對小鼠致病性的研究報道較多^[32-34]，但關(guān)于BCoV對小鼠致病性的報道較少。劉振格等^[35]用BECV-DQ毒株，通過滴鼻、灌胃、腹腔注射3種途徑，成功引起B(yǎng)ALB/c小鼠腸道感染，未引起呼吸道癥狀和肺部病變。而本研究用BRCV分離株通過滴鼻和灌胃兩種途徑感染BALB/c小鼠，均可觀察到感染小鼠明顯的腹瀉癥狀和呼吸道癥狀，小鼠肺、十二指腸和結(jié)腸有明顯的病理變化，并且肺的病毒載量最高，其中灌胃組中肺的病毒載量明顯高于腸道，可能與毒株特異性、實驗動物物種差異、灌胃操作過程病毒感染呼吸道導致肺部感染等有關(guān)，有必要進一步驗證。另外，不同毒株感染小鼠后引起的臨床癥狀有所差異，可能與毒株的分子特征不同有關(guān)，遺憾的是，因為劉振格等^[35]的研究中未報道該毒株的S基因和HE基因的信息，無法分析兩個毒株組織嗜性差異的分子基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究在國內(nèi)首次分離到BRCV并建立了BALB/c小鼠感染模型，分離株的S蛋白和HE蛋白有獨特的氨基酸突變，為進一步研究BCoV的生物學特性和遺傳進化提供了參考。

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（編輯 范子娟）