西藏那曲市牦牛源B型多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及基因組分析

摘 要：旨在對引起西藏牦牛呼吸道感染的多殺性巴氏桿菌進行分離鑒定，明確病原菌的血清型、耐藥性和致病性等生物學特性及基因組特征和遺傳進化關系。本研究從西藏林芝、拉薩、那曲地區采集牦牛鼻咽拭子和組織病料498份，進行流行病學調查、細菌學分離純化、生化試驗、PCR鑒定、K-B藥敏試驗、動物致病性試驗和分離株全基因組測序，并通過Mauve軟件和MEGA7軟件進行基因共線性和系統進化分析。結果顯示，經細菌分離純化、生化試驗及PCR鑒定，發現在西藏林芝、拉薩、那曲地區巴氏桿菌陽性率為2.61%，且從病死牦牛肺組織中分離出B型多殺性巴氏桿菌菌株，命名為“Pm XZ01”株；藥敏試驗發現Pm XZ01株對頭孢菌素類、喹諾酮類、羧芐西林、丁胺卡那、復方新諾明和氯霉素類抗生素敏感；動物試驗發現感染Pm XZ01株的家兔（1.2×10⁸CFU·mL^－1）和小鼠（1×10⁷CFU·mL^－1）死亡率高達100%，說明在該濃度下Pm XZ01株具有較強的致病性和致死性。全基因組測序獲得Pm XZ01株全基因組大小為2331787bp，GC含量為40.47%，重復序列總長度為3266bp；含有121個非編碼RNA基因，包括59個tRNA基因，19個rRNA基因，43個ncRNA基因；2個假基因，5個基因島，3個前噬菌體，68個碳水化合物活性酶基因；CARD注釋分析發現1個PBP3抗性基因和2個EF-Tu抗性基因；VFDB和PHI-base注釋分析發現101個毒力因子相關基因及663個表型突變基因等；共線性分析發現Pm XZ01株與豬源HB03株（CP003328.1）、HN07株（CP007040.1）和禽源P1702株（CP097616.1）共線性最好，而與牦牛源Tibet-Pm1株（CP072655.1）共線性較差；系統進化樹分析發現Pm XZ01株與中國廣東牛源GDZQ201401株（KP083466.1）屬于同一分支，進化關系最近。本研究完成了西藏牦牛巴氏桿菌病的流行病學調查，以及牦牛源B性多殺性巴氏桿菌的分離鑒定、生物學特性和全基因組測序分析，為探索西藏牦牛源B型多殺性巴氏桿菌病的流行規律和致病機制以及防控提供了參考。

關鍵詞：牦牛；B型多殺性巴氏桿菌；分離鑒定；藥物敏感性；致病性；基因組

中圖分類號：S852.612

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3105-14

收稿日期：2023-07-24

基金項目：西藏自治區科技廳重點項目（XZ202001ZY0044N）；區域科技協同創新項目（QYXTZXNQ202204）; 西藏農牧學院研究生教育創新計劃項目（YJS2023-21）；國家現代農業產業技術體系（CARS-37）

作者簡介：劉博華（2000-），男，河南三門峽人，碩士生，主要從事高原動物傳染病學研究，E-mail：484325625@qq.com

*通信作者：徐業芬，主要從事高原動物疫病和生理學教學及研究，E-mail：xzlzxyf@163.com

Isolation，Identification and Genome Analysis of Type BPasteurella multocida Isolated

from Yak in Tibetan Nakchu City

LIUBohua¹，FUHanyu¹，WANGYuheng²，Suolangsizhu¹，NIUJiaqiang¹，BAOYuhua²，

LIJiakui^1，3，XUYefen^1*

（1.Provincial Key Laboratory of Tibet Plateau Animal Epidemic Disease Research，

College of Animal Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，

Nyingchi860000，China; 2.Veterinary Biopharmaceutical Manufacturing Factory，

Tibet Autonomous Region，Lhasa850000，China; 3.College of Veterinary Medicine，

Huazhong Agricultural University，Wuhan430000，China）

Abstract：The aim of this study was to isolate and identify Pasteurella multocida which caused respiratory tract infection in Tibetan yaks，and to identify the biological characteristics，such as serotype，drug resistance，pathogenicity，genome characteristics and genetic evolution of the pathogenic bacteria.In this study，498nasopharyngeal swabs and tissue samples of yaks were collected from Nyingchi，Lhasa and Nakchu regions of Tibet.Epidemiological investigation，bacteriological isolation and purification，biochemical tests，PCR identification，K-B susceptibility test，animal pathogenicity test and whole genome sequencing of the isolates were conducted.Gene collinearity and phylogenetic analysis were carried out by Mauve software and MEGA7software.The results showed that the positive rate of Pasteurella multocida was2.61%in Nyingchi，Lhasa and Nakchu regions of Tibet，and astrain of Pasteurella multocida type Bwas isolated from the lung tissue of dead yaks，named“Pm XZ01”strain.Drug susceptibility tests showed that Pm XZ01strain were sensitive to cephalosporins，quinolones，carbenicillin，bucaricana，cotrimoxazole and chloramphenicol antibiotics; Animal experiments showed that the mortality of rabbits（1.2×10⁸CFU·mL^－1）and mice（1×10⁷CFU·mL^－1）infected with Pm XZ01strain was as high as100%，indicating that Pm XZ01strain had strong pathogenicity and lethality at this concentration.The total genome size of the Pm XZ01strain obtained by whole genome sequencing was2331787bp，the GC content was40.47%，and the total length of the repeats was3266bp.It contained121non-coding RNA genes，including59tRNA genes，19rRNA genes and43ncRNA genes.There were2pseudogenes，5gene islands，3prophage，68carbohydrate active enzyme genes; CARD annotation analysis found out one PBP3resistance gene and two EF-Tu resistance genes.VFDB and PHI-base annotation analysis revealed101virulence factor related genes and663phenotypic mutant genes.The collinearity analysis showed that Pm XZ01strain had the best collinearity with pig HB03（CP003328.1），HN07（CP007040.1）and avian P1702（CP097616.1）strains，but poor collinearity with yak Tibet-Pm1（CP072655.1）strain.Phylogenetic tree analysis showed that Pm XZ01strain belonged to the same branch as GDZQ201401strain（KP083466.1）from Guangdong cattle in China，and had the closest evolutionary relationship.This study completed the epidemiological investigation of pasteurellosis in Tibetan yaks，as well as the isolation，identification，biological characteristics and whole genome sequencing analysis of Pasteurellosis multocida type Bof yak origin，providing areference for exploring the epidemic rule，pathogenic mechanism and prevention and control of type Bpasteurellosis of Tibetan yaks.

Key words：yak; Pasteurella multocida type B; isolation and identification; drug sensitivity; pathogenicity; genome

*Corresponding author：XU Yefen，E-mail：xzlzxyf@163.com

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種兼性厭氧、革蘭陰性莢膜球桿菌，在世界范圍內廣泛流行，可引起禽類、野生動物、人類感染以及反芻動物呼吸道疾病^[1-2]，并給畜牧業和人類健康安全帶來威脅，據報道，北美和印度尼西亞每年因Pm感染對養殖業分別造成8億美元和400～6000萬美元的經濟損失^[3]，日本曾報道一起因貓抓傷導致Pm感染引起人眼內炎的案例^[4]。近幾年，我國西藏、青海等地也出現該病的報道^[5]，有學者發現，西藏牦牛感染Pm后發病率僅為2%，但死亡率卻高達90%，給當地畜牧業造成了巨大的威脅^[6]，在西藏地區開展多殺性巴氏桿菌的流行病學調查，可為制定相應的預防和控制策略提供科學依據。

Carter分型方法將Pm分為A、B、D、E、F型5個莢膜血清型和16個脂多糖血清型，研究發現Pm不同莢膜血清型感染宿主可引起不同的疾病和癥狀，A型引起禽霍亂和豬、牛、羊等肺炎疾病，B型和E型引起牛和其他動物急性出血性敗血癥，D型分泌的多殺性巴氏桿菌毒素（Pasteurella multocida toxin，PMT）引起豬肺疫^[7-8]。因此，準確鑒定Pm血清型具有重要的臨床診斷意義，可以更好地了解其病原致病性和毒力作用。目前疫苗接種和抗生素是預防巴氏桿菌病最實用的方法，但Pm存在多種血清型易形成交叉保護使疫苗保護周期減短，以及長時間使用或濫用抗生素藥物導致Pm菌株耐藥性增強，限制了巴氏桿菌病的治療選擇，致使該病的防治變得愈加困難^[9-11]，有必要對多殺性巴氏桿菌的耐藥性和致病性進行研究，用于指導巴氏桿菌病臨床藥物的選擇和治療。

多殺性巴氏桿菌主要依賴于莢膜、脂多糖、外膜蛋白、皮膚壞死毒素、黏附素和鐵獲取蛋白等多種毒力因子在宿主體內存活增殖及發揮致病性的作用，可知毒力因子是衡量Pm毒性和致病性的重要因素之一^[12-13]。由于Pm具有多種毒力和致病因子，導致其在不同宿主中的致病機理仍不明確，通過全基因組序列可以快速準確地表征來自不同地域和不同宿主的Pm菌株的基因型以及毒力因子編碼基因^[7]，對闡明Pm的毒力、適應性和宿主特異性具有重要意義。目前國內外對A型^[14-15]和D型^[16]巴氏桿菌的研究已經取得較大進展，但對B型巴氏桿菌的研究報道較少。

本研究在西藏林芝、拉薩和那曲地區的部分牛場采集患呼吸道病牦牛的鼻咽拭子與病死牦牛的組織病料，進行巴氏桿菌流行病學調查、細菌分離鑒定及血清型鑒定，并通過藥敏試驗、動物致病性試驗和全基因組測序分析，以闡明病原菌的生物特性、藥敏特性、致病性和基因組特征，為該病的臨床診斷和治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）購自北京陸橋生物公司；哥倫比亞血瓊脂平板購自北京奧博星生物技術有限責任公司；抗生素藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司；革蘭染色液購自北京索萊寶科技有限公司；細菌微量生化鑒定管購自廣東環凱微生物科技有限公司；2×Taq PCR Master Mix、Gene Green核酸染料（RT210）購自北京天根生化科技有限公司；DL-1000Marker、DL-2000Marker購自北京擎科生物科技有限公司。電泳儀（JY300E，北京市六一儀器廠）；普通PCR儀（Applied Biosystems2720，上海啟步生物科技有限公司）。

1.2 試驗動物

具有呼吸道疾病癥狀牦牛來自西藏林芝、拉薩和那曲地區牦牛養殖場；致病性試驗所用動物為6只6月齡、體重（2.0±0.2）kg家兔及28只3～4月齡、體重（20±3）g昆明系小鼠，均由西藏自治區獸醫生物藥品制造廠提供，在西藏農牧學院實驗室飼養。

1.3 流行病學調查

2020年11月—2023年6月，從西藏林芝、拉薩和那曲地區牦牛養殖場分別采集患呼吸道疾病牦牛的鼻咽拭子201份、125份和166份，從西藏那曲地區采集病死牦牛肺等組織病料樣品6份（圖1），對所有樣品進行巴氏桿菌檢測。

1.4 細菌分離純化與生化試驗

組織病料和鼻咽拭子樣品接種于TSB液體培養基，37 ℃培養18h，接種于TSA固體培養基，培養至形成灰白色單個小菌落，再接種于TSB液體培養基純化培養后，挑取單個菌落劃線接種于TSA固體培養基和哥倫比亞血瓊脂平板上培養，觀察其生長特性。對純化菌株革蘭染色鏡檢，觀察菌株的染色特性及形態。按照細菌微量生化鑒定管說明書，將純化的菌液無菌接種于微量生化管內，37 ℃培養12h，觀察并判定其生化特性。

1.5 細菌PCR鑒定

利用水煮法提取分離菌株的總DNA。參考闞威等^[17]Pm的16S rRNA、Kmt1特異性引物和莢膜血清A、B、D、E、F分型引物、PCR體系及擴增條件進行PCR鑒定，引物由北京擎科生物科技有限公司合成（表1），PCR產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 藥物敏感性試驗

采用K-B法進行藥敏試驗，吸取100μL純化的菌液劃線接種于含1%血清TSA平板，將藥敏紙片均勻貼于培養基表面，倒置37 ℃培養18h，連續3次測量各藥敏片抑菌圈直徑，取平均值，參照抗微生物藥物敏感試驗標準M100S31st^[18]進行藥物敏感性判定。

1.7 動物致病性試驗

純化的菌液接種于TSA固體培養基中培養18h后進行菌落計數，參照井郁金等^[19]的方法，將菌液濃度分別稀釋為1.2×10⁸CFU·mL^－1和1×10⁷CFU·mL^－1。將實驗兔和小鼠適應性飼養7d后，均隨機分為試驗組和對照組，兔每組3只，小鼠每組14只，試驗組家兔按1mL·只^－1腹腔注射1.2×10⁸CFU·mL^－1的稀釋菌液，小鼠按1mL·只^－1腹腔注射1×10⁷CFU·mL^－1的稀釋菌液，對照組家兔和小鼠均腹腔注射等量1mL生理鹽水。觀察記錄發病情況，死亡后剖檢采集肝、肺、脾、腎等內臟組織，進行細菌分離培養與鑒定。

1.8 基因組學分析

1.8.1 基因組測序及功能分析

將分離純化后的菌液沉淀物置于干冰中送至北京百邁客生物科技有限公司進行全基因組測序。獲得基因組序列后，對基因組成份和功能分析，使用hmmer軟件將Pm基因的蛋白序列與碳水化合物活性酶數據庫（Carbohydrate-active enzymes database，CAZy）注釋分析，確定Pm基因含有的蛋白功能域；使用抗生素抗性數據庫（Comprehensive Antibiotic Research Database，CARD）注釋分析，得到耐藥基因和抗生素耐受種類；使用PHI-base數據庫（Pathogen Host Interactions Database）注釋分析病原菌與宿主互作關系；使用Diamond軟件將Pm菌株的氨基酸序列與VFDB數據庫（Virulence Factor Database）注釋分析，預測Pm基因組中可能存在的毒力因子。

1.8.2 基因組共線性分析

通過GenBank下載基因組測序水平完整的牦牛源菌株Tibet-Pm1（登錄號：CP072655.1）、牛源菌株NCTC-10323（登錄號：LR134532.1）、豬源菌株HB03（登錄號：CP003328.1）和HN07（登錄號：CP007040.1）禽源菌株P1702（登錄號：CP097616.1）、Ban-PM7（登錄號：CP052765.1）和VP161（登錄號：CP048792.1）的全基因序列，利用Mauve軟件與本研究測序得到的Pm菌株的全基因序列進行共線性分析。

1.8.3 系統進化分析

通過NCBI下載16株不同地域不同宿主的Pm菌株16S rRNA基因序列，與本研究測序得到的B型Pm菌株的16S rRNA基因序列利用MEGA7軟件中的Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

2 結 果

2.1 流行病學調查結果

通過對498份病料樣品進行巴氏桿菌檢測，在西藏那曲采集的6份組織病料和7份鼻咽拭子樣品中檢測出巴氏桿菌呈陽性，共13份陽性樣品（表2），檢出率為2.61%（13/498）；其中林芝為0.00%（0/201），拉薩為0.00%（0/125），那曲為7.56%（13/172）。

2.2 細菌分離純化與生化試驗結果

從病死牦牛肺組織分離出疑似多殺性巴氏桿菌菌株，菌株在TSA固體培養基上形成圓形、灰白不透明、邊緣光滑整齊的小菌落（圖2A）；在哥倫比亞血瓊脂平板上生長狀態良好，形成灰白色、濕潤黏稠的圓形菌落（圖2B）。革蘭染色為兩極濃染、形態均一的革蘭陰性球桿菌（圖2C）。生化試驗結果（表3）顯示，分離菌株可分解葡萄糖和蔗糖，產酸不產氣；可發酵甘露醇和山梨醇，不發酵乳糖、鼠李糖和麥芽糖；可產生硫化氫，還原硝酸鹽，不能液化明膠；尿素反應為陽性，枸櫞酸鹽反應為陰性，符合多殺性巴氏桿菌生化特性。

2.3 PCR鑒定結果

分離菌株經多殺性巴氏桿菌16S rRNA及Kmt1特異性引物擴增，分別獲得大小約為1534bp（圖3a）和460bp（圖3b）的特異性條帶，與預期相符，確定分離菌株為多殺性巴氏桿菌。利用Pm莢膜血清型分型引物對分離菌株PCR擴增，結果顯示僅在B型泳道擴增出大小約為760bp的條帶（圖3c），與莢膜B型預期值相符，表明分離菌株為莢膜B型多殺性巴氏桿菌，命名為“Pm XZ01”株。

2.4 藥物敏感性試驗結果

藥敏試驗結果（表4）顯示Pm XZ01株對頭孢菌素類（頭孢哌酮、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松）、喹諾酮類（諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星）、羧芐西林、丁胺卡那、復方新諾明和氯霉素等抗生素敏感；對氨芐西林、頭孢拉定、多粘菌素B、呋喃唑酮中度敏感，對青霉素、苯唑西林、麥迪霉素、慶大霉素、四環素、多西環素、米諾環素、紅霉素和克林霉素不敏感。

2.5 動物致病性試驗結果

使用1.2×10⁸CFU·mL^－1稀釋菌液感染健康的實驗兔和1×10⁷CFU·mL^－1稀釋菌液感染小鼠，發現家兔和小鼠在攻毒1h后均開始表現為體溫弛張熱、呼吸急促、精神抑郁、行動緩慢；隨著感染時間加長，逐漸出現食欲減退、體重下降、飲水量減少，且伴隨腹部脹氣、腹瀉、結膜發紅、眼瞼有少量分泌物等癥狀；12h后四肢僵硬，眼球渾濁，全部死亡，病死率高達100%。剖檢均出現明顯的急性纖維性肺炎浸潤，肺尖葉、心葉及膈葉前下發生實變、不完全擴張、膿腫及大量灰白色圓形小結節；肺胸膜、心包膜有纖維素樣覆蓋；肝腫大，充血，肝表面出現黑色圓形壞死斑點；脾腫大；心未見明顯病變（圖4）。對死亡家兔和小鼠的肺等組織進行細菌分離鑒定，發現分離菌株與Pm XZ01菌株染色特性和生化特性結果相同，經Pm特異性引物PCR鑒定顯示為同一菌株。對照組家兔和小鼠均存活。

2.6 基因組學分析

2.6.1 基因組成份

該Pm XZ01株經全基因組序列測定校對后，繪制全基因組圈圖譜（圖5）。全基因組序列全長為2331787bp，所有編碼基因的總長度為2070198bp，編碼基因2140個，平均長度967bp，編碼基因總長度占全基因的88.78%；GC含量為40.47%，重復序列總長度為3266bp，占基因組總長度0.14%；含有非編碼RNA基因121個，其中tRNA基因59個，占比2.76%，rRNA基因19個（23S rRNA基因6個、16S rRNA基因6個、5S rRNA基因7個），占比0.89%，其他nc RNA基因43個，占比2.01%；假基因2個，基因總長度為440bp，平均長度220bp；基因島5個；前噬菌體3個。

2.6.2 基因組功能注釋分析結果

通過對全基因組成份特征分析，將Pm XZ01基因的蛋白序列與表5中的功能數據庫進行比對，選取得分最高的比對結果進行注釋分析，獲得以下結果：

2.6.2.1 CAZy注釋分析結果：CAZy數據庫中蛋白分為六大功能類別：糖苷水解酶（Glycoside Hydrolases，GHs）、糖基轉移酶（Glycosyl Transferases，GTs）、多糖裂解酶（Polysaccharide Lyases，PLs）、碳水化合物酯酶（Carbohydrate Esterases，CEs）、輔助氧化還原酶（Auxiliary Activities，AAs）和非催化的結合碳水化合物的功能域（Carbohydrate-Binding Modules，CBMs）。使用hmmer軟件對Pm XZ01基因的蛋白序列分別與CAZy數據庫注釋分析（圖6），該基因組被注釋到的碳水化合物活性酶基因有68個，GHs、GTs、PLs、CEs、AAs、CBMs的含量分別為19.11%、51.47%、1.47%、11.76%、4.41%、11.76%。

2.6.2.2 CARD注釋分析結果：通過CARD數據庫注釋分析，發現該Pm XZ01株有3個耐藥基因注釋到數據庫中（表6），分別為1個PBP3基因和2個EF-Tu基因。PBP3基因可對青霉素類及β-內酰胺類抗生素（碳青霉烯、頭孢菌素、單菌霉素、頭霉素）產生抗性，EF-Tu基因對普利霉素類抗生素（芬尼法霉素）產生抗性。

2.6.2.3 PHI-base和VFDB注釋分析結果：通過PHI-base數據庫注釋分析，發現Pm XZ01株存在663個基因發生表型突變；有479個突變后致病性減弱，35個突變后致病性增強，99個突變后致病性無影響，31個突變后使菌株致病性喪失，15個突變成致死因子，4個突變成致病效應基因。VFDB數據庫注釋分析結果得到該Pm XZ01株存在101個潛在毒力因子，同源性在60%以上只有10種毒力因子，包括Capsule、LPS、外膜蛋白、毒力蛋白ClpP、Alginate、Vi抗原、Hsp60、AI-2和KatA；以及相關的毒力基因katA、cylG、fbpC、hitC、waaQ、ompP5和hlyA等。

2.6.3 基因共線性分析結果

通過Mauve軟件對8株多殺性巴氏桿菌的全基因組進行比對研究共線性關系。結果顯示（圖7），本研究的Pm XZ01株與豬源HB03株、HN07株和禽源VP161株的基因組之間有較多大片段的共線性，但也存在插入、缺失、移位和倒置等基因重排現象；與其他4株菌株之間存在大量的共線區域重排，共線性水平相對較差。在牦牛源和牛源菌株中，牦牛源Tibet-Pm1株與牛源NCTC10323株基因組共線關系較好，但存在部分基因缺失、顛倒的重排現象。

2.6.4 系統進化分析結果

構建分離Pm XZ01菌株的16S rRNA基因系統進化樹，從圖8可知該Pm菌株與中國廣東牛源GDZQ201401菌株（KP083 466.1）屬于同一分支，進化關系最近；與中國云南奶牛源ASV201160株和埃及牛源FUP12株進化關系較近，同中國西藏Tibet-Pm1、中國武漢HB03、中國海南HN07、中國PM-R1603、緬甸NCTC10323、英國NCTC10204、越南VP161、美國Pm70、美國P1702、德國2631-s12-88、英國NCTC10322、印度Pm797、丹麥RA12/2等Pm菌株的進化關系較遠。

3 討 論

牛出血性敗血癥被我國列為二類動物疫病，病牛表現為頸部腹側區域明顯水腫、呼吸窘迫和鼻腔流出大量黏液性分泌物^[20-21]，具有高發病率和死亡率的特點，無季節性，多呈散發和地方流行，在應激因素下易引發巴氏桿菌的原發性感染^[22]。馬弘財等^[23]對高原地區巴氏桿菌病的流行病學調查發現，西藏牦牛巴氏桿菌病個體陽性率為12%左右，群體陽性率高達89.66%，且病死率最高可達42.86%。王方國等^[5]對西藏那曲牦牛呼吸道綜合征病原血清進行檢測，發現多殺性巴氏桿菌的檢出率為11.89%。本研究僅在西藏那曲采集的樣品中檢出Pm，且陽性率為2.61%，相對于馬弘財等^[23]（11.57%）、王方國等^[5]（11.89%）等研究高原地區巴氏桿菌的檢出率較低，說明牦牛多殺性巴氏桿菌病在西藏那曲地區呈個別地、零星地散在發生。

酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和PCR鑒定法是臨床鑒定Pm莢膜血清型常用的方法。ELISA檢測雖高效、靈敏、快速，但該方法使用的單抗不能中和天然毒素且活性微弱，使其結果存在差異性^[24]。PCR可利用特異性引物檢測出細菌的全部DNA，準確性更高。有學者采用ELISA法從青海、西藏、四川、甘肅地區的牛血清中檢測出Pm抗體，但未鑒定出其血清型^[25]；2019年陳建春等^[26]使用PCR鑒定從西藏那曲地區分離鑒定出B型多殺性巴氏桿菌。本研究通過細菌學分離和血清型特異性引物PCR鑒定的方法從病死牦牛肺組織中分離鑒定出B型多殺性巴氏桿菌（Pm XZ01株），且發現其分離率較低，這可能與Pm作為次要病原菌同其他致病菌混合感染被掩蓋有關，已有報道發現Pm會與其他病原微生物協同感染，如牛的呼吸道合胞病毒感染會顯著降低Pm對宿主的依從性^[27]。

藥敏試驗發現Pm XZ01株對大多數頭孢菌素類、喹諾酮類、羧芐西林、丁胺卡那、復方新諾明和氯霉素類抗生素敏感，可抑制Pm的生長，與Alhamami等^[28]報道的牛Pm對頭孢菌素類和喹諾酮類抗生素敏感的藥敏特性相似。另外發現分離菌株對羧芐西林、丁胺卡那、諾氟沙星等多種抗生素存在耐藥性，說明Pm XZ01株具有多重耐藥性。使用1.2×10⁸CFU·mL^－1稀釋菌液感染健康的實驗兔和1×10⁷CFU·mL^－1稀釋菌液感染小鼠，發現家兔和小鼠感染1h后均開始發病，24h后均死亡，致病性和死亡率均高達100%，說明Pm XZ01株在該濃度下具有較高的致病性和致死率；與李家奎等^[6]在2012年對西藏牦牛巴氏桿菌病調查發現的90%致死率相近，而與牦牛發病率2%差異較大，這可能是動物種屬差異所致，如在禽類研究中也發現分離的Pm菌株對不同品種和品系的禽致病性和致病率存在差異^[29]。剖檢發現其肺均出現急性纖維性肺炎浸潤，符合多殺性巴氏桿菌病的病理特征^[30]。結合藥敏和致病性試驗結果，在養殖過程中要加強多殺性巴氏桿菌的監測，制定科學合理的防治措施和給藥方案顯得尤為重要，同時應避免耐藥菌株的產生。

截止目前，共有426個Pm基因組序列被NCBI數據庫收錄，本研究獲得了1株牦牛源B型Pm的全基因組信息，完善了Pm的基因組數據庫。Pm XZ01株基因組研究概況為序列全長2331787bp，所有編碼基因的總長度為2070198bp，編碼基因2140個，GC含量為40.47%，與其他B型Pm基因組結構相似。

基因組VFDB注釋分析發現Pm XZ01株存在101個潛在的毒力因子，發現Capsule、LPS等毒力因子在Pm發揮致病性時起決定性作用，與Vu-Khac等^[31]研究越南豬B型Pm的毒力因子相似。其中Capsule上存在與生物合成相關的Fis、Hfq蛋白和Pm0442毒力基因使其成為Pm關鍵的毒力因子之一，當Pm缺失這些蛋白和毒力基因后，形成無莢膜突變體菌株毒力顯著降低^[32-33]。LPS具有毒力決定因子、免疫調節劑和提供必需生存元件的功能，會使宿主免疫細胞損傷，導致細胞急性死亡，對宿主的細菌活力、適應性和致病性至關重要^[34-35]。研究發現毒力因子幫助Pm適應宿主免疫系統以及宿主與病原體間的相互作用^[36]，可以根據毒力因子及血清型預測Pm的致病性，用于指導巴氏桿菌病的臨床治療。

有研究報道革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗生素的耐藥依賴于β-內酰胺酶，而Pm含有編碼β-內酰胺酶的耐藥基因bla_TEM和bla_ROB1^[31]，本研究基因組CARD注釋分析未發現Pm XZ01株存在與之報道一致的耐藥基因，卻發現存在對青霉素類、β-內酰胺類和普利霉素類抗生素的耐藥基因PBP3和EF-Tu。值得注意的是序列分析數據顯示Pm XZ01株存在對β-內酰胺類抗生素的耐藥基因，但藥敏試驗顯示該菌株對β-內酰胺類抗生素敏感，這可能是耐藥基因在菌株內未表達或缺乏某種機制協同作用所導致，Petrocchi-Rilo等^[37]研究也發現在豬源Pm中存在4個對β-內酰胺類抗生素耐藥的基因，但菌株依然對該類藥物敏感，原因是這些基因在菌株內未表達。

基因共線性分析發現Pm XZ01株與豬源HN07株和HB03株基因組共線性較高，而與牦牛源Pm Tibet-Pm1株和牛源NCTC10323株基因組之間存在大片段的移位和倒置，可能由基因丟失、串聯重復、基因轉位和染色體重排等多個因素共同作用所致。從Pm菌株系統進化分析結果可知分離Pm XZ01株與中國廣東牛源GDZQ201401株屬于同一分支，與中國云南和埃及的Pm菌株進化關系較近，符合該病的地域流行規律，可為分析B型Pm菌株的進化和地域流行提供參考。

4 結 論

本研究對西藏拉薩、林芝和那曲地區的牦牛多殺性巴氏桿菌病開展了流行病學調查，從病死牛肺組織中分離鑒定出B型多殺性巴氏桿菌Pm XZ01株，并對其生物學特性和全基因組學進行了分析，為探索西藏牦牛源B型多殺性巴氏桿菌病的流行規律和致病機制以及防控提供了參考。

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（編輯 范子娟）