蘆丁在BV2細胞中抗弓形蟲的作用及機制分析

摘 要：本研究旨在分析蘆丁在BV2細胞中的體外抗弓形蟲作用及其潛在機制。首先通過CCK8法、間接熒光染色法等測定蘆丁的細胞毒性、弓形蟲抑制率及增殖情況以探究蘆丁在BV2細胞中的抗弓形蟲作用；隨后，將細胞分成4組，分別為：空白組（Normal）、感染對照組（T.gondii）、感染后低劑量蘆丁治療組（Rut50）和感染后高劑量蘆丁治療組（Rut100），進行弓形蟲感染及蘆丁處理試驗，并用ELISA等方法檢測細胞培養液上清液中抗氧化酶SOD、GSH及脂質氧化產物MDA水平，炎癥因子TNF-α、IL-6及IL-1β水平，用Western blot檢測BV2細胞中PI3K/AKT/Nrf2/HO-1、TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3信號通路中關鍵蛋白表達量。結果表明，在BV2細胞中，50和100μg·mL^－1的蘆丁具有明顯的抗蟲效果，可顯著抑制弓形蟲感染率、入侵能力和增殖（Plt;0.05）。50和100μg·mL^－1的蘆丁還可顯著增多上清液中的SOD、GSH含量并降低MDA含量（Plt;0.05），且降低TNF-α、IL-6及IL-1β水平（Plt;0.05），并顯著上調抗氧化通路PI3K/AKT/Nrf2/HO-1、下調炎癥通路TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3中關鍵蛋白表達量（Plt;0.05）。結果提示，蘆丁在BV2細胞中具有明顯的抗弓形蟲作用，這可能與其可以通過激活PI3K/AKT/Nrf2/HO-1通路從而增強細胞抗氧化能力、以及抑制TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3通路從而減弱炎癥反應有關。研究結果可為后續探究蘆丁體內抗蟲效果及分析其對弓形蟲性腦損傷保護機制相關研究提供一定的理論參考，并為將蘆丁開發成治療人畜弓形蟲病的潛在藥物提供科學依據。

關鍵詞：蘆丁；抗弓形蟲作用；BV2細胞；抗氧化；抗炎；PI3K/AKT/Nrf2/HO-1；TLR4/NF-κB；P2X7R/NLRP3

中圖分類號：S859.7

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3119-13

收稿日期：2023-07-30

基金項目：國家自然科學基金（31660614）；大學生創新創業訓練計劃項目（X202210452489）

作者簡介：韓成全（1987-），男，山東臨沂人，博士，講師，主要從事弓形蟲致病機制及抗弓形蟲藥物篩選、動物健康養殖研究，E-mail：hcq2012a@163.com，Tel：+860539-7258720

*通信作者：徐 璐，主要從事弓形蟲致病機制及抗弓形蟲藥物篩選研究，E-mail xulu0824@126.com；王悅尚，主要從事天然藥物提取分離及藥理作用機制研究，E-mail wyueshang@hotmail.com

Study on the Anti-Toxoplasma gondii Effect of Rutin in BV2Cells and Its Mechanism

HANChengquan¹，LIUJingtao²，YUMiao³，GUANLizeng¹，XULu^1*，WANGYueshang^4*

（1.College of Agriculture and Forestry Science，Linyi University，Linyi276000，China;

2.Agricultural Comprehensive Service Center，Longsha District，Qiqihar City，Qiqihar161000，

China; 3.Pathology Research Department，Shanghai Medicilon Biomedical Incorporated

Company，Shanghai200000，China; 4.College of Medicine，

Linyi University，Linyi276000，China）

Abstract：This experiment was conducted to study the in vitro anti-Toxoplasma gondii（T.gondii）effect of rutin and its mechanism in BV2cells.Firstly，the anti-T.gondii effect of rutin in BV2cells was explored by detecting rutin cytotoxicity，T.gondii inhibition rate and proliferation by CCK8and indirect fluorescence staining，etc.Subsequently，the cells were divided into four groups：normal group（Normal），T.gondii infected control group（T.gondii），and T.gondii infected groups with low-dose rutin（Rut50）and T.gondii infected groups with high-dose Rutin（rut100）.Then T.gondii infection and rutin treatment experiments were performed，and the levels of antioxidant enzymes SOD，GSH and lipid oxidation product MDA，the levels of inflammatory factors TNF-α，IL-6and IL-1β in the supernatant were detected by ELISA methods.The expression of key proteins in PI3K/AKT/Nrf2/HO-1，TLR4/NF-κB and P2X7R/NLRP3signaling pathways in BV2cells were detected by Western blot.The results showed that50and100μg·mL^－1of rutin had asignificant anti-T.gondii effect in BV2cells，as the T.gondii infection rate，invasion ability and proliferation were significantly inhibited（Plt;0.05）.Rutin also significantly increased the SOD and GSH activities and decreased the MDA content（Plt;0.05），and decreased TNF-α，IL-6and IL-1β levels in the supernatant（Plt;0.05）.And it also significantly up-regulated the expression of key proteins in the antioxidant pathway PI3K/AKT/Nrf2/HO-1，and down-regulated the inflammatory pathway TLR4/NF-κB and P2X7R/NLRP3（Plt;0.05）.These results indicated that rutin has asignificant anti-T.gondii effect in BV2cells in vitro，which may be related to its ability to enhance cellular antioxidant capacity through activation of the PI3K/AKT/Nrf2/HO-1pathway，as well as inhibit the TLR4/NF-κB and P2X7R/NLRP3pathways to attenuate inflammatory responses.These findings may provide some theoretical references for further research on the anti-T.gondii effect of rutin in vivo，as well as its protective effect in T.gondii-induced brain damage.It may also provide some theoretical basis for the development of rutin as apotential therapeutic agent for the treatment of toxoplasmosis in humans and animals.

Key words：rutin; anti-T.gondii effect; BV2cells; antioxidant; anti-inflammatory; PI3K/AKT/Nrf2/HO-1; TLR4/NF-κB; P2X7R/NLRP3

*Corresponding authors：XU Lu，E-mail：xulu0824@126.com；WANG Yueshang，E-mail：wyueshang@hotmail.com

弓形蟲病是一種全球多發性的人畜共患病，由剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）感染引起。弓形蟲是一種胞內寄生蟲，最早發現于1908年^[1]，可感染包括人類在內的幾乎所有溫血動物^[2]，以及少部分涼血動物^[3]。在弓形蟲感染的動物中，家貓和其他貓科動物是其終末宿主，感染率約為45.6%^[4-5]。而所有非貓科動物感染者是其中間宿主，由于地域、品種等差異，它們的感染率存在較大差異。研究發現，世界上約三分之一的人被弓形蟲感染^[6-7]，而其在野生嚙齒動物上的流行率為20%～60%^[8]，野生鳥類上的流行率為13.4%～66.7%^[9]。家養動物中，豬、羊等的感染率較高^[7]，早期的一些研究中，感染率高的豬場中血清抗體陽性率可達87.2%，組織中分離出弓形蟲蟲體的概率可達92.7%，有些牧場中山羊和綿羊的感染率也超過50%，而雞、牛和狗等的感染率較低^[10-12]。需要指出的是，近年來隨著弓形蟲防疫的進步及衛生管理的規范，我國及全球其他地區家養動物中弓形蟲血清陽性率及活蟲分離率都在明顯的下降。此外，野豬、鹿、黑熊、浣熊等陸地野生動物，以及海獺、海象、海獅、海豹等海洋動物中也都能檢出弓形蟲抗體^[7]。弓形蟲急性感染可誘發明顯的神經損傷癥狀，嚴重者甚至導致死亡^[13-15]。孕期弓形蟲感染可導致流產或產后后代行為異常，這與其誘導的胎兒腦部損傷密切相關^[16-18]。

目前，尚無針對弓形蟲感染所致腦損傷的特效藥。雖然磺胺類藥物常用于治療急性弓形蟲感染，但其引起的過敏、結石和肝損傷等副作用嚴重限制了該類藥物在臨床上的廣泛使用^[19]，尤其是對孕畜^[20-21]。研究表明，弓形蟲所致腦損傷與誘導氧化應激和炎癥反應有關，這提示增加腦組織的抗氧化能力及抑制炎癥反應是對抗弓形蟲性腦損傷的潛在途徑。近年來，包括本團隊在內的一些研究表明，一些具有抗炎和抗氧化特性的木犀草苷、白藜蘆醇等植物天然產物具有顯著的抗蟲、抗損傷作用，加之它們無毒或毒性較小的特性，使天然產物成為抗弓形蟲感染的熱門候選藥物^[22-24]。這些天然產物的抗炎、抗氧化特性與調控常見的炎癥反應及抗氧化應激反應相關通路有關。TLR4/NF-κB、P2X7R/NLRP3是弓形蟲感染性機體損傷中常涉及的炎癥反應通路，弓形蟲感染過程中，NF-κB可調節炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的產生^[25]。而木犀草苷、薏苡仁醇等天然產物可抑制TLR4/NF-κB及P2X7R/NLRP3信號通路，減輕弓形蟲所致組織損傷^{[22，24，26]}。PI3K/AKT和Nrf2/HO-1是兩條密切相關的抗氧化信號通路，當PI3K/AKT通路中關鍵蛋白PI3K及AKT的磷酸化比例上升時，PI3K/AKT通路處于激活狀態，而Nrf2是PI3K/AKT激活后的靶基因之一^[27]。被PI3K/AKT激活的Nrf2又可進一步激活Nrf2/HO-1信號通路，促進HO-1的表達，增強細胞的氧化產物清除能力。弓形蟲感染可抑制這兩條抗氧化通路，但樺褐孔菌多糖等可通過增強PI3K/AKT和Nrf2/HO-1通路的抗氧化能力減輕組織損傷^[28]。這些研究表明，利用某些天然產物的抗炎、抗氧化特性是抗弓形蟲及減輕弓形蟲性損傷的可行方案。

蘆丁（rutin，Rut）又名蘆丁苷、槲皮素-3-O-蘆丁苷和槐黃素，是一種植物天然產物，具有明顯的抗氧化和抗炎活性，廣泛存在于蘆丁葉、煙草葉、橘皮、番茄、槐花中，其在槐樹中的含量尤為突出^[29-30]。蘆丁具有維持血管壓力、降低血管滲透性的功能。蘆丁片和曲克蘆丁等可被用于預防和治療腦出血，防治血栓形成，以及治療肝癌、急性出血性腎炎、熱應激性睪丸損傷等^[31-33]。蘆丁還能通過控制炎癥反應，發揮積極的脊髓神經保護作用^[34]。并且，蘆丁有良好的細胞安全性，蘆丁與抗腫瘤藥物聯用時，可減少藥物的不良反應，提高藥物的安全性。但其對弓形蟲感染所致的腦神經損傷的改善作用尚未見詳細報道。BV2細胞，又稱小膠質細胞，是腦組織弓形蟲感染和損傷相關研究中常用的細胞系。因此，本研究首先建立了BV2細胞弓形蟲感染模型，隨后探究了蘆丁抗弓形蟲作用，并從抗氧化及抗炎通路方面初步揭示了其抗蟲的潛在機制，以期為后續開展相關動物體試驗及未來蘆丁在抗弓形蟲感染方面潛在的臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘆丁購自上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%；TNF-α、IL-6和IL-1β的酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒購自BioLegend公司；MDA、GSH和SOD檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所有限公司；Western blot中使用的抗體購自Cell Signaling Technology公司，其中包括TLR4/NF-κB信號通路的關鍵因子的抗體，如TLR4和p-NF-κB p65蛋白；P2X7R/NLRP3信號通路的關鍵因子的抗體，如P2X7R、NLRP3、Caspase1、IL-18和IL-1β蛋白；PI3K/AKT和Nrf2/HO-1信號通路中的關鍵因子的抗體，如p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT、Nrf2、HO-1、NQO-1和GCLC蛋白；以及HRP標記山羊抗兔IgG（IgG-HRP）和管家蛋白GAPDH抗體。弓形蟲RH株和RH-GFP（綠色熒光）株保存于在臨沂大學獸醫寄生蟲實驗室；BV2細胞系購自于中科院上海細胞庫。

電子天平購自美國OHAUS公司；SpectraMax酶標儀購自美谷分子儀器（上海）有限公司；分光光度計購自上海分析儀器三廠；蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 分析蘆丁的細胞毒性

用添加10%FBS的DMEM培養液培養BV2細胞，培養箱溫度為37 ℃，CO₂濃度為5%。將BV2細胞放入96孔板（每孔約5×10⁵個細胞）中培養12h后，在每孔中加入濃度為1、5、10、25、50、100、200、400、800和1000μg·mL^－1的蘆丁，再培養48h。隨后，按照上海碧云天生物技術有限公司CCK-8檢測試劑盒方法，分析蘆丁對BV2細胞的毒性作用。

1.3 測定蘆丁對弓形蟲的半數抑制濃度（IC₅₀）的影響

在96孔板中培養BV2細胞12h，隨后，在每個孔中加入純化的RH-GFP株弓形蟲（約5×10⁴個·孔^－1）和不同濃度的蘆?。?、5、10、15、20、25、50和100μg·mL^－1）。接著培養72h后，用熒光顯微鏡觀察RH-GFP的熒光強度。使用Prism7軟件（GraphPad Software公司，美國）計算蘆丁的IC₅₀，進一步分析其對弓形蟲的抑制作用。

1.4 測定蘆丁對弓形蟲細胞感染率的影響

將BV2細胞培養在96孔板中（約5×10⁵個·孔^－1）12h后，加入純化的RH株弓形蟲（約2×10⁵個·孔^－1）后分為3組，分別為對照組（T.gondii，弓形蟲感染+不治療）、Rut50組（弓形蟲感染+50μg·mL^－1蘆丁治療）和Rut100組（弓形蟲感染+100μg·mL^－1蘆丁治療），共同培養24h。用吉姆薩染色法對細胞進行染色后在光學顯微鏡下觀察并計數。細胞感染率的測定方法如下：細胞感染率=含弓形蟲的細胞數/細胞總數。

1.5 測定蘆丁對弓形蟲入侵細胞能力的影響

將BV2細胞在96孔板中（約5×10⁵個·孔^－1）培養12h后，每個孔中加入純化的RH株弓形蟲（約2×10⁵個·孔^－1）后分為3組，分別為對照組（T.gondii，弓形蟲感染+不治療）、Rut50組（弓形蟲感染+50μg·mL^－1蘆丁治療）和Rut100組（弓形蟲感染+100μg·mL^－1蘆丁治療），共培養2h。然后用鼠源SAG1多克隆抗體作為一抗，山羊抗鼠IgG-Alexa Fluor594作為二抗，孵育后用0.3%Triton X-100/PBS進行滲透。隨后，用兔源SAG1多克隆抗體作為一抗，山羊抗兔IgG-Alexa Fluor488作為二抗進一步孵育。最后，通過間接免疫熒光檢測，測定弓形蟲入侵能力。

1.6 測定蘆丁對弓形蟲細胞內復制能力的影響

利用“1.4”中的細胞樣品分析弓形蟲在細胞內的復制能力。首先，收集“1.4”各組樣品，并使用鼠源SAG1多克隆抗體作為一抗，山羊抗鼠IgG-Alexa-fluor594作為二抗，通過間接免疫熒光法測定細胞內弓形蟲的復制能力。每孔隨機選取100個以上的寄生蟲泡（PV），觀察并計數每個PV中速殖子數量。對照組為感染弓形蟲且未用蘆丁處理的細胞。

1.7 測定添加蘆丁后弓形蟲感染細胞及上清液中抗氧化指標及炎癥因子的水平

首先，將細胞分成4組，分別為：空白對照組（Normal，不感染+不治療），感染對照組（T.gondii，弓形蟲感染+不治療）和Rut50組（弓形蟲感染+50μg·mL^－1蘆丁治療）和Rut100組（弓形蟲感染+100μg·mL^－1蘆丁治療）。隨后，將細胞在96孔板中（約5×10⁵個·孔^－1）培養12h后，感染組、Rut50及Rut100組加入純化的RH株弓形蟲（2×10⁵個·孔^－1），并在Rut50組加入50μg·mL^－1蘆丁，Rut100組加入100μg·mL^－1蘆丁，共培養24h。10000×g離心10min，按照試劑盒說明書檢測細胞內GSH、SOD及MDA的含量，按照ELISA試劑盒說明書檢測上清液中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量。

1.8 測定添加蘆丁后弓形蟲感染細胞中抗氧化及炎癥反應信號通路中關鍵蛋白水平

采用Western blot法檢測BV2細胞中PI3K/AKT、Nrf2/HO-1、TLR4/NF-κB和Nrf2/HO-1信號通路中相關蛋白的表達，以分析蘆丁對弓形蟲誘導的氧化應激及炎癥的抑制作用。收集“1.7”中的BV2細胞，加入裂解液和PMSF（100mmol·L^－1）后，冰上裂解1 h，按照標準程序收集總蛋白并用BCA法測定蛋白質濃度，備用。蛋白質經10%～12%SDA-PAGE分離后，轉移到PVDF膜上，并用5%脫脂奶在室溫下封閉1h。4℃下孵育一抗p-PI3K、p-AKT、PI3K、AKT、Nrf2、HO-1、NQO-1、GCLC、TLR4、p-NF-κB p65、P2X7R、NLRP3、Caspase1、IL-18和IL-1β過夜。第2天，孵育對應的二抗1h，隨后經過洗滌、曝光等步驟，獲得目標蛋白條帶，并用使用Image Lab軟件測定目標蛋白條帶的光密度，分析蛋白表達量。

1.9 數據分析

統計分析采用SPSS20.0中的單因素方差分析和t檢驗（SPSS，Inc.，Chicago，IL，USA）進行。數據以“平均數±標準差”表示。Plt;0.05表示差異具有顯著性。

2 結 果

2.1 蘆丁對BV2細胞的細胞毒性

用不同濃度（1～1000μg·mL^－1）蘆丁處理BV2細胞測定其細胞毒性。如圖1所示，1～1000μg·mL^－1對細胞的抑制率分別為1μg·mL^－1（0）、5μg·mL^－1（0）、10μg·mL^－1（0）、25μg·mL^－1（0）、50μg·mL^－1（0）、100μg·mL^－1（0）、200μg·mL^－1（31.96%）、400μg·mL^－1（44.99%）、800μg·mL^－1（72.5%）或1000μg·mL^－1（94.89%），蘆丁對BV2細胞的IC₅₀為395.1μg·mL^－1（圖1）。因此，1～100μg·mL^－1為蘆丁的細胞安全濃度。

2.2 蘆丁對細胞中弓形蟲抑制率的影響

在1～100μg·mL^－1范圍內，蘆丁對細胞內弓形蟲的抑制能力呈劑量依賴性，具體抑制率如下：1μg·mL^－1（0）、5μg·mL^－1（0）、10μg·mL^－1（0）、15μg·mL^－1（0）、20μg·mL^－1（14.87%）、25μg·mL^－1（26.11%）、50μg·mL^－1（52.62％）、100μg·mL^－1（75.84%）、200μg·mL^－1（86.65%）。如圖2所示，經過計算，蘆丁對細胞內弓形蟲的IC₅₀為51.12μg·mL^－1（圖2），故選擇50和100μg·mL^－1濃度，用于后續探究蘆丁對弓形蟲體外的抗蟲作用及其潛在機制。

2.3 蘆丁抑制弓形蟲在BV2細胞內的增殖

通過測定弓形蟲感染細胞數量、弓形蟲入侵能力、弓形蟲復制能力，綜合分析蘆丁對弓形蟲在BV2細胞內增殖的影響。如圖3所示，與感染弓形蟲的BV2細胞對照組相比，50和100μg·mL^－1蘆丁處理組細胞感染率均顯著下降（圖3A，Plt;0.01），弓形蟲入侵能力顯著降低（圖3B，Plt;0.01）。并且，50和100μg·mL^－1蘆丁處理組中每個寄生蟲泡內弓形蟲蟲體數量多為1或2，提示弓形蟲復制被明顯抑制（圖3C，Plt;0.01）。以上結果表明，50和100μg·mL^－1的蘆丁可顯著抑制弓形蟲在BV2細胞內增殖的影響。

2.4 蘆丁增強弓形蟲感染BV2細胞的抗氧化能力

通過SOD和GSH抗氧化酶以及氧化產物MDA水平的測定，分析蘆丁處理對弓形蟲感染BV2細胞的抗氧化能力的影響。如圖4所示，與空白對照組相比，感染對照組BV2細胞中SOD和GSH水平明顯降低（圖4A、4B，Plt;0.01），而使用50和100μg·mL^－1蘆丁處理后，這兩種抗氧化酶的活性明顯上調（圖4A、4B，Plt;0.01）。同時，感染弓形蟲的BV2細胞中氧化產物MDA水平明顯升高（圖4C，Plt;0.01），而蘆丁能明顯抑制其上調，且當蘆丁濃度為100μg·mL^－1，效果更顯著（圖4C，Plt;0.05或Plt;0.01）。這些結果表明，蘆丁可增強弓形蟲感染BV2細胞的抗氧化能力。

2.5 蘆丁增強弓形蟲感染BV2細胞中PI3K/AKT/Nrf2/HO-1抗氧化信號通路中關鍵蛋白表達

本研究繼續檢測了兩種與抗氧化相關的信號通路中蛋白的表達變化情況，旨在更好地了解蘆丁如何增強弓形蟲感染BV2細胞的抗氧化能力。PI3K/AKT/Nrf2/HO-1抗氧化信號通路由PI3K/AKT通路和Nrf2/HO-1通路組成。通路中磷酸化蛋白的比例通常用來評價PI3K/AKT通路的激活狀態，激活的PI3K/AKT通路又可促進Nrf2的激活，啟動Nrf2/HO-1信號通路，發揮抗氧化應激作用。圖5顯示，弓形蟲感染會顯著降低磷酸化蛋白（p-PI3K和p-AKT）的比例（圖5A～5C，Plt;0.01），而蘆丁處理可顯著增加p-PI3K及p-AKT蛋白的比例（圖5A～5C，Plt;0.01）。這些結果表明，弓形蟲感染可抑制BV2細胞中PI3K/AKT通路，而蘆丁可激活該通路。

為探究被激活的PI3K/AKT通路是否能進一步促進Nrf2/HO-1信號通路的激活，本研究測定了Nrf2/HO-1信號通路關鍵蛋白的表達。如圖6所示，弓形蟲感染BV2對照組中的Nrf2、HO-1、NQO-1和GCLC蛋白均顯著下降（圖6A～6E，Plt;0.01）。當使用50或100μg·mL^－1的蘆丁處理時，這些抑制氧化應激的蛋白明顯上調（圖6A～6E，Plt;0.01）。這些觀察結果表明，蘆丁能增強弓形蟲感染BV2細胞的PI3K/AKT/Nrf2/HO-1抗氧化信號通路。

2.6 蘆丁降低弓形蟲感染BV2細胞的炎癥反應

如圖7所示，BV2細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平在感染弓形蟲后均顯著上調（圖7A～7C，Plt;0.01）。然而，在使用蘆丁治療時，尤其是在蘆丁劑量為100μg·mL^-1時，這三個因子均明顯下調（Plt;0.05或Plt;0.01）。這些結果表明，蘆丁可以抑制弓形蟲感染時BV2細胞中的炎癥反應。

2.7 蘆丁抑制弓形蟲感染BV2細胞中TLR4/NF-κB炎癥反應信號通路中關鍵蛋白表達

為探究蘆丁抑制弓形蟲誘導的BV2細胞內炎癥反應的機制，本研究對炎癥相關的通路TLR4/NF-κB進行了檢測。如圖8所示，TLR4和p-NF-κB p65蛋白在弓形蟲感染BV2細胞中表達量顯著上調（圖8A～8C，Plt;0.01）。經蘆丁處理后，這些TLR/NF-κB通路相關因子的水平顯著降低，尤其是當蘆丁劑量為100μg·mL^－1時（Plt;0.05或Plt;0.01）。這些結果表明，蘆丁可以抑制弓形蟲感染BV2細胞中的TLR4/NF-κB炎癥信號通路。

2.8 蘆丁抑制弓形蟲感染BV2細胞中P2X7R/NLRP3炎癥反應信號通路中關鍵蛋白表達

P2X7R/NLRP3是另一條常見炎癥反應信號通路，如圖9所示，當弓形蟲感染時，P2X7R/NLRP3信號通路的關鍵蛋白P2X7R、NLRP3、Caspase1、IL-1β和IL-18在BV2細胞中均顯著上調（圖9A～9F，Plt;0.01）。蘆丁處理均能顯著降低上述蛋白的水平（Plt;0.05），尤其是蘆丁濃度為蘆丁100μg·mL^－1時（Plt;0.01）。這些結果表明，蘆丁可以抑制弓形蟲感染BV2細胞中的P2X7R/NLRP3炎癥信號通路。

3 討 論

弓形蟲病屬于乙類傳染病，是一類危害嚴重的人畜共患病，其對免疫力受損個體影響更甚，例如當宿主營養不足、感染其他疾病或先天性免疫缺陷障礙等^[35]。目前，市場上尚無針對畜禽的有效疫苗，許多弓形蟲疫苗的開發尚處試驗階段^[36-37]。而臨床中弓形蟲病的常用治療藥物副作用較大，尤其是對孕畜，研究表明，磺胺類藥物可引起肝腎功能損害和過敏反應^[38]，大環內酯類和喹啉類藥物會引起胃腸道不適及過敏反應等^[39]。因此，開發副作用較小的新型抗弓形蟲藥物對弓形蟲的防治具有重要價值。本研究中，弓形蟲感染試驗表明，蘆丁能夠在BV2細胞中抑制弓形蟲的侵入及后續的增殖，發揮良好的抗蟲活性。蘆丁等物質屬于植物中的天然產物，毒副作用相對較小，利用它們的抗炎、抗氧化等特性抑制弓形蟲感染是現行治療弓形蟲病的嘗試性策略之一。本團隊前期研究表明，樺褐孔菌多糖可改善弓形蟲所致肝損傷等，木犀草苷也表現出相似效果^[22]。本研究是對利用天然植物產物抗弓形蟲策略很好的補充，并且在篩選出合適的BV2細胞中抗蟲濃度后，還初步分析了蘆丁抗弓形蟲活性的潛在機制，明確指出其抗蟲活性與增強細胞抗氧化能力及抑制炎癥反應有關。這為后續開展蘆丁體內抗弓形蟲作用的探究，提供了一些基本思路。

氧化反應是生物體內發生的一系列氧化、還原反應，并在反應過程中會產生活性氧（reactive oxygen species，ROS），正常情況下，機體產生的ROS可被SOD、GSH等抗氧化酶清除。但當機體受到一些非正常外界刺激時（例如感染），ROS產生過量^[40]，同時抗氧化酶活性常被抑制，導致ROS進一步積累，產生氧化應激^[41]。研究表明，弓形蟲感染可引起ROS激增，誘發氧化應激，導致組織氧化損傷^[42-43]。抑制氧化應激是弓形蟲病治療的潛在策略，弓形蟲感染時，BV2細胞中抗氧化酶SOD及GSH含量顯著下降，而在感染過程中同步使用蘆丁處理后，這兩類抗氧化酶活性下降的幅度減少，與感染組相比，升高的SOD及GSH活性代表細胞抗氧化應激的能力顯著提升，能夠大幅減少ROS的含量。這項研究雖未直接檢測ROS含量，但通過氧化損傷標記物MDA的含量變化可判斷使用蘆丁處理后，氧化應激反應顯著減弱，這與PI3K/AKT和Nrf2/HO-1激活密切相關。此外，木犀草苷、樺褐孔菌多糖、白藜蘆醇等天然產物也能通過調控Nrf2/HO-1信號通路發揮抗弓形蟲活性^[22，44]。

氧化應激和炎癥反應是相互關聯的生理過程，過度的氧化應激可導致炎癥反應^[45]。本研究表明，弓形蟲感染后，BV2細胞培養液上清中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量顯著上升，這提示弓形蟲感染可促進細胞內這些因子的合成，前期研究顯示這些炎癥因子的上調與TLR4/NF-κB信號通路有關^[46]。使用蘆丁處理后，BV2細胞上清液中炎癥因子含量顯著下降，蛋白表達量檢測表明這與TLR4/NF-κB通路中TLR4及p-NF-κB p65蛋白含量下降有關。弓形蟲感染過程中炎癥小體NLRP3含量上升并引起炎癥因子IL-1β合成增多^[47]，這與P2X7R/NLRP3信號通路激活有關。靶向抑制P2X7R/NLRP3信號傳導是治療炎癥損傷的常用策略^[48]，與此一致，本研究中Western blot結果表明，蘆丁能夠抑制P2X7R/NLRP3炎癥通路中關鍵蛋白的表達，并降低炎癥因子水平。

值得注意的是，雖然本研究初步分析了蘆丁體外抗弓形蟲活性與增強PI3K/AKT/Nrf2/HO-1抗氧化信號通路及抑制TLR4/NF-κB、P2X7R/NLRP3炎癥反應通路有關，但現有數據并未揭示二者之間的關聯性。后續研究中可通過使用拮抗劑^[49]、基因敲除或過表達^[50]以及免疫組化等技術觀測蘆丁誘導的抗氧化能力增強與炎癥抑制之間的具體關聯。同時，此研究中所使用細胞模型是小膠質細胞BV2，由于其是腦內特有的吞噬細胞，加入蘆丁后所表現出的體外抗弓形蟲活性并不普遍適用于所有細胞類型。在后續的研究中，可通過構建更多不同類型細胞的弓形蟲感染模型，探究蘆丁對弓形蟲感染是否具有普遍的體外抗性。另外，BV2細胞中現有發現可為后續開展蘆丁抗弓形蟲活性的體內研究提供參考，這有助于揭示蘆丁對弓形蟲性腦組織損傷的保護作用。

此外，除了抗炎、抗氧化途徑外，其他研究表明天然植物產物的抗蟲作用還與干擾蛋白翻譯、誘導凋亡有關。中藥常山的提取物常山堿，還可作用于蛋白質翻譯的酶脯氨酰-tRNA合成酶，阻礙寄生蟲的生長^[51]。生姜提取物可誘導被弓形蟲入侵的細胞凋亡，并降低機體干擾素和IL-8的產生，減輕炎癥反應，抑制弓形蟲增殖^[52]。甘草提取物甘草查爾酮A可通過影響蟲體脂代謝抑制弓形蟲的復制^[53]。因此，蘆丁是否也能通過類似途徑發揮抗蟲作用也值得進一步探究。

4 結 論

綜上所述，該研究在BV2細胞中探究了蘆丁對弓形蟲感染的抗性，并初步揭示了蘆丁的這種體外抗蟲活性與通過激活PI3K/AKT/Nrf2/HO-1通路從而增強細胞抗氧化能力，以及抑制TLR4/NF-κB、P2X7R/NLRP3通路從而減弱炎癥反應有關。這些結果可為后續開展蘆丁抗弓形蟲體內實驗以及弓形蟲性腦損傷的研究提供部分參考，并為將來把蘆丁開發成治療人畜弓形蟲病的潛在藥物提供一定的科學依據。

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（編輯 范子娟）