MHCⅠ類分子BF2*0201遞呈ALV-J表位結構和遞呈機制解析

摘 要：MHC B2單倍型雞對禽白血病病毒感染有較強抗性，這種抗病性可能與被MHC分子遞呈的表位刺激活化的T細胞產生的免疫應答有關。本研究擬闡明MHCⅠ類分子BF2*0201遞呈ALV-J表位結構和遞呈機制。利用凝膠過濾層析篩選出能與MHCⅠ穩定結合的肽。利用晶體初篩試劑盒在體外培育肽和MHCⅠ的二元復合物晶體，并利用COOT、CCP4和PYMOL等軟件對該晶體結構進行解析和分析。在這項研究中，作者發現二個與BF2*0201穩定結合的ALV-J CTL表位FVDFANRLI和SALQAFREV。得到一個優質晶體BF2*0201-SALQAFREV（SV9），其生長條件為1.0mol·L^-1丁二酸（pH7.0），0.1mol·L^-1HEPES（pH7.0），1%聚乙二醇單甲醚2000。解析高分辨率（1.72 ?）的BF2*0201-SV9復合物結構后發現BF2*0201抗原結合槽整體呈現弱負電性。保守的殘基多位于抗原結合槽的兩端，特異性氨基酸賦予BF2*0201中等大小的抗原結合槽。B、C和F口袋起著較重要的錨定作用，口袋殘基和水分子與抗原多肽形成氫鍵作用，將其固定在抗原結合槽中。SV9表位構象中突出的P4-Gln和P7-Arg殘基的構象特征表明該位點有被特異性TCR潛在識別的特性。BF2*0201-SV9復合物晶體結構特征有助于闡明B2單倍型MHCⅠ類分子BF2*0201遞呈ALV-J表位的機制，有助于解釋B2單倍型雞對ALV存在抗性的原因，為抗病育種工作奠定理論基礎。

關鍵詞：MHC；BF2*0201；ALV-J；遞呈機制；晶體結構

中圖分類號：S852.43

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3132-11

收稿日期：2023-10-19

基金項目：國家自然科學基金面上項目（32172868）；高等學校學科創新引智計劃項目（D20008）

作者簡介：賈玉生（1999-），男，河南南陽人，碩士生，主要從事家禽抗病毒免疫應答研究，E-mail：jiayusheng0922@163.com

*通信作者：代曼曼，主要從事家禽抗病毒免疫應答研究，E-mail：daimanman1229@scau.edu.cn

Structure and Mechanism of ALV-J Epitope Presented by MHC ClassⅠMolecule

BF2*0201

JIAYusheng，LIYilin，MALulu，LIAOMing，DAI Manman^*

（National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis

Prevention and Control，Guangdong Provincial Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control，

College of Veterinary Medicine，South China Agricultural University，Guangzhou510642，China）

Abstract：MHC B2haplotype chickens are highly resistant to avian leukosis virus infection，and this resistance may be related to the activated Tcell immune response stimulated by MHC molecule presented epitopes.This study aims to elucidate the structure and mechanism of ALV-J epitope presentation by the MHC classⅠmolecule BF2*0201.Peptides that can bind stably to MHCⅠwere screened by gel filtration chromatography.The complex crystals of the peptide and MHCⅠwere grown in vitro using acrystal primary screening kit，and the crystal structure was resolved and analyzed using COOT，CCP4and PYMOL.In this study，we identified two ALV-J CTL epitopes FVDFANRLI and SALQAFREV that bind stably to BF2*0201.We obtained ahigh quality crystal BF2*0201-SALQAFREV（SV9）grown under the conditions of1.0mol·L^-1succinic acid（pH7.0），0.1mol·L^-1HEPES（pH7.0），and1%polyethylene glycol monomethyl ether2000.We resolved the structure of the high-resolution（1.72 ?）BF2*0201-SV9complex and found that the BF2*0201antigen-binding groove exhibits weak electronegativity overall.Conserved residues were located at both ends of the antigen-binding groove，and specific amino acids gave BF2*0201a medium-sized peptide-binding groove.The B，C，and Fpockets played an important anchoring role.The residues in pockets and water molecules formed hydrogen bonds with the antigenic polypeptide to anchor it to the peptide-binding groove，and the antigenic polypeptide was in an\"M\"-shaped conformation.The conformational features of the prominent Gln-4and Arg-7residues in the SV9epitope conformation suggested potential recognition of this site by specific TCRs.The crystal structure of BF2*0201-SV9complex can help to elucidate the mechanism of ALV-J epitope presented by BF2*0201，which can help to explain the reason for the resistance of B2haplotype chickens to ALV，and lay atheoretical foundation for the breeding of resistance to the disease.

Key words：MHC; BF2*0201; ALV-J; epitope presentation; crystal structure

*Corresponding author：DAI Manman，E-mail：daimanman1229@scau.edu.cn

感染J亞型禽白血病病毒（avian leukosis virus subgroup J，ALV-J）會引起免疫抑制，降低雞的生產性能，導致家禽業遭受嚴重的經濟損失^[1]。ALV-J可與馬立克病毒（Marek’s disease，MD）和傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease viruses，IBDV）共同感染雞群，造成更嚴重的腫瘤發病率和免疫抑制作用^[2-3]。目前尚未有抗病毒藥物或疫苗防止該病，只能通過淘汰陽性感染雞，凈化種群來控制該病^[4]。然而，我國部分地區仍出現以ALV-J為主的禽白血病病毒感染家禽的情況^[5-8]。因此，為了有效控制ALV-J在雞群中的流行，解析雞體內抗ALV-J感染免疫應答機制十分必要。

本課題組前期研究證明，雞在感染ALV-J后，PBMC中CD8⁺T細胞比例升高，并且細胞毒性相關基因如Granzyme k、NK lysin和IFN-γ的表達水平升高^[9]。CD8⁺T細胞主要識別被MHCⅠ分子遞呈的內源性抗原后活化產生效應應答^[10]。雞MHC分子基因組區域是緊湊而簡單的，且MHC優勢表達一個Ⅰ類分子，決定了MHC與對病毒的易感性和抵抗力密切相關^[11-12]。不同MHC B單倍型雞所表達的MHCⅠ類分子結合抗原肽的基序有差異，導致其遞呈抗原肽的數量也不同，從而激活的T細胞免疫應答存在強弱區別^[13]。解析雞MHCⅠ類分子BF2*2101和BF2*0401分子晶體結構揭示了BF2*2101寬大的抗原結合槽和BF2*0401狹窄的抗原結合槽，解釋了B21單倍型雞有抗病性和B4單倍型雞有易感性的原因^[13]。闡明不同單倍型MHCⅠ分子獨特結構特征并確定這些MHCⅠ分子呈現的肽結合基序將為合理設計T細胞表位提供重要信息^[11]。以往有研究報道MHC B2單倍型雞對禽白血病病毒和馬立克病毒感染有較強抗性^[12，14]。本課題組前期已經鑒定了三條靶向ALV-J MHC B2限制性特異性CD8⁺T細胞表位（授權專利號：ZL202210041210.X）。本研究擬進一步解析MHCⅠ類分子BF2*0201遞呈ALV-J表位的晶體結構和闡明遞呈機制，進而深入揭示B2單倍型雞的抗性原因。

1 材料與方法

1.1 ALV-J病毒多肽的合成

本研究應用的三條靶向ALV-J MHC B2限制性特異性CD8⁺T細胞表位系參考本實驗室前期已發表專利（授權專利號：ZL202210041210.X）。已鑒定的ALV-J抗原表位SALQAFREV、TFVDFANRLI和TVDTASSAI委托上海淘普生物科技有限公司合成，多肽的純度均為95%以上，并以200μL DMSO中含5mg肽的濃度儲存于-20℃備用。

1.2 B2單倍型MHC I分子蛋白的表達

表達BF2*0201的重鏈和輕鏈蛋白的質粒由本實驗室構建并保存。簡而言之，首先利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）獲得α鏈（BF2*02）（殘基22-296；GenBank編號：AY234770.1）和雞β2-微球蛋白（chβ2M）（殘基22-119；GenBank編號：AB178590.1）的序列。利用在線網站TMH MM和SignalP預測兩段蛋白的胞內區和信號肽區，然后截取中間胞外區序列進行密碼子優化后連接到pET-21a（+）載體上。該載體被轉化到大腸桿菌菌株BL21（DE3）中，在37℃表達BF2*0201和chβ2M蛋白。提取包涵體蛋白溶解在6mol·mL^-1鹽酸胍緩沖液中，調整最終濃度為30mg·mL^-1，在-20 ℃下保存。

1.3 pBF2*0201二元復合物的篩選及純化

為生成pBF2*0201復合物，使用逐步稀釋法^[15]以蛋白摩爾比為1∶（3-7）∶1的比例逐步加入chβ2M，ALV-J抗原肽和α鏈至復性液中。24～48h后，復性液通過10kDa Millipore超濾濃縮杯濃縮到50mL，期間需用蛋白緩沖液對復性液進行換洗兩次，再通過10kDa Amicon超離心過濾裝置濃縮1mL的高濃度蛋白復合物。最后，使用AKTA pure蛋白純化儀和Superdex20016/60分子篩層析柱對復合物進行純化，以獲得高純度的pBF2*0201復合物。

1.4 pBF2*0201晶體制備和數據收集

經過復性結合試驗，作者選擇了源自ALV-J的GAG蛋白多肽FVDFANRLI（殘基403-411）和SALQAFREV（殘基374-382）與BF2*0201和chβ2M進行復性和結晶。純化的復合物蛋白濃縮至7和14mg·mL^-1。然后在291K和277K溫度下，通過坐滴法以1∶1的體積比將蛋白與結晶緩沖液混勻。晶體在HR2-144試劑盒第34孔（7mg·mL^-1）中生長良好，條件為1.0mol·L^-1丁二酸（succinic acid）（pH7.0），0.1mol·L^-1HEPES（pH7.0），1%聚乙二醇單甲醚2000（Polyethylene glycol monomethyl ether2000）。晶體在添加了20%甘油作為低溫保護劑的緩沖液中浸泡20～30s，在液氮中儲存。數據在上海同步輻射設施（SSRF）收集，并HKL2000軟件包對晶體數據進行初步處理^[16]，最終收集了高分辨率（1.72 ?）的BF2*0201-SALQAFREV（SV9）二元復合物的完整數據集。

1.5 pBF2*0201晶體結構解析和重修

在蛋白質數據庫（PDB）中搜索獲得BF2*0201蛋白結構（4CVX）^[17]，將其作為模板，使用CCP4i中的MOLREP^[18]程序執行分子置換。使用Coot軟件^[19]對獲得的PDB文件進行校正，然后使用CCP4i中的Refmac5程序^[20]進行多輪細化。使用PHENIX軟件包^[21]中的refine程序進行了額外幾輪精修。最終使用PHENIX軟件包中的PDB Deposition程序評估了模型的立體化學質量。該晶體數據已上傳PDB蛋白數據庫，并獲得PDB號8Z0H。

1.6 pBF2*0201晶體結構分析和繪圖

與抗原肽接觸的殘基使用CONTACT程序^[22]進行識別。包埋面積和原子間的距離利用PyMOL計算。使用PyMOL分子圖形系統生成了結構圖和靜電位面圖，并利用Adobe illustrator對殘基或者結構域進行標注和組圖。

2 結 果

2.1 穩定pBF2*0201二元復合物的篩選和晶體制備

為了篩選出能與BF2*0201穩定結合的多肽，作者分別將三條多肽與BF2*0201和chβ2M共同復性，并利用S200分子篩層析柱對復合物進行純化。吸收峰的三條峰的蛋白分別是未折疊的重鏈多聚物，目標復合物和多余的輕鏈^[23]。根據結果顯示多肽FVDFANRLI和SALQAFREV能與BF2*0201形成穩定的復合物（圖1A和B）。接著，大量表達了BF2*0201-SALQAFREV和BF2*0201-FVDFANRLI（圖1D和E）的復合物，并利用B200分子篩柱對復合物進行純化得到濃度為7和14mg·mL^-1的蛋白液用于晶體的制備。以1∶1的體積比將蛋白復合物與結晶緩沖液混勻，通過坐滴法獲得晶體，每周觀察一次。通過大量條件的篩選，最終得到BF2*0201-SALQAFREV（SV9）的復合物晶體（表1），晶體的生長條件為1.0mol·L^-1丁二酸（pH7.0），0.1mol·L^-1HEPES（pH7.0），1%聚乙二醇單甲醚2000。同時，我們在NCBI篩選了63條源自ALV-J的GAG蛋白，將其序列和SV9序列進行比對后發現有56條（88.89%）序列保守，表明SV9表位是一個保守多肽。

2.2 pBF2*0201的總體結構和抗原結合槽特征

BF2*0201-SV9復合物在P1211空間群中以Most favored（%）98.931.72 ?的高分辨率結晶（表1）。在一個不對稱單元內，一個BF2*0201-SV9的晶胞有四個BF2*0201-SV9分子（圖2A）。Molelule2（57.758）的溫度因子均小于Molelule1（62.959）、Molelule3（61.333）和Molelule4（62.214），表明Molecule2的結構相比于Molecule1、3和4來說更加穩定^[24]。因此，以下分析Molelule2分子來描述pBF2*0201的結構特征。BF2*0201-SV9表現出典型的pMHC-I結構，由重鏈α1、α2和α3結構域和輕鏈β2m的組成。從正上方俯視觀察到抗原肽SALQAFREV平躺在在一個由八個β折疊片層和兩個α螺旋結構形成的抗原結合槽（Peptide-Binding Groove，PBG）內^[25]。α3結構域與CD8分子結合協助啟動T細胞的活化，同時非共價結合β2m，穩定整個MHCⅠ類分子的結構^[26-27]（圖2B和C）。MHCⅠ類分子含六個主要的口袋分別為A到F，在該晶體結構中抗原肽的P1位置的氨基酸殘基Ser（P1-Ser）、P2-Ala、P5-Ala、P3-Leu、P6-Phe和P9-Val分別插入BF2*0201的A、B、C、D、E和F口袋（圖2D）。P4-Gln和P7-Arg的側鏈構象向上突出，暴露于水分子溶劑中，P8-Glu暴露在F口袋上方。

2.3 pBF2*0201復合體的多肽結合槽的分析

口袋是抗原結合槽的內部凹陷，口袋性質如寬窄、深淺、帶電荷性質及親疏水性主要由組成口袋的氨基酸決定^[28]?？诖再|限制該口袋容納多肽殘基的性質，口袋能夠通過與多肽殘基側鏈形成氫鍵或者范德華力將其固定在抗原結合槽（PBG）內部。本研究通過X射線晶體學獲得的BF2*0201-SV9的分子結構。A口袋由Leu5、Tyr7、Tyr58、Gln62、Tyr156、Thr160、Cys161、Trp164、Tyr168組成，容納并結合多肽的第一位氨基酸（P1）。在A口袋內，Tyr7、Gln62、Tyr156、Tyr168與多肽SV9的P1-Ser各形成一個氫鍵，使Ser緊緊的結合在A口袋中。F口袋位于PBG的另一側末端，是一個比較深的錨定口袋，主要容納多肽P9位殘基。F口袋由Asn76、Ile79、Leu80、Arg83、Val93、Trp95、Met113、Phe120、Thr121、Thr140、Lys143和Trp144組成，其中Asn76、Arg83、Thr140和Lys143與多肽的P9-Val分別形成一個氫鍵，從而使P9殘基固定在F口袋（圖3A）。多肽的兩端氨基酸可與抗原結合槽的其他殘基和水分子形成一個保守的氫鍵網絡，使多肽的端部固定下來^[29]。結合分析目前已知的肽結合基序^{[12，23，30]}發現，幾乎所有的肽結合基序在C端位置都偏好結合Val、Leu和Ile。與多肽結合槽兩端開放的MHCⅡ分子相比，MHCⅠ分子多肽結合槽的兩端封閉，進而限制了結合多肽的長度^[31]。

抗原結合槽的中間部分多為高度多態殘基，其賦予MHC分子的B到E口袋不同的性質^[32]，使多肽和MHC特異性結合。組成B口袋的氨基酸有Tyr7、Arg9、Asp24、Val34、Tyr43、Gln62、Ile65、Asn69和Tyr97。多肽SV9的P2位是側鏈較小的Ala，所以只與B口袋兩個氨基酸Tyr7和Gln62形成兩個氫鍵，P2-Ala的插入還依靠B口袋疏水氨基酸提供的疏水性作用力^[23]。由于C、D和E口袋的組成氨基酸含有較多的長側鏈氨基酸和芳香族氨基酸，其側鏈位置較大的特性導致了抗原結合槽中部口袋較淺，主要提供多肽P3至P6位置氨基酸的插入。C口袋由Arg9、Asn69、Ile72和Asp73組成；D口袋由Tyr97、Tyr111、Leu153、Tyr156和Leu157組成；E口袋由Tyr111、Phe130、Trp144、Tyr149和Leu153組成。其中，P5-Ala與Asn69形成1個氫鍵；P3-Leu與Tyr97形成1個氫鍵。E口袋的氨基酸沒有與多肽的P6-Phe形成氫鍵，該殘基的穩定主要依賴于疏水性氨基酸提供的疏水性作用力。

除了口袋殘基與多肽SV9形成氫鍵作用外，雞BF2*0201-SV9多肽結合槽中共11個水分子與多肽SV9形成氫鍵作用（圖3B），其中有5個水分子僅與多肽SV9有氫鍵作用力，另外6個水分子將多肽的錨定殘基和抗原結合槽口袋殘基連接起來。P3位的Leu通過一個水分子連接口袋中的Arg9和Tyr111。Tyr111也與一個水分子連接，此水分子用于連接P6位點Phe。P7位Arg、P8位Gln和P9位Val通過4個水分子連接周圍的氨基酸Asn76、Glu75、Lys143和Arg83，從而形成一個氫鍵網絡穩定多肽錨定殘基側鏈的構象?？乖Y合槽中的水分子與多肽錨定殘基和口袋殘基形成了眾多氫鍵作用，組成一個氫鍵網絡從而穩定多肽SV9在抗原結合槽中的構象。

2.4 P4和P7是TCR潛在的結合位點

pBF2*0201復合體所遞呈多肽SV9電子云密度包裹較好且清晰可見（圖4）。這一結果表明pBF2*0201結晶數據準確可靠，為進一步比較分析多肽SV9遞呈特點提供可信性保證^[33]。完整的多肽SV9呈現出了經典的“M型”構象^[24]，與大多數已解析的pMHCⅠ中多肽的構象一致。用不同的顏色變化來指示多肽的溫度因子時，可見到多肽SV9中部區域的溫度因子相對高于多肽氨基末端和羧基末端，這表明其P4至P7殘基的側鏈柔性較大^[24]。并且利用Pymol比較了肽SV9的P4和P7位置氨基酸的暴露面積和包埋面積。P4-Gln的暴露面積（173.93 ?²）大于包埋面積（136.346 ?²）；P7-Arg的暴露面積（191.428 ?²）大于包埋面積（182.067 ?²）。重要的是P4和P7位置的氨基酸與口袋形成的氫鍵作用極少。以上結果提示P4和P7位置的氨基酸起到與TCR潛在結合并遞呈信息的作用^[34]。

3 討 論

ALV-J感染主要引起雞的免疫抑制，導致造血惡性腫瘤。內臟和血管腫瘤生長進一步導致雞發育緩慢、產蛋量下降和死亡率增加，給養禽業造成巨大經濟損失^[35-38]。前期研究發現雞CD8⁺T細胞效應應答對于ALV-J清除起到關鍵作用^[9]。T細胞免疫應答是T細胞受體（TCR）通過對MHC分子遞呈的抗原表位進行特異性識別而啟動的。而且，TCR必須同時識別結合抗原多肽與MHC分子的復合物才能產生進一步的T細胞應答激活信號^[39]。為了更好闡述MHCⅠ類分子BF2*0201在ALV-J病毒感染過程中的作用及抗病性機制，解析其二元復合物結構非常重要。

pBF2*0201呈現一個經典的MHCⅠ構象，九肽SV9平躺在抗原結合槽內部（圖2A、B和C）。多肽與口袋的對應關系是P1、P2、P5、P3、P6和P9位置的氨基酸分別插入BF2*0201的A、B、C、D、E和F口袋（圖2D）。有研究發現BF2*1201分子結合的肽的P8位置氨基酸會替代P9插入F口袋，而P9位置氨基酸飄在口袋外^[40]。pBF2*0201的結構特征決定了其遞呈肽的分子機制以及被TCR有效識別所需的關鍵多肽構象。晶體結構證明抗原肽呈現“M”狀的構象結合在抗原結合槽內，結合口袋殘基和水分子與多肽氨基酸形成的氫鍵分析后發現，其中B、C和F口袋比較重要。B口袋利用兩個氫鍵以及疏水作用力穩定結合多肽的P2位置氨基酸。A和F口袋形成的氫鍵更加保守，兩個口袋的殘基和水分子均與多肽形成4個氫鍵，使多肽氨基酸固定于抗原結合槽的兩端。C口袋也較深足以容納長側鏈的P5位置氨基酸，但SV9的P5-A在這里只起到連接多肽的作用。D和E口袋較淺，多通過水分子與疏水作用力將多肽殘基固定在口袋（圖3）。“M”的兩個頂點P4和P7的肽構象向上伸出（圖4），B factor較其他位置氨基酸大和肽在口袋內的暴露面積大于包埋面積的特性，共同證明了P4和P7是與TCR結合的潛在位點^{[24，34，41]}。同時有研究發現pMHCⅠ-TCR三元復合物的肽的P7Tyr的大側鏈與TCRs CDR1α和CDR3β相互作用^{[24，34，41-42]}。

以往研究報道B21和B2是具有馬立克氏病抗性的單倍型，Kaufman等^[43]總結了歷史文獻，對雞的單倍型的抗病性進行排序，從抗病性最強的B21和B2到具有易感的B19。研究人員利用X射線晶體結構試驗揭示了不同Ⅰ類分子抗原結合槽的性質，闡明了B21，B2和B14單倍型表現出對疾病的抗性與他們的MHCⅠ的結構有關，進一步通過肽結合基序解釋了不同Ⅰ類分子抗病性差異的原因^[17]。目前有三種機制闡明雞Ⅰ類分子結合寬泛的肽庫，包括BF2*2101具有寬選擇性的氨基酸錨定位點，BF2*0201和BF2*1401具有疏水口袋特性，及BF2*1201可改變結合槽構象結合C端延伸肽的特性^[43]。本文計算BF2*0401、BF2*0201和BF2*2101的抗原結合槽體積分別是1 237.50 ?³、1 435.14 ?³和1 844.74 ?³，暗示BF2*0201的抗原結合槽的大小在BF2*0401和BF2*2101之間^[44]。結合本實驗室前期鑒定的B2MHCⅠ的體外肽結合基序X-A/V/I/L/P/S/G-X-X-X-X-X-（X）-V/I/L表現出寬泛的特征（授權專利號：ZL202210041210.X）可以證明B2單倍型雞對某些禽類病毒具有潛在抗性。早期的研究發現口袋的大小與其能容納的多肽的數量相關^[11]。與BF2*0201共同表現抗性的分子BF2*2101抗原結合槽具有寬大的抗原結合槽，給予其廣泛肽結合基序，因此B21單倍型雞對馬立克病毒有抗性^[17]。分析BF2*0201的肽結合基序發現BF2*0201的B口袋和F口袋均有較多的氨基酸可供選擇結合，且大多數氨基酸選擇屬于疏水性的氨基酸，這些特征證明了BF2*0201具有疏水性口袋的特性。同樣地，BF2*1401也有寬而深的疏水性口袋，可在B口袋容納長側鏈的疏水性氨基酸。并且BF2*1401的寬肽結合槽有利于其結合抗原肽達到提高抗菌性的作用^[17]。與以上幾種經典的抗性分子相比，分析BF2*0401的肽結合基序X-D/E-X-X-D/E-X-X-（X）-E/L/I^[45]后發現其抗原結合槽的B、C和F偏好結合酸性氨基酸，結合其抗原結合槽狹窄的特征導致其對禽病具有易感性^[15]。雖然BF2*1201分子也被確定為具有易感性的分子，但當BF2*1201遞呈九肽時，其保守性氨基酸Arg83側鏈可朝向結合槽外側擺動形成類似于MHCⅡ分子的C端開放式結構，可供更廣泛的抗原表位結合。這種結構特點有助于解釋雞的抗病性機制^[40]。綜合MHCⅠ的肽結合基和病毒序列可以篩選出潛在的表位，而基序的限制性決定了潛在表位的數量，進而影響T細胞應答反應^[11，46]。結合BF2*0201中等寬大的抗原結合槽和寬泛的抗原結合基序特征，有助于闡釋其B2單倍型雞對某些禽類病毒具有抗性的原因^[13]，例如禽白血病毒^[14]。同時解析BF2*0201遞呈表位的分子機制和鑒定B2單倍型MHCⅠ寬泛肽結合基序為培育抗性雞品種提供一種新的思路。目前還有一種方法可以用來培育抗ALV-J雞，即通過CRISPR/Cas9基因組編輯技術修飾在病毒復制周期起到關鍵作用的宿主基因使雞獲得抗性^[47]。并且有研究報道體外表達的chIFN-γ可通過誘導III型ISGs的表達實現抗ALV-J功能^[48]。

4 結 論

本研究利用凝膠過濾層析篩選出2條能與MHCⅠ穩定結合的ALV-J來源的多肽FVDFANRLI和SALQAFREV。并利用晶體初篩試劑盒在體外培育1個多肽和MHCⅠ的二元復合物優質晶體即BF2*0201-SV9。進一步通過解析晶體結構闡明了B2單倍型雞MHCⅠ分子晶體結構及遞呈ALV-J抗原表位的機制，即B、C和F口袋結合多肽的P2、P5和P9殘基對穩定遞呈多肽的構象和結合多肽的親和力極為重要。P4和P7是被TCR潛在識別的位點。通過結構生物學知識解釋B2單倍型雞對ALV存在潛在抗性的原因，重要原因是BF2*0201具有較寬的抗原結合槽和寬泛的肽結合基序特征，有助于其遞呈足夠多的抗原多肽給T細胞，進一步激活T細胞應答反應。本研究擴展了MHC分子遞呈ALV-J抗原肽的機制研究，并為雞的抗病育種提供理論基礎。

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（編輯 白永平）