層狀雙氫氧化物-rFel d1-Can f1融合變應原對小鼠模型過敏反應的預防效果分析

摘 要：旨在預防貓、犬誘導的過敏反應，本研究將貓主要變應原Fel d1與犬主要變應原Can f1融合原核表達，純化制備了rFel d1-Can f1融合變應原。將層狀雙氫氧化物（layered double hydroxides，LDH）與rFel d1-Can f1混合，制備LDH-rFel d1-Can f1，皮下注射法免疫BALB/c小鼠，隨后利用rFel d1-Can f1融合變應原誘導過敏小鼠模型，通過檢測小鼠應激性過敏反應的體溫變化、耳朵點刺試驗、肺部組織切片HE染色、血清IgE水平等指標評價LDH-rFel d1-Can f1對貓犬誘發過敏反應的預防效果。研究表明，LDH與rFel d1-Can f1質量比為7∶1時，LDH可以完全吸附rFel d1-Can f1融合蛋白。LDH-rFel d1-Can f1可以有效緩解應激性過敏反應引起的小鼠體溫下降，顯著減少過敏導致的染料滲透面積。肺部組織切片HE染色結果顯示，LDH-rFel d1-Can f1可以緩解過敏引起的炎癥細胞浸潤。此外，LDH-rFel d1-Can f1免疫后可以誘導小鼠產生較高水平IgG，這為開發抑制寵物貓犬誘發過敏反應的疫苗奠定基礎。

關鍵詞：融合變應原；層狀雙氫氧化物；納米顆粒；寵物過敏

中圖分類號：S852.55；R392.8

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3143-12

收稿日期：2023-10-23

基金項目：海南省自然科學基金高層次人才項目（320RC467）; 海南省科技專項資助（ZDYF2022SHFZ059）; 國家自然科學基金（32160837; 31860726）; 國家級大學生創新創業訓練計劃項目（202310589043）

作者簡介：彭美琪（1996-），女，重慶潼南人，碩士，主要從事寵物貓犬變應原納米疫苗研究，E-mail：pengmeiqi1019@163.com

*通信作者：韋雙雙，主要從事生物化學與分子生物學研究，E-mail：3657733@qq.com；裴業春，主要從事疫苗與免疫學研究，E-mail：ycpei@hainanu.edu.cn

Preventive Effect of Layered Double Hydroxide-rFel d1-Can f1Fusion Allergens on

Anaphylaxis in Mouse Model

PENGMeiqi，WEIChunjie，ZHENGAnqi，ZHUYikun，XULinhao，LUOChenghui，

WEIShuangshuang^*，PEIYechun^*

（School of Life and Health Sciences，Hainan University，Haikou570228，China）

Abstract：To prevent allergic reactions induced by cats and dogs，we purified rFel d1-Can f1fusion allergen by fusion prokaryotic expression of cat primary allergen Fel d1and dog primary allergen Can f1.We mixed Layered double hydroxides（LDH）with rFel d1-Can f1to prepare LDH-rFel d1-Can f1and immunized BALB/c mice by subcutaneous injection.Subsequently，we used rFel d1-can f1fusion allergen to induce allergic mice models.We evaluated the preventive effect of LDH-rFel d1-Can f1on allergic reactions caused by cats and dogs through anaphylaxis，ear prick test，Hamp;E staining of lung tissue sections，and serum IgE level.The results showed that LDH could completely adsorb the fusion protein of rFel d1-Can f1when the mass ratio of LDH to rFel d1-Can f1was7∶1.The LDH-rFel d1-Can f1can effectively relieve the hypothermia caused by stress allergic reaction in mice，and significantly reduce the dye penetration area caused by allergy.Hamp;E staining of lung tissue sections showed that LDH-rFel d1-Can f1could relieve inflammatory cell invasion caused by the allergy.In addition，the LDH-rFel d1-Can f1can induce mice to produce higher levels of IgG，which lays the foundation for the development of vaccines that inhibit allergic reactions induced by pet cats and dogs.

Key words：fusion allergens; layered double hydroxides（LDH）; nanoparticle; pet allergies

*Corresponding authors：WEI Shuangshuang，E-mail：3657733@qq.com；PEI Yechun，E-mail：ycpei@hainanu.edu.cn

貓和犬是最普遍的家庭寵物，也是室內過敏原的重要來源，影響了世界10%～20%的人口^[1]。長期以來，對貓和犬的過敏一直被認為是過敏性鼻炎和哮喘的主要危險因素之一。韓國成年人對犬和貓過敏情況的調查結果顯示，407名犬主人中有103人（25.3%）對犬或貓過敏，130名貓主人中有45人（34.6%）對犬或貓過敏^[2]。在中國，不同地區對貓和犬過敏的嚴重程度各不相同。據報道，中國鄭州地區貓毛致敏率為30.8%，犬毛致敏率為34.5%^[3]；而廣東珠江三角洲經濟發達地區貓毛致敏率為8.1%，犬毛致敏率為11.8%^[4]。目前，在世界各國家和地區中，貓犬誘發的過敏反應發病率上升趨勢明顯^[1]，其中最主要的一個原因是越來越多的家庭或個人飼養了貓或犬，據統計，全世界有33%的家庭養犬、23%的家庭養貓^[5]。貓和犬的變應原主要存在于它們的毛發、唾液和尿液中，并通過脫落的毛發和皮屑傳播到環境中。

截至2023年，世界衛生組織/國際免疫學會聯合會（WHO/IUIS）過敏原命名小組委員會數據庫（http：//www.allergen.org）記錄了8種貓變應原和8種犬變應原。其中，Fel d1為貓的最主要變應原，最早由Ohman等^[6]在1974年發現并鑒定，主要產生于貓的皮脂腺而后分泌到皮毛上，其次在貓的舌下唾液腺和肛門腺也有分泌。Fel d1相對分子質量約17000，是由分別含70和90～92個氨基酸的兩段多肽通過二硫鍵連接而成的異源二聚體。90%～95%對貓過敏的患者血清中可檢測到針對Fel d1的特異性IgE抗體，貓變應原提取物中60%～90%的變應原活性由它提供^[7-8]。而Can f1最早是由Schou等^[9]在1991年發現并命名，它主要存在于犬的皮屑、毛發、尿液和唾液等部位^[10]。Can f1屬于Lipocalin蛋白家族，其相對分子質量為23000～25000，是犬的主要變應原^[11]，在對犬皮屑IgE結合的皮膚針刺試驗反應中，Can f1所占陽性反應高達70%^[12]。在對犬過敏的患者調查中發現，50%～90%患者體內存在抗Can f1的抗體^[13-15]。

變應原的暴露是變應原致敏和氣道過敏的重要促成因素。目前，貓和犬所致的過敏性疾病的最有效預防方法是規避變應原。但是研究表明，空氣中的顆粒物也可以攜帶貓和犬的變應原，其中PM2.5～10顆粒中的貓和犬過敏原較高^[11]，這使得貓和犬的變應原也無處不在。貓和犬所致的過敏性疾病最有效的治療方法是過敏原特異性免疫治療。該方法主要是使用粗過敏原提取物誘導免疫耐受。然而，過敏原特異性免疫治療方法耗時長，且天然變應原粗提取物的成分復雜、廠家和批次不同、含量不穩定，不利于變應原的標準化，易引起強烈的過敏反應，甚至給過敏患者帶來一定致命危險。此外，對犬過敏患者進行特異性免疫治療的療效不佳^[16]。

層狀雙氫氧化物（layered double hydroxides，LDH）是由兩種或者兩種以上的金屬元素組成的具有類水滑石樣層狀晶體結構的一種氫氧化物。小鼠試驗表明，記憶性T細胞的壽命只有14～60d（CD4⁺記憶性T細胞）或20～91d（CD8⁺記憶性T細胞）^[17-20]，LDH可以有效裝載抗原，在注射部位持續釋放和持續免疫刺激，能夠誘導有效的免疫反應，可持續四個多月^[21-22]。相關研究已經證實了層狀雙氫氧化物（LDH）納米顆粒作為佐劑的安全性和有效性^[21，23-25]。

目前，貓、犬等寵物誘發的過敏反應困擾著許多養寵家庭，但缺乏行之有效的辦法。本研究將貓的主要變應原Fel d1和犬的主要變應原Can f1融合在一起，表達出貓、犬融合變應原，并利用LDH加載，擬制備LDH-rFel d1-Can f1，探究其對貓犬過敏癥的預防效果。此外，本研究采用了應激性過敏反應、耳朵點刺試驗、血清IgE水平、肺部組織細胞浸潤等指標來評價預防效果，這些指標是評價動物模型過敏嚴重程度的重要指標^[26]。本研究為開發能同時抑制貓、犬誘發過敏的納米疫苗提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、質粒及主要試劑

E.coli BL21（DE3）感受態細胞，原核表達載體pQE80L，均為海南大學生物技術制藥與分子藥理學實驗室保存；IPTG、MgCl₂、AlCl₃、Taq酶、EL-TMB顯色試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；鎳柱，購自凱杰企業管理（上海）有限公司；BamHⅠ和SalⅠ酶購自美國NEB公司；鼠抗His-tag、Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody，HRP，購自美國賽默飛公司。

1.1.2 實驗動物

6～8周齡雌性BALB/c小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，試驗前1周小鼠自由飲食以適應環境，動物試驗的開展均通過海南大學倫理委員會的批準（HNUAUCC-2021-00002），符合海南大學實驗動物倫理與福利要求。

1.2 方法

1.2.1 重組質粒的構建

Fel d1、Can f1序列均來自NCBI GenBank庫（Fel d1：LOC677877；Can f1：O18873.1）。將兩個基因序列融合并全基因合成后連接至原核表達載體pQE80L上，構建了重組質粒pQE80L-rFel d1-Can f1。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化

將質粒pQE80L-rFel d1-Can f1轉入E.coli BL21（DE3）感染態細胞，利用IPTG誘導培養6h后收集菌體，超聲破碎，利用鎳柱親和層析法純化目的蛋白。

1.2.3 Western blot檢測rFel d1-Can f1融合蛋白

將純化的rFel d1-Can f1融合蛋白進行Western blot檢測。5%的脫脂奶粉37℃封閉2h，一抗（鼠抗His-tag，1∶1000稀釋）孵育，HRP標記二抗（羊抗小鼠IgG，1∶5000稀釋）孵育，最后利用Typhoon FLA9500熒光掃描成像系統進行檢測。

1.2.4 LDH的制備與表征

LDH的制備采用共沉淀法。A液：0.6mol·L^-1MgCl₂5mL、0.6mol·L^-1AlCl₃1.7mL、ddH₂O3.3mL；B液：0.15mol·L^-1NaOH40mL；將A液逐滴加入持續攪拌的B液中。混懸液5000g離心5min，收集沉淀，ddH₂O洗滌沉淀兩次，隨后利用40mL ddH₂O重懸沉淀，100℃水浴16h。所制得的LDH混懸液長時間放置不分層。

LDH表征采用了激光粒度分析儀（Malvern Instrument，MAL1077738zetasizer nano ZS90）對LDH進行粒徑分析，利用場發射透射電鏡（Thermo Fisher，Talos F200X G2）對LDH進行形態特征觀察。

1.2.5 LDH與rFel d1-Can f1的吸附試驗

將LDH與rFel d1-Can f1蛋白分別以不同質量比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1和9∶1）進行混合，離心后取上清，通過SDS-PAGE電泳檢測LDH與rFel d1-Can f1蛋白的吸附情況。

1.2.6 LDH-rFel d1-Can f1免疫小鼠

將小鼠隨機分為3組，每組6只小鼠，重復3次。LDH-rFel d1-Can f1免疫組：第0和14天皮下多點注射100μL LDH-rFel d1-Can f1（含LDH280μg，rFel d1-Can f135μg），免疫兩周后利用rFel d1-Can f1誘發小鼠過敏模型。第28和35天，腹腔注射100μL氫氧化鋁佐劑-rFel d1-Can f1混合物（含氫氧化鋁佐劑5mg，rFel d1-Can f1100μg），第42、44、46天利用rFel d1-Can f1（1mg·mL^-1）對小鼠進行灌肺，每次100μL。第48天后進行檢測。正常小鼠組（Naive）在對應時間點利用PBS代替。而過敏小鼠組（Allergic mice）：第0和14天在小鼠頸部皮下多點注射PBS100μL；第28天后的處理同LDH-rFel d1-Can f1免疫組。

1.2.7 應激性過敏反應

注射100μL rFel d1-Can f1融合變應原（1mg·mL^-1）至小鼠尾靜脈中，記錄90min內小鼠處于的體溫變化，每隔5min記錄一次。將體溫變化曲線下的面積進行統計分析（One-Way ANOVA）。

1.2.8 耳朵點刺試驗

尾靜脈注射200μL0.5%伊文思藍（Evans blue），30min后將小鼠麻醉，使用23G刺血針刺穿小鼠耳部皮膚，在刺穿位置滴一滴rFel d1-Can f1融合變應原（500μg·mL^-1）。1h后麻醉處死小鼠，用密度檢測法檢測小鼠耳部伊文思藍染料的滲漏面積。

1.2.9 肺部組織HE染色

處死小鼠后，將肺部組織置于5%多聚甲醛固定液中進行固定。隨后將肺部組織包埋至蠟塊中，切成5mm的薄片，利用HE染色法進行染色。細胞浸潤程度采用Kuan法進行評分。此評分方法是統計血管壁周圍（評分0～3）和細支氣管周圍（評分0～3）細胞浸潤的數量（評分0～3）^[27]。

1.2.10 ELISA檢測小鼠血清IgE、IgG、IgG1、IgG2a水平

利用rFel d1-Can f1（10μg·mL^-1）抗原包被過夜，接著用5%脫脂奶粉封閉，隨后孵育一抗（小鼠血清）和二抗（羊抗鼠IgE、羊抗鼠IgG、羊抗鼠IgG1、羊抗鼠IgG2a），隨后利用TMB顯色試劑盒進行顯色反應，最后利用酶標儀測定吸光值OD_450nm。

1.2.11 統計學處理

應用Graphpad Prism8.0.2軟件進行數據處理分析，對符合正態分布的計量資料采用“均數±標準差（x-±s）”表示，多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）進行分析，以*.Plt;0.05，**.Plt;0.01，***.Plt;0.001代表差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 原核表達質粒pQE80L-rFel d1-Can f1的驗證

構建的原核表達質粒pQE80L-rFel d1-Can f1，利用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定和PCR驗證。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示，在1000bp處可見大小符合預期的單一目的條帶（圖1A泳道2、圖1B泳道2），將重組質粒由生工生物（上海）有限公司進行測序進行確認序列正確。

2.2 融合變應原rFel d1-Can f1的表達與純化

將原核表達質粒pQE80L-rFel d1-Can f1轉化至E.coli BL21（DE3），利用IPTG誘導目的蛋白的表達，收集IPTG誘導的菌體，超聲破碎取上清，鎳柱親和層析純化目的蛋白。SDS-PAGE蛋白電泳結果顯示，與非誘導組相比（圖2A泳道IPTG-），加入IPTG誘導后，可以表達rFel d1-Can f1融合變應原（相對分子量為35ku，見圖2A泳道IPTG+），且呈可溶性表達（圖2A泳道S）。利用鎳柱純化后，可以得到較單一的目的條帶（圖2A泳道E1～E6）。Western blot檢測結果與SDS-PAGE電泳結果一致（圖2B）。結果表明，成功表達并純化得到rFel d1-Can f1融合蛋白。

2.3 LDH的制備與表征

利用共沉淀法成功制備長時間放置不分層的LDH懸液，利用激光粒度分析儀和場發射透射電鏡對其粒徑、形態進行了表征（圖3）。激光粒度分析儀結果顯示，LDH的粒徑為100nm左右（圖3A），透射電鏡結果顯示，LDH呈六邊形，棱角分明，粒徑大小在100nm左右（圖3B），說明所制備的LDH納米粒晶體呈片層形態，符合納米粒晶體形態，可用于后續研究。

2.4 LDH與rFel d1-Can f1的吸附試驗

將所制得的LDH混懸液與rFel d1-Can f1蛋白分別以不同質量比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1和9∶1）進行混合，通過SDS-PAGE檢測離心后的上清蛋白殘留量，以此判斷LDH與rFel d1-Can f1蛋白的吸附情況。如圖4所示，在LDH與rFel d1-Can f1的質量比為7∶1時（圖4泳道7），可觀察到上清蛋白殘留量基本為零，說明rFel d1-Can f1被LDH基本吸附，相對來說此比例吸附效果最好。

2.5 LDH-rFel d1-Can f1預防貓犬誘發的過敏反應

為了研究層狀雙氫氧化物與融合變應原的混合物LDH-rFel d1-Can f1對寵物貓犬誘發的過敏反應的預防作用，利用LDH-rFel d1-Can f1對小鼠進行免疫，隨后利用融合變應原rFel d1-Can f1誘導小鼠過敏模型。

具體免疫示意步驟如圖5A。將正常的BALB/c小鼠分為3組，分別是正常小鼠組（Nave）、過敏小鼠組（Allergic mice）、LDH-Fel d1-Can f1免疫組。具體免疫過程見“1.2.6”。應激性過敏反應中，過敏小鼠會出現體溫下降，由圖5B可以看到，過敏小鼠的體溫在30～40min出現了約3℃的下降，而LDH-rFel d1-Can f1免疫組則較好地緩解小鼠體溫下降的趨勢，與正常小鼠（Naive）的表現接近。對體溫下降曲線與Y=0虛線所圍成的面積進行統計，LDH-rFel d1-Can f1免疫組與過敏小鼠組（Allergic mice）有顯著差異（圖5C），這表明LDH-rFel d1-Can f1免疫組小鼠的應激性過敏反應減弱。對小鼠血清IgE進行檢測發現，LDH-rFel d1-Can f1免疫組的小鼠血清IgE呈較高水平，與過敏小鼠組（Allergic mice）類似，均顯著高于正常小鼠，這暗示了在檢測的時間內LDH-rFel d1-Can f1免疫后并未能下調血清IgE水平。小鼠耳朵點刺試驗如圖6所示，當抗原刺激小鼠時，可以發現過敏組小鼠耳朵的Evan blue染料外滲最為嚴重（圖6B）。而LDH-rFel d1-Can f1免疫后，可以有效緩解Evan blue染料的滲出（圖6C），這說明了皮下毛細血管的擴張緩解，組織液滲出減少。將小鼠肺部組織進行HE染色，觀察肺部組織細胞侵潤情況，結果如圖7所示，過敏組小鼠的肺部有較多炎癥細胞的侵潤（圖7B），研究表明，過敏性哮喘肺部炎癥細胞主要是嗜酸性粒細胞^[27]，經LDH-rFel d1-Can f1免疫后，小鼠的肺部組織的炎癥細胞浸潤顯著減少（圖7C），對炎癥細胞浸潤嚴重程度進行打分統計，結果顯示（圖7D），與過敏組小鼠組相比，LDH-rFel d1-Can f1免疫組可以有效緩解肺部組織的炎癥細胞侵潤。此外，LDH-rFel d1-Can f1免疫后可以顯著提高IgG、IgG1、IgG2a等水平（圖8），且與正常小鼠組相比，LDH-rFel d1-Can f1組的IgG2a/IgG1的比值顯著升高（圖8D），這暗示了小鼠體內偏向Th1型細胞反應^[26]。

綜上，LDH-rFel d1-Can f1免疫組可以有效預防貓犬誘發的過敏反應，包括減弱應激性過敏反應，減少皮下組織液滲出，減少肺部組織炎癥細胞侵潤等，但血清IgE未出現下調，這可能是IgE的下調需要較長時間。

3 討 論

貓和犬是世界上范圍廣、數量多的家庭寵物，也是最重要的室內過敏原來源之一^[7]。目前，貓犬所誘發的過敏性疾病的應對方法包括規避變應原、藥物對癥治療、變應原特異性免疫治療等三種主要方式。三種應對方法均存在明顯缺陷。例如貓或犬的變應原無處不在，這讓避免接觸變應原變得十分困難。而藥物對癥治療治標不治本。變應原特異性免疫療法可能引發嚴重副作用的風險、持續時間可能需要數年等。因此，針對貓犬所誘發的過敏性疾病，疫苗可能是更好的選擇。目前，貓或犬的過敏相關疫苗研究也有一些報道，例如利用重組Fel d1蛋白疫苗誘導免疫耐受來預防貓誘發的過敏反應^[28]，在淋巴結注射三次MAT-Fel d1疫苗后可以通過增加細胞內化、激活炎癥小體等方式誘導Fel d1的免疫耐受^[29]，蛋白疫苗與DNA疫苗共免疫可以誘導調節性T細胞抑制貓誘發的過敏反應^[27]，針對犬主要變應原Can f1抗原表位設計的低過敏性疫苗^[10]等，但是缺乏同時針對貓和犬誘發的過敏反應的疫苗。由于貓變應原和犬的變應原無處不在，即使是在沒有寵物的環境中，其變應原水平也足以使人過敏并引起癥狀^[5]。此外，有些貓過敏患者對犬的變應原也呈現敏感癥狀，這表明貓主要變應原Fel d1和犬主要變應原Can f1可能交叉反應^[2]。如果只是針對貓變應原或者犬的變應原其中之一來設計疫苗，則有可能即使過敏患者接種了疫苗，沒有在疫苗設計內的另一種變應原依然可以誘發過敏反應。因此，將貓變應原和犬變應原融合在一個疫苗里，可能其防治效果會更好，這也是本研究將貓主要變應原Fel d1和犬主要變應原Can f1進行融合表達的重要依據。此外，對509名貓過敏個體的血液分析中發現，重組Fel d1的陽性檢測率為94.1%，與天然Fel d1的陽性檢測率96.1%十分接近^[30]。這表明了重組變應原與貓體內的天然變應原相當，可以用于貓過敏的診斷和疫苗開發^[1]，也為本研究進行疫苗設計時選擇重組變應原提供了參考。

應激性過敏反應可以評價過敏患者再次遇到變應原時的過敏表現，而小鼠的應激性過敏反應最直接的表現往往是出現體溫下降^[27]。本研究在應激性過敏反應中，過敏組小鼠出現了明顯體溫下降，而LDH-rFel d1-Can f1免疫后可以有效緩解體溫下降趨勢。皮膚紅疹增加是貓犬誘發的過敏反應的癥狀之一^[31]，本研究利用小鼠耳朵點刺試驗，根據局部皮膚的染料滲出的嚴重程度評估小鼠過敏反應的嚴重程度。在耳朵點刺試驗中，過敏小鼠因過敏反應引起血管擴張，Evan blue染料外滲，而LDH-rFel d1-Can f1免疫可減少過敏導致的皮下組織液滲出，使Evan blue染料滲出減少。肺部炎癥細胞侵潤增加是過敏患者的內在癥狀之一^[27]，本研究通過肺部組織HE染色，觀察到LDH-rFel d1-Can f免疫后，小鼠肺部組織炎癥細胞的侵潤明顯減少。這些指標的變化趨勢與針對貓的過敏相關疫苗研究結果類似^[10，26-27]。這表明了LDH-rFel d1-Can f具有預防貓犬主要變應原誘發的過敏反應的潛力。

過敏反應普遍認為與Th1/Th2失衡有關，在過敏進程中，Th2免疫占主導地位^[26，32-33]。研究表明，LDH充當疫苗佐劑可以誘導產生較高的體液反應，且持續時間長，此外還可以誘導偏向Th1細胞反應^[34]。而一項針對百日咳毒素疫苗研究也表明，LDH作為疫苗佐劑對體液免疫反應有增強作用，與商用鋁佐劑相比效果顯著^[35]。本研究利用LDH加載貓犬主要融合變應原rFel d1-Can f1，制備了LDH-rFel d1-Can f1納米融合變應原，研究發現其可以誘導產生了較高水平IgG，同時IgG1和IgG2a也升高，且IgG2a/IgG1比值升高，這暗示了小鼠體內可能偏向Th1型細胞反應^[26，36]，從而預防了貓犬引起的過敏癥狀。

綜上，本研究設計了LDH-rFel d1-Can f1納米融合變應原，研究表明其可以有效預防貓犬誘發的過敏反應，其作用機制可能是誘導產生了較高水平IgG，偏向Th1型細胞反應，抑制了過敏癥狀。該融合變應原的設計的優點之一是同時包含貓犬的主要變應原，這有助于開發一種可以同時預防貓犬誘發過敏反應的疫苗，具有較好的臨床應用前景。

本研究也存在不足之處。過敏原總IgE是檢測過敏的重要指標之一，IgE越多說明過敏情況越嚴重。但是作者發現，LDH-rFel d1-Can f1納米融合變應原并不能抑制血清IgE的升高，這可能是因為此次研究中的融合變應原rFel d1-Can f1是完整蛋白，其含有多個IgE表位，由此造成了IgE水平的升高。有研究表明，Fel d1是一種由八個螺旋組成的全螺旋蛋白，在其三維結構的分析中，發現其含有三個已確定的Fel d1IgE表位^[37]。而犬主要變應原Can f1也含有多個IgE表位^[38]。而且這也可能也是重組蛋白用于免疫的一個缺陷^[26]，為了避免此類問題，在后續的研究中可以設計融合表位來解決完整蛋白中存在的多IgE表位問題。

4 結論

本研究構建了貓主要變應原Fel d1和犬的主要變應原Can f1融合表達的原核表達質粒pQE80L-rFel d1-Can f1，進而表達與純化了rFel d1-Can f1融合變應原。利用共沉淀法制備并表征了LDH顆粒，并確定了LDH與rFel d1-Can f1加載的最佳比例為7∶1（質量比）。研究發現，LDH-rFel d1-Can f1納米融合變應原可以有效緩解貓犬融合變應原rFel d1-Can f1誘發的過敏反應，且LDH-rFel d1-Can f1可以誘導產生較高水平IgG，為研究可以抑制貓、犬誘發的過敏反應的相關疫苗提供了重要的參考。

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（編輯 白永平）