負(fù)載七葉苷的水凝膠制備及初步評(píng)價(jià)

摘 要：本試驗(yàn)旨在制備一種可用于局部遞送七葉苷的水凝膠。選擇羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）與羧甲基殼聚糖（CMCS）為原料，向其中添加七葉苷（ESC），制備負(fù)載七葉苷的CMC-Na/CMCS水凝膠（CCE），并對(duì)其性質(zhì)和功能進(jìn)行研究。本試驗(yàn)成功制備了CCE水凝膠，并以不同比例的CMC-Na/CMCS設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，依據(jù)載藥量和包封率篩選，最終確定水凝膠的配方為2%CMC-Na、2%CMCS、200μL京尼平，轉(zhuǎn)速為800r·min^-1，水凝膠外觀為藍(lán)色溶液，無(wú)析出、無(wú)雜質(zhì)、透明度均勻；掃描電鏡可見(jiàn)其具有三維結(jié)構(gòu)和許多光滑小孔；粒徑為0.8415nm，Zeta電位為-32.1mV; 傅里葉紅外光譜和X射線衍射均表明七葉苷成功載入到CMC-Na/CMCS水凝膠中且未影響其原有的官能團(tuán)；溶脹率為234%；體外釋放時(shí)間比原料藥明顯延長(zhǎng)；同濃度載藥凝膠比原料藥抗菌效果有所延長(zhǎng)，效果較好。本試驗(yàn)成功將七葉苷載入到了CMC-Na/CMCS水凝膠中，并通過(guò)系列試驗(yàn)證明其相較七葉苷原料藥具有一定的緩釋作用，可以延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，減少給藥次數(shù)，為臨床使用七葉苷治療疾病提供了一種新的給藥方式。

關(guān)鍵詞：羧甲基纖維素鈉；羧甲基殼聚糖；七葉苷；水凝膠；藥物遞送

中圖分類號(hào)：S859.53

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）07-3155-08

收稿日期：2023-09-21

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目，植物提取物敢于奶牛子宮內(nèi)膜損傷修復(fù)創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)（2022ZD100）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（ELDC202201）；

作者簡(jiǎn)介：丁 澤（1998-），男，山西靈丘人，碩士，主要從事獸醫(yī)臨床藥理學(xué)研究，E-mail：1425562092@qq.com

*通信作者：劉俊峰，主要從事獸醫(yī)臨床藥理學(xué)研究，E-mail：ljfdky@126.com

Preparation and Preliminary Evaluation of Hydrogel Loaded with Esculin

DINGZe^1，2，ZHANGYaofeng^1，2，MABei^1，2，LIUPan^1，2，DONG Tianzhen^1，2，

WANGTianyang^1，2，LIUJunfeng^1，2*

（1.School of Animal Science and Technology，Tarim University，Alar843300，China;

2.Tarim Animal Disease Diagnosis and Prevention and Control Engineering Laboratory of

Xinjiang Production and Construction Corps，Alar843300，China）

Abstract：The aim of this experiment was to prepare ahydrogel that can be used for local delivery of esculin.Carboxymethyl cellulose sodium（CMC-Na）and carboxymethyl chitosan（CMCS）were selected as the raw materials，to which esculin（ESC）was added to prepare Esculin-loaded CMC-Na/CMCS hydrogel（CCE）for topical drug delivery，and its properties and functions were investigated.In this experiment，the CCE hydrogel was successfully prepared，and orthogonal tests were designed with different ratios of CMC-Na/CMCS，based on the screening of drug loading and encapsulation rate，and the formulation of the hydrogel was finally determined as2%CMC-Na，2%CMCS，200μL of Genipin，and the rotational speed was800r·min^-1，and the appearance of the hydrogel was ablue solution，with no precipitation and impurity-free transparency and uniformity; Scanning electron microscopy showed that it had athree-dimensional structure and many smooth pores; the particle size was0.8415nm，and the zeta potential was-32.1mV; Fourier infrared spectroscopy and X-ray diffraction showed that esculin was successfully loaded into the CMC-Na/CMCS hydrogel without affecting its original functional groups; the solubilization rate was234%; the in vitro release time was significantly prolonged compared with that of raw materials; the antibacterial effect was prolonged compared with raw materials at the same concentration of loaded gel.The antimicrobial effect was prolonged and better than that of raw materials.In this experiment，we successfully loaded esculin into CMC-Na/CMCS hydrogel and proved through aseries of experiments that esculin has acertain slow-release effect compared with the API，which can prolong the action time of the drug and reduce the number of times of administration，providing anew way of administration for the treatment of diseases with Esculin in clinical practice.

Key words：sodium carboxymethyl cellulose; carboxymethyl chitosan; esculin; hydrogel; drug delivery

*Corresponding author：LIU Junfeng，E-mail：lifdky@126.com

水凝膠是一種具有三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子材料^[1]，具有優(yōu)良的生物相容性、可降解性和負(fù)載能力，被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域^[2-3]，水凝膠良好的理化性質(zhì)使其成為包封不穩(wěn)定物質(zhì)的優(yōu)良系統(tǒng)，通過(guò)改變構(gòu)建材料達(dá)到對(duì)水凝膠形態(tài)和性能的控制，使其可以根據(jù)需要來(lái)達(dá)到對(duì)環(huán)境的適應(yīng)（如：酸性、堿性環(huán)境、溫度濕度改變的環(huán)境等）和控制載藥量及藥物釋放時(shí)間的長(zhǎng)短^[4-5]。

甲殼素和纖維素均在自然界分布廣泛，是非常豐富的可再生資源，二者均具有易獲得、可再生、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)^[6]。羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）是應(yīng)用最廣泛的纖維素衍生物，其改善了纖維素不溶于水和一般有機(jī)溶劑的缺點(diǎn)，羧甲基纖維素鈉易溶于水，且水溶液具有一定的黏度，還具有高生物相容性、生物可降解性、無(wú)毒性、可減少炎癥滲出物、附著微生物和促進(jìn)傷口愈合等優(yōu)良特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)藥等行業(yè)^[7-8]。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）是一種重要的甲殼素衍生物，羧甲基殼聚糖相較常見(jiàn)的殼聚糖，其可以在中性水溶液中溶解，具有抑菌、止血、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等特點(diǎn)，被廣泛作為抗菌水凝膠的基材^[9-11]。京尼平（genipin，GNP）是一種優(yōu)良的天然交聯(lián)劑^[12]，其攜帶的醛基能與羧甲基殼聚糖中的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)自組裝生成水凝膠^[13]。

七葉苷（esculin，ESC）作為中藥秦皮的主要活性成分之一^[14]，也存在于多種藥用植物中，如：歐洲七葉樹(shù)、白蠟、水曲柳等。藥理研究表明，七葉苷具有抗炎^[15-16]、抗氧化應(yīng)激^[17]、抗菌^[18-19]、抗癌^[20]、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、抗血栓等作用，有望用于多種疾病的治療。藥代動(dòng)力學(xué)研究表明七葉苷可以在體內(nèi)快速且均勻的分布，但卻具有嚴(yán)重的首過(guò)效應(yīng)和易析出的缺點(diǎn)，影響了其口服制劑在臨床上的應(yīng)用^[21]。因此本試驗(yàn)以羧甲基纖維素鈉和羧甲基殼聚糖為基材，載入七葉苷，通過(guò)生物交聯(lián)劑京尼平交聯(lián)，制備CCE水凝膠，并對(duì)其相關(guān)表征、抗菌活性及生物相容性進(jìn)行研究，為七葉苷在臨床上的局部應(yīng)用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器

電子天平（XS105）購(gòu)自METTLER TOLEDOG公司；集熱式恒溫磁力攪拌器（HWCL-3）購(gòu)自鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；掃描電子顯微鏡（JSM-6390LV）購(gòu)自NTC公司；納米粒度及Zeta電位分析儀（ZS90）購(gòu)自上海思百吉儀器系統(tǒng)有限公司；X射線衍射儀（XRD）購(gòu)自德國(guó)布魯克公司；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-1900i）購(gòu)自島津儀器（蘇州）有限公司；實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀（Micro Screen-HT）購(gòu)自杰靈儀器制造有限公司。

1.1.2 主要試劑

七葉苷（CAS：66778-17-4），質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%，購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CAS：9004-32-4），購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羧甲基殼聚糖（CAS：83512-85-0），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；二甲基亞砜（DMSO），購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)菌種

金黃色葡萄球菌ATCC29213、大腸埃希菌ATCC25922。均由新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 CMC-Na/CMCS水凝膠的制備及配方優(yōu)化

稱取一定量的CMC-Na、CMCS放于燒杯中，加入去離子水使用磁力攪拌器攪拌均勻，配制得到CMC-Na、CMCS溶液。配制0.1g·mL^-1七葉苷儲(chǔ)備液，在保持混合物總量不變及七葉苷的終濃度為2.5mg·mL^-1的基礎(chǔ)上，以置于50℃水浴中加入交聯(lián)劑GNP充分交聯(lián)，靜止到無(wú)氣泡。

以CMC-Na（2%、3%、4%）、CMCS（2%、3%、4%）和GNP（200、300、400μL）及轉(zhuǎn)速（800、1000、1200r·min^-1）為變量設(shè)計(jì)L₉（3⁴）正交試驗(yàn)。以包封率（EE）和載藥量（LC）為指標(biāo)，篩選其最優(yōu)配比。

EE=（載藥凝膠中七葉苷含量/七葉苷總量）×100%

LC=（載藥凝膠中七葉苷含量/水凝膠總量）×100%

1.3 水凝膠表征測(cè)定

1.3.1 外觀性狀

以《中國(guó)獸藥典（2020版）》中對(duì)液體制劑的要求，對(duì)其外觀性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

稱取一定量的七葉苷對(duì)照品溶于DMSO，用去離子水稀釋配置成質(zhì)量濃度為0.313、0.625、1.25、2.5、5μg·mL^-1的溶液，標(biāo)明序號(hào)，上述溶液均通過(guò)0.22μm微孔濾器，取3mL溶液，放于石英比色皿中，采用紫外分光光度計(jì)在338nm處測(cè)量其吸光度，計(jì)算其線性回歸方程。

1.3.3 微觀結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）觀察水凝膠多孔的內(nèi)部形貌。將制備的水凝膠冷凍干燥，切片制樣，用導(dǎo)電膠將其固定在銅片上，真空條件下在其表面均勻噴金，然后在加速電壓為20kV的條件下用SEM觀察并拍照記錄。

1.3.4 粒徑和Zeta電位分析

使用納米粒度及Zeta電位分析儀對(duì)CCE水凝膠進(jìn)行粒徑和Zeta電位分析。

1.3.5 傅里葉紅外光譜（FTIR）和X射線衍射（XRD）測(cè)定

FTIR測(cè)定，室溫下使用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)冷凍干燥并研碎的水凝膠樣品進(jìn)行測(cè)試。用KBr壓片法，在400～4000cm^-1的掃描范圍對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)量。X射線衍射儀對(duì)水凝膠樣品進(jìn)行結(jié)晶特征分析。采用超能陣列探頭，掃描范圍為5°～90°。

1.4 水凝膠溶脹度和體外釋放率檢測(cè)

通過(guò)測(cè)定溶脹度來(lái)評(píng)價(jià)水凝膠的溶脹性能。將冷凍干燥后的水凝膠修改成重量一致的小塊，其質(zhì)量為w_d，之后將水凝膠浸泡在PBS緩沖溶液（pH=7.4）中充分溶脹。每隔2h取出，稱量水凝膠的質(zhì)量Wt。按照如下公式計(jì)算水凝膠的溶脹度：

溶脹度=W_t-W_dW_d×100%。

體外釋放率檢測(cè)，取400mL的PBS緩沖溶液（pH=7.4）放入37 ℃搖床中預(yù)熱備用。吸取CCE水凝膠與同濃度的七葉苷原料藥各2mL，裝入處理好的透析袋中，將透析袋分別放入裝有180mL PBS的燒杯中，以恒定的速率進(jìn)行體外釋放。每隔2h吸取2mL液體檢測(cè)藥物釋放量，并加入等體積PBS補(bǔ)償釋放介質(zhì)，用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行吸光度檢測(cè)，計(jì)算藥物累積釋放率并以其為縱坐標(biāo)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制體外釋放曲線。

1.5 抑菌性測(cè)定

1.5.1 最小抑菌濃度測(cè)定

采用二倍稀釋法來(lái)測(cè)定七葉苷原料藥和載藥凝膠的最小抑菌濃度（MIC），用MH肉湯對(duì)藥物進(jìn)行稀釋，將10⁶CFU·mL^-1的菌液加入其中，使藥物的最終濃度為10000、5000、2500、1250、625和312.5μg·mL^-1，將上述含藥菌液放到高壓滅菌后的2mL離心管中，并設(shè)置陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，放入37℃搖床中200r·min^-1培養(yǎng)8h，比較其內(nèi)的液體混濁程度，其中液體清亮的離心管對(duì)應(yīng)的濃度為七葉苷原料藥和載藥凝膠的最小抑菌濃度。

1.5.2 體外抑菌曲線繪制

將10⁶CFU·mL^-1的菌液分別與七葉苷原料藥和載藥凝膠混合至其濃度為MIC的含藥菌液，并同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，用高通量實(shí)時(shí)微生物生長(zhǎng)儀檢測(cè)細(xì)菌數(shù)量，以細(xì)菌數(shù)量為縱坐標(biāo)，時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，繪制MIC藥物濃度對(duì)測(cè)試菌液的抑菌曲線。

1.6 體外溶血試驗(yàn)

使用新鮮綿羊血液來(lái)測(cè)定樣品的溶血情況。取健康新鮮羊血5mL，室溫下以1200r·min^-1的轉(zhuǎn)速離心5min收集血液中的紅細(xì)胞，用PBS配成2.0%的紅細(xì)胞懸液，將其分裝至EP管中，每管1mL紅細(xì)胞懸液，離心后去除上清液，用PBS將CCE水凝膠配制成2.5、0.25、0.025mg·mL^-1，向試驗(yàn)組的EP管中分別加入1mL稀釋后的CCE水凝膠溶液，陽(yáng)性對(duì)照組加入1mL去離子水，陰性對(duì)照組加入1mL的PBS溶液，混勻后于37℃培養(yǎng)箱孵育6 h，離心后觀察溶液顏色，并吸取100μL上清液用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下的吸光度，將陽(yáng)性對(duì)照組溶血率視為100%，陰性對(duì)照組溶血率視為0%。依據(jù)以下公式計(jì)算樣品的溶血率：

溶血率（%）=（OD給藥組-OD陰性組）/（OD陽(yáng)性組-OD陰性組）×100%

2 結(jié) 果

2.1 水凝膠的形成結(jié)果

選擇對(duì)水凝膠影響較大的4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)（表1），確定最優(yōu)配比為2%CMC-Na、2%CMCS、200μL GNP。

按照“1.2”項(xiàng)的試驗(yàn)方法，得到藍(lán)色澄清，透明度均勻，無(wú)藥物析出，無(wú)雜質(zhì)且可以通過(guò)1mL注射器直徑為0.33mm的3號(hào)針頭的水凝膠，具有良好的可注射性，可用于局部腔內(nèi)給藥（圖1）。

2.2 水凝膠表征

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

在波長(zhǎng)為338nm處，以吸光度作為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性回歸方程為y=0.0293257x+0.00247807（R²=0.09999），結(jié)果表明七葉苷在0.313～5μg·mL^-1的濃度范圍內(nèi)與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.2.2 微觀結(jié)構(gòu)分析

CCE水凝膠微觀結(jié)構(gòu)如圖2，可以清楚的看到水凝膠具有三維結(jié)構(gòu)且具有許多小孔，孔壁光滑沒(méi)有分離現(xiàn)象。

2.2.3 粒徑和Zeta電位分析

依據(jù)“2.2.3”最終配制出的CCE水凝膠粒徑平均為0.841 5nm（圖4A），更小的粒徑可以使CCE水凝膠通過(guò)多種生理屏障和細(xì)菌屏障，更好地發(fā)揮作用；電位為-32.1mV（圖4B）說(shuō)明該水凝膠體系較為穩(wěn)定。

2.2.4 傅里葉紅外光譜（FTIR）和X射線衍射測(cè)定

CCE水凝膠紅外光譜（圖4A），由圖可知，1632cm^-1處的寬峰和1 420cm^-1處的窄峰，是CMCS和CMC-Na上的-COO官能團(tuán)，在1059cm^-1處出現(xiàn)的是-C-O官能團(tuán)，2923cm^-1左右為-NH的伸縮振動(dòng)。載藥凝膠和空載凝膠之間峰值并未出現(xiàn)明顯變化，表明七葉苷載入CMC-Na/CMCS體系中并未破壞其表面有機(jī)官能團(tuán)。X射線衍射技術(shù)（X-ray diffraction，XRD）是研究物質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和物相的方法，具有不損傷樣品、快捷、測(cè)量精度高等優(yōu)點(diǎn)。X射線衍射圖譜（圖4B）可以直觀地看到載藥凝膠中沒(méi)有出現(xiàn)七葉苷相關(guān)的衍射峰，這表明七葉苷成功載入到CMC-Na/CMCS水凝膠中。

2.3 CCE水凝膠溶脹度和體外釋放率檢測(cè)

圖5A為CCE水凝膠在pH=7.4的PBS中的溶脹度，2h的溶脹度為208%，14h達(dá)到最大溶脹度為234%，期間水凝膠的溶脹度逐步增大，證明其交聯(lián)結(jié)構(gòu)較為穩(wěn)定，不會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被破壞，有利于保持傷口附近濕潤(rùn)環(huán)境。圖5B為七葉苷原料藥和載藥凝膠在pH=7.4環(huán)境中的體外藥物釋放曲線，18h后七葉苷原料藥釋放率逐步走低，載藥凝膠仍持續(xù)上升，48h內(nèi)載藥凝膠均保持上升狀態(tài)，說(shuō)明在模擬體外釋放過(guò)程中載藥凝膠相較于七葉苷原料藥具有明顯的緩釋效果。

2.5 抑菌性測(cè)定

2.5.1 最小抑菌濃度測(cè)定

通過(guò)二倍稀釋法測(cè)定七葉苷原料藥和載藥凝膠對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值為2500μg·mL^-1，對(duì)大腸埃希菌的MIC值為2 500μg·mL^-1。

2.5.2 體外抑菌曲線繪制

圖6，A為金黃色葡萄球菌的體外抑菌曲線，B為大腸埃希菌的體外抑菌曲線，在同濃度藥物條件下載藥凝膠的抑菌時(shí)間較七葉苷原料藥有所延長(zhǎng)，且對(duì)大腸埃希菌的抑菌效果好于金黃色葡萄球菌，這對(duì)一些前期由大腸埃希菌引起感染的疾病可能具有更好的效果，如母畜子宮內(nèi)膜炎，以腸外致病性大腸埃希菌為代表的革蘭陰性菌最先侵入牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞并造成炎性損傷，繼而誘發(fā)其他病原菌感染^[22]。

2.6 體外溶血試驗(yàn)

溶血試驗(yàn)如圖7，CCE水凝膠在2.5和0.25mg·mL^-1時(shí)的溶血率分別為1.9%、2.1%，均無(wú)明顯溶血現(xiàn)象，符合醫(yī)用材料的溶血實(shí)驗(yàn)要求。CCE水凝膠在0.025mg·mL^-1時(shí)的溶血率為10.8%。總體來(lái)看CCE水凝膠對(duì)紅細(xì)胞的破壞較小，血液相容性較好。

3 討 論

近年來(lái)在減抗、限抗的行業(yè)背景下，需要尋求一種安全可靠的藥物來(lái)替代抗生素用于疾病的治療，因此越來(lái)越多的中藥被國(guó)內(nèi)外學(xué)者重視，七葉苷作為中藥秦皮的提取物，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用。七葉苷能溶于熱水、熱乙醇、乙酸、甲醇，微溶于冷水及乙醇，極微溶于乙醚。當(dāng)熱水、熱乙醇溫度降低便會(huì)析出，不利于給藥及溶液保存，而且七葉苷的首過(guò)效應(yīng)嚴(yán)重，這兩個(gè)缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了其在臨床上的應(yīng)用。而水凝膠在藥物遞送方面取得了廣泛的研究成果，因此本研究利用水凝膠在藥物遞送方面的優(yōu)點(diǎn)，克服七葉苷的缺點(diǎn)。

本研究使用CMC-Na和CMCS兩種易獲得、可再生、安全無(wú)毒、生物相容性高的水凝膠基材，制備了一種具有穩(wěn)定三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、較小粒徑、較強(qiáng)溶脹能力和緩釋效果的水凝膠。并通過(guò)載藥量和包封率確定了最優(yōu)配比。載藥凝膠和原料藥的體外抑菌試驗(yàn)說(shuō)明了，該水凝膠能夠有效地保留七葉苷的抑菌活性，同時(shí)CMCS在一定程度上增強(qiáng)了七葉苷的抗菌效果^[23]，同濃度藥物情況下可以明顯增強(qiáng)抑菌效果，這與CMCS具有抑菌性能有一定關(guān)系。后續(xù)的體外溶血試驗(yàn)結(jié)果表明CCE水凝膠對(duì)紅細(xì)胞的破壞作用非常小，具有良好的生物相容性，為其在臨床上使用提供了安全性支撐。因此CCE水凝膠具有開(kāi)發(fā)成局部遞送體系的潛力，有望用于多種疾病的治療。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)成功制備了一種負(fù)載七葉苷的CMC-Na/CMCS水凝膠，通過(guò)系列試驗(yàn)證明其相較七葉苷原料藥具有一定的緩釋作用，可以延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，減少給藥次數(shù)，為臨床使用七葉苷治療疾病提供了一種新的給藥方式。

參考文獻(xiàn)（References）：

[1]LIAO J，DAI HJ，HUANG HH.Construction of hydrogels based on the homogeneous carboxymethylated chitin from Hericium erinaceus residue：role of carboxymethylation degree[J].Carbohydr Polym，2021，262：117953.

[2]JIANG HY，ZHANG GZ，LI FB，et al.A self-healable and tough nanocomposite hydrogel crosslinked by novel ultrasmall aluminum hydroxide nanoparticles[J].Nanoscale，2017，9（40）：15470-15476.

[3]MCCLEMENTS DJ.Advances in nanoparticle and microparticle delivery systems for increasing the dispersibility，stability，and bioactivity of phytochemicals[J].Biotechnol Adv，2020，38：107287.

[4]TSIRIGOTIS-MANIECKA M，SZYK-WARSZYN＇SKA L，LAMCH?，et al.Benefits of pH-responsive polyelectrolyte coatings for carboxymethyl cellulose-based microparticles in the controlled release of esculin[J].Mater Sci Eng：C，2021，118：111397.

[5]ZHU HJ，ZHENG J，OH XY，et al.Nanoarchitecture-integrated hydrogel systems toward therapeutic applications[J].ACS Nano，2023，17（9）：7953-7978.

[6]LV JR，LV XH，MA M，et al.Chitin and chitin-based biomaterials：a review of advances in processing and food applications[J].Carbohydr Polym，2023，299：120142.

[7]張少飛，胡文斌，王都留，等.環(huán)糊精-殼聚糖/羧甲基纖維素水凝膠的制備及其緩釋性能研究[J].高分子通報(bào)，2021（4）：43-49.

ZHANG SF，HU WB，WANG DL，et al.Preparation of cyclodextrin-chitosan/carboxymethyl cellulose hydrogel and study on its slow release property[J].Polymer Bulletin，2021（4）：43-49.（in Chinese）

[8]KONO H，ONISHI K，NAKAMURA T.Characterization and bisphenol Aadsorption capacity of β-cyclodextrin-carboxymethylcellulose-based hydrogels[J].Carbohydr Polym，2013，98（1）：784-792.

[9]龔彥溶，王智博，石 磊，等.黃連素-白及多糖-羧甲基殼聚糖復(fù)合敷料的設(shè)計(jì)和藥效評(píng)價(jià)[J].海軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2023，44（6）：718-725.

GONG YR，WANG ZB，SHI L，et al.Design and pharmacodynamic evaluation of berberine-Bletilla striata polysaccharide-carboxymethyl chitosan composite dressing[J].Academic Journal of Naval Medical University，2023，44（6）：718-725.（in Chinese）

[10]李 明，劉 楊，龔 浩，等.羧甲基殼聚糖復(fù)合水凝膠的制備及其性能研究[J].中國(guó)海洋藥物，2022，41（2）：19-27.

LI M，LIU Y，GONG H，et al.Preparation and performance study of carboxymethyl chitosan composite hydrogels[J].Chinese Journal of Marine Drugs，2022，41（2）：19-27.（in Chinese）

[11]WANG LY，ZHONG YY，QIAN CT，et al.A natural polymer-based porous sponge with capillary-mimicking microchannels for rapid hemostasis[J].Acta Biomaterialia，2020，114：193-205.

[12]MANICKAM B，SREEDHARAN R，ELUMALAI M.‘Genipin’-the natural water soluble cross-linking agent and its importance in the modified drug delivery systems：an overview[J].Curr Drug Deliv，2014，11（1）：139-145.

[13]HU M，YANG JL，XU JH.Structural and biological investigation of chitosan/hyaluronic acid with silanized-hydroxypropyl methylcellulose as an injectable reinforced interpenetrating network hydrogel for cartilage tissue engineering[J].Drug Deliv，2021，28（1）：607-619.

[14]LI CX，LI JC，LAI J，et al.The pharmacological and pharmacokinetic properties of esculin：a comprehensive review[J].Phytother Res，2022，36（6）：2434-2448.

[15]XU XN，JIANG Y，YAN LY，et al.Aesculin suppresses the NLRP3inflammasome-mediated pyroptosis via the Akt/GSK3β/NF-κB pathway to mitigate myocardial ischemia/reperfusion injury[J].Phytomedicine，2021，92：153687.

[16]CHENG YJ，TIAN XL，ZENG YZ，et al.Esculetin protects against early sepsis via attenuating inflammation by inhibiting NF-κB and STAT1/STAT3signaling[J].Chin JNat Med，2021，19（6）：432-441.

[17]ZHANG MM，XIN X，LAI FR，et al.Cellular transport of esculin and its acylated derivatives in caco-2cell monolayers and their antioxidant properties in vitro[J].J Agric Food Chem，2017，65（34）：7424-7432.

[18]SAMPATH KUMAR NS，SARBON NM，RANA SS，et al.Extraction of bioactive compounds from Psidium guajava leaves and its utilization in preparation of jellies[J].AMB Express，2021，11（1）：36.

[19]SOLíS-SALAS LM，SIERRA-RIVERA CA，COBOS-PUC LE，et al.Antibacterial potential by rupture membrane and antioxidant capacity of purified phenolic fractions of Persea americana leaf extract[J].Antibiotics（Basel），2021，10（5）：508.

[20]SUMOREK-WIADRO J，ZAJ C A，B DZIUL D，et al.Coumarins modulate the anti-glioma properties of temozolomide[J].Eur JPharmacol，2020，881：173207.

[21]REHMAN SU，KIM IS，KANG KS，et al.HPLC determination of esculin and esculetin in rat plasma for pharmacokinetic studies[J].J Chromatogr Sci，2015，53（8）：1322-1327.

[22]KHAN KN，F(xiàn)UJISHITA A，HIRAKI K，et al.Bacterial contamination hypothesis：a new concept in endometriosis[J].Reprod Med Biol，2018，17（2）：125-133.

[23]SHARIATINIA Z.Carboxymethyl chitosan：properties and biomedical applications[J].Int JBiol Macromol，2018，120：1406-1419.

（編輯 白永平）