胰淀素作用于背外側被蓋核膽堿乙酰轉移酶神經元調節小鼠體重

摘 要：胰淀素（amylin）作用于背外側被蓋核（lateral dorsal tegmental nucleus，LDT），誘導減肥和抑食效應，并激活背肩胛棕色脂肪組織（interscapular brown adipose tissue，IBAT）產熱。多種食欲激素受體與膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）神經元共同定位于LDT中，以調節飽腹感和能量消耗。然而，LDT的ChAT神經元是否參與胰淀素介導的體重調節作用尚待探索。作者擬通過免疫熒光檢測小鼠LDT中原癌基因蛋白（c-Fos）和ChAT神經元的表達，逆行示蹤技術確認LDT的下游神經核團，神經元損傷試驗分析胰淀素作用的神經機制。結果顯示：腹腔注射胰淀素顯著降低小鼠體重，并顯著促進LDT和臂旁核（PBN）中c-Fos和ChAT神經元表達。ChAT和神經型一氧化氮合成酶（nNOS）神經元在LDT、PBN和迷走神經背側核（DMV）中共表達。逆行示蹤試驗證明LDT向PBN神經元發送神經投射。此外，損傷LDT和PBN神經元可降低胰淀素的減肥效果。LDT是連接PBN的能量平衡調節中樞，ChAT神經元參與介導胰淀素的體重調節過程。

關鍵詞：肥胖；膽堿乙酰轉移酶；胰淀素；下丘腦；背外側被蓋核

中圖分類號：S852.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）07-3185-08

收稿日期：2022-11-08

基金項目：國家自然科學基金（32060204）；內蒙古科技攻關計劃（2021GG0199）；內蒙古自然科學基金（2020MS03035）；內蒙古自治區教育廳高等學校科學研究項目（NJZY22535）；內蒙古自治區直屬高校基本科研業務費項目（BR220150）；內蒙古自治區高等學校科學研究重點項目（NJZZ22529）；內蒙古自治區教育廳高等學校科學研究項目（NJZY23120）

作者簡介：曹曉娟（1979-），女，山西太谷人，碩士，主要從事動物營養與飼料研究，E-mail：zykyk@163.com

*通信作者：杜晨光（1976-），主要從事臨床獸醫學研究，E-mail：duc@imau.edu.cn

Amylin Acts on Choline Acetyltransferase Neurons in the Lateral Dorsal Tegmental Nucleus

（LDT）to Regulate Body Weight of Mice

CAOXiaojuan¹，LIUHaodong^2，3，LIPenghui^2，3，LIJiacheng^2，3，FANQi^2，3，WANGXing^2，3，

LICaiqin^2，3，YANG Zicheng^2，3，GUOYongqing¹，CHENYujie¹，ZHANG Xiaoyu¹，

HAIRihan¹，DUChenguang^1，2，3*

（1.Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University，

Baotou014109，China; 2.Key Laboratory of Basic Veterinary Medicine of

Inner Mongolia Autonomous Region，Hohhot010018，China; 3.College of

Veterinary Medicine，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot010018，China）

Abstract：Amylin acts on the lateral dorsal tegmental nucleus（LDT），induces weight loss and diet-suppressive effects，and activates dorsal scapular brown adipose tissue（IBAT）to produce heat.Multiple appetite hormone receptors colocalized with choline acetyltransferase（ChAT）neurons in LDT to modulate saturation and energy expenditure.However，it remains to be determined whether ChAT neurons in LDT are involved in amylin-mediated weight regulation.Immunofluorescence was conducted to detect the expression of c-Fos and ChAT neurons in mouse LDT，retrograde tracer analysis was selected to confirme the downstream nucleus mass of LDT，and neuronal damage assays was conducted to analyze the neuromechanism of amylin action.Results showed that intraperitoneal administration of amylin significantly reduced the body weight of mice and significantly increased the expression of c-Fos and ChAT neurons in both the LDT and parabrachial nucleus（PBN）.ChAT and neuronal nitric oxide synthase（nNOS）neurons were co-expressed in the dorsal motor nucleus of the vagus（DMV）.Retrograde tracer experiments demonstrated that LDTs send nerve projections to PBN neurons.Furthermore，injury of LDT and PBN neurons reduced the weight loss of amylin.LDT is the center of energy balance regulation connected to PBN，and the ChAT neurons of this circuit are involved in the process of weight regulation of amylin.

Key words：obesity; choline acetyltransferase; amylin; hypothalamus; lateral dorsal tegmental nucleus

*Corresponding author：英文通信作者DU Chenguang，E-mail：duc@imau.edu.cn

胰淀素（amylin）是由37個氨基酸組成的肽類激素^[1]，通過抑食、延緩胃排空速率和減少胰高血糖素分泌的方式來調節機體能量代謝。其受體廣泛分布在中樞神經系統的延髓最后區（area postrema，AP）^[2]、孤束核（nucleus of the solitary tract，NTS）^[3]和背外側被蓋核（lateral dorsal tegmental nucleus，LDT）^[4]。研究表明，AP是胰淀素產生飽腹感的主要核團^[5]，然而，考慮到中樞神經系統對于能量平衡的控制可能并不局限于單個核團，因為在AP損傷的大鼠中，仍然可以觀察到胰淀素或胰淀素激動劑介導的行為和生理效應^[6]。因此，胰淀素可能作用于AP以外的神經核團來控制體重。實驗室前期工作證明，完整的交感神經系統（sympathetic nervous system，SNS）支配對于LDT介導的厭食至關重要^[7]，提示LDT也是胰淀素信號傳導的直接目標。LDT位于中腦尾側，整合能量平衡穩態信號。LDT向多個神經核團發送神經元投射，包括但不限于NTS、腹側被蓋核、下丘腦外側核和臂旁核（parabrachial nucleus，PBN）^[8-9]。神經型一氧化氮合成酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）整合來自LDT和鄰近神經核團的代謝信號，并分泌一氧化氮來調節其他神經遞質^[10]。膽堿乙酰轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）是膽堿能神經細胞的明確標志，在中樞神經系統的神經傳遞中發揮重要作用^[11-12]。在LDT中發現生長激素釋放肽（ghrelin）受體與ChAT神經元共定位，共同調節神經退行性疾病和胃腸功能障礙^[13]。這些結果表明，LDT對能量攝入和消耗均有調節作用。因此，本研究假設與能量平衡相關的神經內分泌信號直接作用于LDT，以發送與攝食相關的神經信號進而調節體重。

本研究通過比較原癌基因蛋白（c-Fos）表達、逆行示蹤和神經元損傷試驗來研究胰淀素減肥的神經機制。本研究結果證明，LDT是連接PBN的主要體重調節中樞，介導胰淀素的體重調節作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

C57BL/6J雄性小鼠（8～9周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。小鼠飼養在12 h的光/暗周期（06：00-18：00）環境中，隨意獲取食物和水。共26只小鼠用于試驗，10只小鼠分成生理鹽水（saline）組與胰淀素組，每組5只。注射胰淀素前，對兩組小鼠進行試驗前預處理，每天腹腔注射（i.p.）生理鹽水（10μL·g^-1），連續1周，以減少非特異性應激。正式試驗當天，于上午09：00小鼠腹腔注射胰淀素（Phoenix，50ng·g^-1），對照組注射生理鹽水（10μL·g^-1），連續6周注射胰淀素或生理鹽水。按每次當周與前一周的增重差值進行統計，觀測小鼠體重變化。試驗結束后，取材檢測腦內神經元信號表達。3只小鼠進行免疫熒光分析，檢測腦內ChAT和nNOS神經元共表達。此外，3只小鼠用于逆行示蹤試驗。其余10只小鼠用于神經元損傷試驗，分為生理鹽水組與胰淀素組，每組5只，統計藥物注射后9周內的體重數據。按照《內蒙古大學實驗動物使用和護理指南》的道德標準進行實驗動物的護理和使用（批準號SYCK2014-002）。

1.2 免疫熒光

腹腔注射胰淀素或等量生理鹽水后，蠕動泵心肺灌注取材。灌注生理鹽水30 mL后，轉為4%多聚甲醛（pH=7.4，Sigma-Aldrich）繼續灌注30 mL。全腦在4%PFA中固定過夜，然后轉移到20%～30%蔗糖溶液中梯度脫水直至沉底。冰凍切片機將目標區域切為若干張厚度為30μm腦片，0.01mol·L^-1PBS（pH7.4）洗滌。4℃兔抗ChAT（1∶2000，Abcam）、鼠抗c-Fos（1∶1000，Abcam），山羊抗nNOS（1∶1000，Abcam）和兔抗NeuN（1∶2000，Abcam）一抗孵育24h。0.01mol·L^-1PBS洗滌腦片3次。二抗Alexa Fluor647驢抗兔IgG（1∶1000，Abcam）、Alexa Fluor488驢抗鼠IgG（1∶1000，Abcam）和Alexa Fluor561驢抗山羊IgG（1∶1000，Abcam）于25℃孵育2h。洗滌后自然風干。腦片在恒溫搖床（4℃300r·min^-1）上孵育抗體，以加強抗體效果。含0.4%TritonX-100（Sigma-Aldrich）的抗體稀釋液作為陰性對照。用激光共聚焦顯微鏡（Nikon，C2Plus）對腦片進行成像。

1.3 腦立體定位注射

腦立體定位注射5%異氟醚麻醉小鼠，在整個手術過程中維持在1.0%～2.5%。將麻醉后剃毛的小鼠固定于全自動腦立體定位儀（Neurostar，StereoDrive-DM）。對于逆行示蹤試驗，在相應位置打孔后，通過微量注射器單側注射0.5 μL AAV2/retro-hSyn-mCherry（PT-0866，武漢樞密腦科學技術有限公司）至PBN（from Lambda：AP：-4.90mm，ML：-1.1 mm，DV：-3.25mm）^[14]，注射結束5min后拔出注射針，病毒表達3周后檢測熒光信號分布。在神經元損傷試驗中，將神經毒性藥物鵝膏酸（ibotenic acid，IBO）單側注射至LDT（from Lambda：AP：-5mm，ML：-0.5 mm，DV：-3.4mm）^[4]和PBN（與上述坐標相同），注射速度0.02 μL·min^-1，注射10min，合計0.2 μL，停針5min后緩慢撤出，生理鹽水組（Sham組）僅注射生理鹽水。無菌條件縫合，青霉素抗菌處理，一周后灌注、取材，孵育抗體檢測NeuN表達。

1.4 數據統計

利用統計學軟件GraphPad Prism7，運用雙因素方差分析Tukey’s多重比較，進行顯著性統計。數據以“平均值±標準誤（±s）”表示。P＜0.05為差異顯著。

2 結 果2.1 胰淀素激活LDT^ChAT、PBN^ChAT神經元并降低小鼠體重

為了驗證胰淀素是否可以降低小鼠體重，采用腹腔注射的方法，觀察了外周胰淀素對小鼠體重的影響。與先前關于胰淀素作用的報道一致^[15]，長期注射胰淀素顯著減輕小鼠體重組（P＜0.05）（圖1A）。實驗室前期研究證明，LDT表達ChAT神經元（以下簡稱LDT^ChAT神經元）^[7]。為了驗證LDT^ChAT神經元是否參與了胰淀素介導的負能量平衡過程，采用免疫熒光比較了胰淀素和生理鹽水組小鼠腦內c-Fos神經元的表達水平，c-Fos是神經元激活的標志^[16]。結果發現，與生理鹽水組相比，胰淀素顯著增加LDT和PBN中c-Fos免疫反應陽性神經元表達（P＜0.05；P＜0.01）（圖1B～D）。同時，胰淀素顯著增加LDT和PBN的ChAT免疫反應陽性神經元表達數目（P＜0.001；P＜0.05）（圖1B～D）。基于外周胰淀素可以引起小鼠腦中c-Fos和ChAT免疫反應陽性神經元表達差異，作者推測LDT^ChAT和PBN^ChAT神經元可能參與了胰淀素引起的體重下降。

2.2 小鼠腦內ChAT和nNOS神經元分布

高脂飲食顯著減少小鼠腦內nNOS神經元表達^[17]，提示nNOS可能參與能量代謝調節過程。為了確定膽堿能神經元是否也表達nNOS神經元，通過免疫熒光檢測了兩種神經元的分布。結果顯示，除了在LDT和PBN中發現ChAT與nNOS的免疫反應陽性神經元共定位信號外（圖2A、B），在迷走神經背側核（dorsal motor nucleus of the vagus，DMV）中也檢測到兩種神經元共表達（圖2C）。

2.3 PBN神經元接受來自LDT的突觸輸入

為了確定LDT與PBN之間是否存在投射關系，將表達紅色熒光蛋白（mCherry）的逆行示蹤病毒AAV2/retro-hSyn-mCherry注射到小鼠的單側PBN中（圖3A），病毒表達3周后，在LDT中觀察到大量mCherry標記的免疫反應陽性神經元（圖3B），該結果證明LDT神經元向PBN發送直接的神經元投射。

2.4 損毀LDT^ChAT-PBN^ChAT環路增加小鼠體重

為了驗證LDT^ChAT-PBN^ChAT環路是否是胰淀素調節小鼠體重所必需的，通過神經毒素IBO單側失活了LDT和PBN中的神經元，并孵育成熟神經元標志物NeuN確認神經元損傷情況^[18]。免疫熒光結果顯示，在右側（注射IBO）的LDT和PBN區域內只能檢測到很少的NeuN免疫反應陽性神經元表達（圖4A、B），表明LDT和PBN區域的大部分神經元被IBO破壞。在神經元損傷后的前4周，兩組小鼠體重差異不顯著（P＞0.05）（圖4C），從第5周開始，IBO組小鼠體重顯著高于Saline組（P＜0.05）（圖4C、D）。這些結果表明，LDT^ChAT-PBN^ChAT環路在胰淀素誘導的體重調節方面發揮了關鍵作用。

3 討 論

胰淀素激活能量調控中樞，調節哺乳動物采食和體重^[19]。然而，胰淀素調節體重的神經機制還不清楚。本研究發現，外周胰淀素顯著促進LDT和PBN區域的ChAT免疫反應陽性神經元表達，表明LDT和PBN神經元參與胰淀素誘導的體重調節過程。而實驗室前期研究證明，胰淀素對于ChAT神經元和背肩胛棕色脂肪組織（interscapular brown adipose tissue，IBAT）中解偶聯蛋白1的激活作用依賴于完整的SNS支配^[7]，該結果提供了胰淀素介導的中樞神經系統和周圍器官之間相互作用的解剖學證據。基于以上結果，作者提出了胰淀素調節體重的神經通路模型（圖5），即ChAT神經元被胰淀素信號激活，LDT^ChAT神經元將胰淀素信號傳遞給PBN^ChAT神經元，然后再將信號直接或間接傳遞到DMV^ChAT神經元，激活SNS和IBAT后調節攝食和體重。DMV是副交感神經系統的一個節點，功能包括傳入和傳出信號^[13]。DMV的神經信號通過神經投射來激活ARC的刺鼠相關蛋白和前阿片黑素皮質素神經元，在信號傳遞過程中，DMV的膽堿能神經元參與整合內分泌和飽腹感，特異失活DMV^ChAT神經元中的MC4R導致小鼠代謝率降低和體重增加^[20]，強調了膽堿能神經元中的MC4R信號對于維持正常能量代謝和體重的重要性。

電損毀AP后，胰淀素抑制大鼠進食和體重的作用減弱^[21]。這與本研究中的化學損傷結果一致，即阻斷LDT和PBN的神經傳遞后，胰淀素的體重調節能力被弱化（圖4B），證明LDT及下游核團PBN中的神經元是胰淀素減輕體重所必需的。值得注意的是，在5周以后，IBO組小鼠才表現出體重顯著增加，這可能是由于對側神經元或其他能量平衡環路發揮代償效應所致。通過化學遺傳技術抑制PBN-NTS環路可以顯著增加小鼠體重和脂肪含量^[22-23]，這表明可能存在LDT-PBN-NTS環路，多條神經通路協同介導激素誘發的能量平衡調節過程。總而言之，本研究在LDT中發現一類ChAT神經元，通過投射到PBN，在胰淀素誘導的體重控制中起著重要作用。

補充胰淀素與體重調節神經元相關的神經解剖學數據，有助于加深人們對于中樞神經系統調節體重機制的理解，為將來的肥胖癥治療提供基礎支持。

4 結 論

本研究表明，胰淀素可顯著促進LDT和PBN區域ChAT免疫反應陽性神經元表達，ChAT與nNOS免疫反應陽性神經元在小鼠LDT、PBN和DMV神經核團中存在共定位，LDT與PBN之間存在投射關系，此外，LDT和PBN神經元介導胰淀素的體重調節作用。

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（編輯 編輯孟 培）