基于響應面法對皇冠牡丹(Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’)增殖培養基大量元素配方的優化

收稿日期：2023-08-09

基金項目：國家自然科學基金項目（32001359）；南京林業大學大學生創新訓練計劃項目（2022NFUSPITP0436）

作者簡介：李勝皓（1999-），女，重慶人，碩士研究生，研究方向為園林植物與觀賞園藝。（E-mail）lynel1104@163.com

通訊作者：文書生，（E-mail）shusheng0507@126.com

摘要： 增殖系數低一直是制約牡丹微繁殖技術推廣應用的障礙之一，但目前的研究多集中于植物生長調節劑的使用與組合，較少關注培養基配方對牡丹試管苗增殖效果的影響。本研究以皇冠牡丹（Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’）為試驗材料，使用Design-Expert響應面法設計優化試驗，探究WPM中5種大量元素[K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O]對皇冠牡丹試管苗增殖效果的影響，并建立數學模型分析預測最佳優化培養基配方。單因素效應分析結果表明，KH2PO4、NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O對牡丹試管苗的增殖效果有顯著或極顯著影響，而MgSO4·7H2O與K2SO4對牡丹試管苗的增殖效果無明顯影響。交互作用分析結果表明，K2SO4與KH2PO4的交互作用對株高、莖長有顯著或極顯著影響，K2SO4與MgSO4·7H2O、KH2PO4與NH4NO3的交互作用對莖長有顯著或極顯著影響。根據試驗數據構建模型進行分析預測，結果顯示，5種大量元素優化配方為：K2SO4 2 257 mg/L、MgSO4·7H2O 907 mg/L、KH2PO4 481 mg/L、NH4NO3 200 mg/L與Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L。在該條件下開展驗證試驗，獲得試管苗的增殖系數、株高、莖長與葉片數分別為2.43、4.62 cm、1.30 cm、6.75張，略高于Design-Expert試驗得出的預測值，顯著優于對照組，說明本研究成功優化了皇冠牡丹的專用增殖培養基配方。研究結果不僅能大幅提高皇冠牡丹的增殖效率，也為其他牡丹品種增殖培養體系的構建與改良提供重要的技術參考。

關鍵詞： 牡丹；微繁殖；響應面法；增殖；WPM培養基

中圖分類號： S685.11 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2024）08-1493-14

Optimization of macro-elements composition in the multiplication medium of Paeonia×lemoinei ‘Yellow Crown’ based on response surface methodology

LI Shenghao， ZHANG Xiaozhi， PAN Yue， ZHENG Bingyan， WEN Shusheng

（College of Landscape Architecture， Nanjing Forestry University， Nanjing 210000， China）

Abstract： Low multiplication coefficient has been one of the obstacles limiting the industrial application of tree peony （Paeonia sect. Moutan） micropropagation technology， but most of the current studies have been focused on the use and combination of plant growth regulators， and less attention has been paid to the effect of medium formulation on the multiplication of test-tube seedlings of tree peony. In this study， we used Paeonia×lemoinei ‘Yellow CrowECVEQI0XsugZ00QQ/y8GO951BQ0uRBlPk+pQUPBaqNE=n’ as the experimental material and designed an optimization test by using Design-Expert response surface method to investigate the effects of five macro-elements， such as K2SO4， MgSO4·7H2O， KH2PO4， NH4NO3， Ca（NO3）2·4H2O in WPM medium on the multiplication effect of the test-tube seedlings of Paeonia sect. Moutan， and developed a mathematical model to predict the best optimized medium formulation. Results of single factor effect analysis showed that， KH2PO4， NH4NO3 and Ca（NO3）2·4H2O had significant or highly significant effects on the multiplication effect of the test-tube seedlings， while MgSO4·7H2O and K2SO4 had no significant effects. Results of interaction analysis showed that， the interaction between K2SO4 and KH2PO4 had significant or highly significant effects on plant height， and stem length， the interactions between K2SO4 and MgSO4·7H2O， KH2PO4 and NH4NO3 had significant or hightly significant effects on stem length. Based on the experimental data， the model analysis results predicted that the optimized formulations for five macro-elements were K2SO4 2 257 mg/L， MgSO4·7H2O 907 mg/L， KH2PO4 481 mg/L， NH4NO3 200 mg/L and Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L. The validation test was conducted， and the multiplication coefficient， plant height， stem length and leaf number of the test-tube seedlings were 2.43， 4.62 cm， 1.30 cm and 6.75 respectively， which were slightly higher than the predicted values obtained by Design-Expert experiment and were significantly better than the control group， indicating the special multiplication medium for P.×lemoinei ‘Yellow Crown’ was constructed successfully. The results of this study can not only greatly improve the multiplication efficiency of P.×lemoinei ‘Yellow Crown’， but can also provide an important technical reference for the construction and improvement of multiplication culture system of other tree peony species.

Key words： tree peony;micropropagation;response surface method;multiplication;WPM medium

牡丹（Paeonia sect. Moutan）為芍藥科芍藥屬落葉灌木，是原產于中國的傳統名花和藥用植物，近年來被發現作為新型油料植物也有巨大的市場潛力[1]。皇冠牡丹（P.×lemoinei ‘Yellow Crown’）為20世紀70年代由日本育種學家選育的牡丹遠緣雜交品種，花乳黃色，花頭直立，芳香馥郁，生長勢強，品質優良，具有很高的觀賞與經濟價值。但長期以來該品種的傳統繁殖方式（如分株、嫁接等）存在繁殖系數低、周期長、易受環境條件限制等問題，嚴重制約了其規?；a。微繁殖技術即植物的離體無性繁殖技術，在保留母株優良性狀的同時，具有繁殖快速、繁殖系數高等特點，能彌補傳統繁殖方法的不足，因此，構建皇冠牡丹的微繁殖技術體系是推動其規模化生產的必然趨勢。

增殖培養是牡丹微繁殖技術的第2個階段，其中試管苗能否高效地增殖和正常生長是決定微繁殖技術成敗的關鍵。國內自1984年首次開展牡丹微繁殖技術研究以來[2]，迄今已初步建立了菱花湛露（P. suffruticosa‘Ling Hua Zhan Lu’）、洛陽紅（P.×suffruticosa‘Luo Yang Hong’）、正午S9Weqz4lRk5OmoyZwW1O2Q==（P.×lemoinei ‘High Noon’）等40多個牡丹品種的增殖培養體系[3]。但目前關于皇冠牡丹增殖培養體系的研究仍鮮見報道，僅黃素姣[4]就植物生長調節劑對皇冠牡丹增殖生長的影響進行了探究，并獲得了適合皇冠牡丹增殖的植物生長調節劑組合，即6-BA（6-芐氨基嘌呤） 0.20mg/L+GA3（赤霉素） 0.10mg/L+ZT（玉米素） 0.05mg/L，但并未探究培養基中基礎成分對其增殖效果的影響。此外，已有研究發現牡丹增殖培養過程中的培養基成分與試管苗增殖效果關系密切，如Beruto等[5]發現，培養基中的Ca2+濃度會對試管苗產生影響，并且提高WPM（木本植物專用培養基）中的Ca2+濃度，不僅能有效減少頂芽壞死的現象，還能提高增殖系數和莖長[6]；Li等[7]則發現降低培養基中NH+4與NO-3濃度的比值可以促進試管苗的生長，并降低試管苗玻璃化率；在此基礎上，有研究將WPM中Ca（NO3）2濃度分別提高至原始濃度的3.0倍與4.0倍，從而顯著提高了正午牡丹（P.×lemoinei ‘High noon’）和鳳丹牡丹（P. ostii）試管苗的增殖系數，且子代腋芽較為粗壯，而Ca（NO3）2濃度過低會導致試管苗生長不良、易玻璃化，Ca（NO3）2濃度過高則會降低增殖系數，使葉片變小卷曲[8-9]。綜上，前人關于牡丹增殖培養階段的研究多集中在植物生長調節劑的篩選，較少對培養基配方進行研究，且培養基構成組分復雜，各因素間會產生相互作用，使用常規試驗方法將耗費大量時間和精力。

響應面分析法（RSM）通過結合數學方法和統計分析，對響應過程變量進行數學建模和分析，尋求最優工藝參數，是解決多變量問題的一種統計學方法[10]，主要利用二次回歸模型對各因素和響應值之間的關系進行分析和擬合，試驗精度高、次數少、周期短，克服了正交試驗與單因素試驗法的不足，已被廣泛應用于食品學、生態學等領域，并常被用來改良植物組織培養過程中培養基成分與培養條件[11-14]。在牡丹微繁殖技術研究中，響應面法也有應用，黃弄璋[15]使用響應面法中的Plackett-Burman試驗，以WPM中的大量元素、微量元素、肌醇、鈣、有機物質、鐵鹽6大組分進行設計，篩選發現鐵鹽、鈣和肌醇是影響正午牡丹增殖效果的主要影響因子，并選取這3個因素設計Box-Behnken（效應面法）試驗對培養基進行優化，將增殖系數提高了10%左右。這表明響應面法在牡丹微繁殖技術培養基配方改良中具有較大的應用潛力，但目前尚未見使用響應面法對牡丹微繁殖技術培養基中的大量元素濃度進行改良調整的研究。鑒于此，本研究擬以皇冠牡丹試管苗為試驗材料，利用響應面法對WPM中5種大量元素配方進行優化，以期篩選獲得適宜皇冠牡丹的特定增殖培養基，為該品種規模化生產提供技術支持，并為其他牡丹品種微繁殖技術的研發提供參考與借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年2月底于山東省菏澤市古韻牡丹基地進行，選取長勢良好、無病蟲害的皇冠牡丹母株，剪取帶有飽滿鱗芽的枝，剝下腋芽作為外植體，并按照文獻[16]的方法對外植體進行消毒后進行接種，啟動培養基為改良WPM[Ca（NO3）2·4H2O 1 668 mg/L+BA 0.5 mg/L+GA3 0.1 mg/L，附加蔗糖30.0 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH=5.9]，后續如無特殊說明，培養基同上。在第5次繼代培養末期，切取芽叢上莖長約為1～2 cm的健壯單芽，去除全部葉片作為試驗材料。

1.2 試驗方法

以WPM中5種大量元素的無機鹽[K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O]作為設計因素，前4種大量元素的無機鹽（K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3）的濃度范圍設置為WPM原濃度[K2SO4為990 mg/L，MgSO4·7H2O為370 mg/L，KH2PO4為170 mg/L，NH4NO3為400 mg/L，Ca（NO3）2·4H2O為556 mg/L]的0.5～3.0倍，Ca（NO3）2·4H2O的濃度范圍設置為WPM原濃度的0.5～4.0倍，使用Design-Expert Optimal軟件中的響應面法進行最佳優化試驗設計，得到30個處理，并以WPM原濃度作為對照（表1）。上述各處理培養基均附加6-BA 0.5 mg/L、GA3 0.1 mg/L、蔗糖30.0 g/L、瓊脂6.5 g/L，pH 5.9。

1.3 培養條件與數據統計分析

本研究中啟動和增殖培養條件均為培養溫度（24±1） ℃，光照時間14 h/d，熒光燈光照度為32.4 μmol/（m2·s）。

增殖培養50 d后，統計不同處理試管苗的增殖系數（莖長為1～2 cm健壯單芽數/接種外植體個數）、株高、莖長和葉片數，并以上述指標為目標函數建立模型，根據模型計算預測目標值對應各因素的置信區間，獲得優化配方，從而確定優化培養基的組成比例，并進行驗證試驗。

2 結果與分析

將原始數據導入SPSS22.0，可得增殖系數、平均株高、平均莖長與單株葉片數（表2）。由表2可知，增殖系數較高的前3個處理依次為第13組、第28組、第15組；平均株高較高的前3個處理依次為第19組、第28組、第6組；平均莖長較高的前3個處理依次為第28組、第15組、第14組；單株葉片數較高的前3個處理依次為第15組、第19組、第13組。綜合來看，第28組為最優處理，其增殖系數、平均株高、平均莖長與單株葉片數均優于對照，說明培養基大量元素濃度對試管苗增殖效果會產生顯著影響。

將SPSS22.0處理后的數據通過軟件Design-Expert 12.0進行數據擬合和顯著性檢驗，對試驗結果與試驗因子進行三維建模，預測增殖系數和平均莖長處于較高水平時培養基成分的最優配比。其中，5項變量因子為K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3、Ca（NO3）2·4H2O的濃度倍數，分別用x1、x2、x3、x4、x5表示。線性項顯著表示該大量元素濃度對響應值影響顯著，二次項顯著表示2種大量元素濃度交互作用顯著，系數為正、負分別表示濃度增大時影響方向的正、負。

2.1 平均增殖系數模型建立與分析

以增殖系數為Y1，根據Design-Expert 12.0軟件擬合試驗處理，得到增殖系數的二次回歸方程：

Y1=1.414 280+0.001 072x1-0.030 090x2+0.398 823x3-0.016 274x4+0.224 442x5+0.037 415x1x2+0.035 269x1x3+0.036 119x1x4-0.019 207x1x5+0.016 060x2x3-0.049 592x2x4-0.002 236x2x5-0.024 230x3x4+0.022 937x3x5-0.002 875x4x5-0.038 994x21+0.001 120x22-0.113 775x23-0.003 998x24-0.035 254x25。

分析結果（表3）表明，線性項x3、x4對增殖系數具有極顯著影響，線性項x5對增殖系數具有顯著影響，由F（x3）>F（x4）>F（x5）>F（x2）>F（x1）可知，5種大量元素濃度對增殖系數的影響程度為KH2PO4>NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>MgSO4·7H2O>K2SO4。具體影響（圖1）如下： KH2PO4、Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數與增殖系數呈線性正相關（圖1C；圖1E），相關系數分別為0.398 823與0.224 442；NH4NO3濃度倍數與增殖系數呈線性負相關（圖1D），相關系數為-0.016 274；K2SO4、MgSO4·7H2O濃度倍數與增殖系數無顯著相關性（圖1A、圖1B）。

取F值＞1.5的二元二次項分析各因素間的交互作用與對應響應曲面（圖2）。比較F值大小可知，x1x2、x1x3、x1xiQpEOpm0Pdu9NRAwmbSco02ONOfP4j2cipENJgXQAQY=4和x2x4這4項對增殖系數的影響程度為：x2x4＞x1x3＞x1x4＞x1x2（表3），即MgSO4·7H2O與NH4NO3的交互作用＞K2SO4與KH2PO4的交互作用＞K2SO4與NH4NO3的交互作用＞K2SO4與MgSO4·7H2O的交互作用。影響如下：（1）K2SO4與MgSO4·7H2O濃度比保持為1∶1時，試管苗增殖系數未見明顯變化；但低濃度K2SO4與高濃度MgSO4·7H2O相互作用會導致增殖系數下降（圖2A）。（2）K2SO4與KH2PO4濃度同時升高，增殖系數先上升后下降，且增殖系數受KH2PO4濃度影響較大（圖2B）。（3）K2SO4與NH4NO3兩者濃度同時升高，增殖系數逐漸下降且受NH4NO3濃度影響較大；低濃度NH4NO3可以使增殖系數保持較高水平（圖2C）。（4）當MgSO4·7H2O與NH4NO3濃度同時升高時，試管苗增殖系數逐漸降低，而高濃度MgSO4·7H2O與低濃度NH4NO3相互作用時增殖系數可達最高值（圖2D）。

2.2 平均株高模型建立與分析

以平均株高為Y2，根據Design-Expert 12.0軟件擬合試驗處理，得到株高的二次回歸方程：

Y2=2.998 730-0.263 603x1+0.588 062x2+0.264 487x3-0.161 580x4+0.462 537x5-0.007 257x1x2+0.135 470x1x3+0.037 222x1x4-0.031 871x1x5+0.097 298x2x3-0.021 955x2x4-0.046 501x2x5-0.119 603x3x4-0.031 871x3x5-0.042 601x4x5-0.027 184x21-0.178 435x22-0.053 012x23+0.028 309x24+0.000 039x25。

分析結果（表4）表明，線性項x3、x4、x5對株高均有極顯著影響，二次項x1x3對株高有顯著影響。由F（x4）>F（x5）>F（x3）>F（x1）>F（x2）可知，5種大量元素濃度對平均株高的影響程度為NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>KH2PO4>K2SO4>MgSO4·7H2O。具體影響如下：（1）KH2PO4、Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數與株高呈線性正相關（圖3C；圖3E），相關系數分別為0.264 487與0.462 537；NH4NO3濃度倍數與株高呈線性負相關，相關系數為-0.161 580（圖3D）；K2SO4與MgSO4·7H2O濃度倍數與株高無顯著相關性（圖3A、圖3B）。（2）K2SO4與KH2PO4濃度倍數的交互作用與株高呈線性正相關（圖3F），相關系數為0.135 470。

取F值＞1.0的二元二次項分析交互作用與響應曲面。比較F值大小可知，x1x3、x2x3、x2x5和x3x4這4項對株高的影響程度為：x1x3＞x3x4＞x2x3＞x2x5（表4），即K2SO4與KH2PO4的交互作用＞KH2PO4與NH4NO3的交互作用＞MgSO4·7H2O與KH2PO4的交互作用＞MgSO4·7H2O與Ca（NO3）2·4H2O的交互作用。影響如下：（1）當K2SO4與KH2PO4濃度同時升高時，株高無明顯變化，當K2SO4濃度較高且KH2PO4濃度較低時，株高呈下降趨勢（圖4A）。（2）當MgSO4·7H2O濃度倍數為0.5～1.8倍時，株高隨KH2PO4濃度升高而上升；當濃度倍數在1.8～3.0倍時，株高隨KH2PO4濃度升高而下降（圖4B）。（3）MgSO4·7H2O濃度倍數在0.5～2.0倍時，株高隨Ca（NO3）2·4H2O濃度升高而上升；當濃度倍數在2.0～3.0倍時，株高隨Ca（NO3）2·4H2O濃度升高而下降（圖4C）。（4）當KH2PO4濃度升高、NH4NO3濃度下降時，株高呈上升趨勢并在KH2PO4濃度倍數為3.0倍、NH4NO3濃度倍數為0.5倍時達到最高值（圖4D）。

2.3 平均莖長模型建立與分析

以平均莖長為Y3，根據Design-Expert 12.0軟件擬合試驗處理，得到莖長的二次回歸方程：

Y3=1.301 670+0.148 644x1-0.196 973x2+0.071 288x3-0.193 460x4+0.116 001x5+0.060 904x1x2+0.062 311x1x3+0.005 765x1x4+0.009 485x1x5+0.020 522x2x3-0.023 159x2x4+0.021 980x2x5-0.050 456x3x4+0.023 133x3x5+0.002 436x4x5-0.027 867x12+0.008 299x22-0.028 877x32-0.035 352x42-0.042 483x52。

分析結果（表5）表明，線性項x3、二次項x1x2和x1x3對平均莖長具有極顯著影響，線性項x4、二次項x3x4、x25對莖長具有顯著影響。由F（x3）>F（x4）>F（x5）>F（x2）>F（x1）可知，5種大量元素濃度對平均莖長的影響程度為KH2PO4>NH4NO3>Ca（NO3）2·4H2O>MgSO4·7H2O>K2SO4。具體影響如下：（1）KH2PO4濃度倍數與莖長呈正線性相關（圖5C），相關系數為0.071 288；NH4NO3濃度倍數與莖長呈負線性相關（圖5D），相關系數為-0.193 460；K2SO4、MgSO4·7H2O濃度倍數與莖長無顯著相關性（圖5A、圖5B）。（2）K2SO4與MgSO4·7H2O濃度倍數的交互作用與莖長呈正線性相關（圖5F），相關系數為0.060 904；K2SO4與KH2PO4濃度倍數的交互作用與莖長呈正線性相關（圖5G），相關系數為0.062 311；NH4NO3與KH2PO4濃度倍數的交互作用與莖長呈負線性相關（圖5H），相關系數為-0.050 456。（3）Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數對莖長無顯著影響（圖5E），但其平方值對莖長具有顯著影響，相關系數為-0.042 483，莖長隨Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數增大呈現先上升后下降的趨勢。

取F值＞3.0的二元二次項分析交互作用與響應曲面。比較F值大小可知，x1x2、x1x3、x3x4和x3x5這4項交互作用對莖長的影響程度順序為：x1x3＞x1x2＞x3x4＞x3x5，即K2SO4與KH2PO4的交互作用＞K2SO4與MgSO4·7H2O的交互作用＞KH2PO4與NH4NO3的交互作用＞KH2PO4與Ca（NO3）2·4H2O的交互作用。具體影響如下：（1）K2SO4與MgSO4·7H2O濃度為1∶1且同時升高時，莖長先下降后升高（圖6A）。（2）K2SO4與KH2PO4濃度同時增加時，莖長上升，在兩者同時達到3.0倍時莖長達到最高值（圖6B）。（3）KH2PO4與NH4NO3濃度同時升高時，莖長先升高后下降；當KH2PO4處于高濃度且NH4NO3處于低濃度時，試管苗莖長最高（圖6C）。（4）KH2PO4與Ca（NO3）2·4H2O濃度同時升高時，莖長隨之升高；當KH2PO4濃度較高且Ca（NO3）2·4H2O濃度倍數約為3.0倍時，莖長達到最高值（圖6D）。

2.4 WPM中的5種大量元素配方優化及驗證

通過Design-Expert 12.0建立模型，將皇冠牡丹試管苗增殖系數目標設為max，重要程度為5（+++++）；莖長目標設為max，重要程度為4（++++）；株高目標設為max，重要程度為3（+++）；葉片數目標設為max，重要程度為2（++）。根據模型分析結果，可得出適宜皇冠牡丹增殖培養的WPM中的5種大量元素的最佳濃度倍數分別為x1=2.28、x2=2.45、x3=2.83、x4=0.50、x5=3.53，即K2SO4、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O的質量濃度分別為2 257 mg/L、907 mg/L、481 mg/L、200 mg/L與1 963 mg/L，此時培養基中離子濃度分別為NO-3 19.13 mmol/L，NH+4 2.50 mmol/L，Ca2+ 8.31 mmol/L，K+ 29.44 mmol/L，Mg2+ 3.68 mmol/L，PO3-4 3.53 mmol/L，SO2-4 16.63 mmol/L，并通過模型預測出在該條件下皇冠牡丹的增殖系數、株高、莖長與單株葉片數分別為2.24、4.32 cm、1.64 cm、5.31張。使用該配方進行驗證試驗（圖7），得到皇冠牡丹的增殖系數、株高、莖長與單株葉片數分別為2.43、4.62 cm、1.30 cm、6.75張，除莖長稍低外，其余指標均高于預測值，并顯著優于對照組（1.80、3.84 cm、1.32 cm、4.32張），這說明該模型可信，本研究得出的5種大量元素的最佳濃度可以用于皇冠牡丹的增殖培養。

3 討論

3.1 單因素條件對皇冠牡丹增殖和生長的影響

在對植物進行離體培養時，植物生長發育所需養分主要來源于培養基，基本培養基的成分與濃度對植物有重要影響[17]。本研究結果表明，WPM中的5種大量組分中，KH2PO4、NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O對牡丹試管苗的增殖效果有顯著或極顯著影響，而MgSO4·7H2O與K2SO4對牡丹試管苗的增殖效果無明顯影響。

KH2PO4可同時為植物提供磷、鉀2種大量元素，在WPM、MS與DKW等植物培養基中均有添加，增加KH2PO4用量會促進植物生物量的累積[18]。本研究發現，隨著KH2PO4濃度上升，試管苗的增殖系數、株高與莖長明顯提高，481 mg/L（2.83倍）KH2PO4為皇冠牡丹試管苗增殖最適濃度，而高濃度KH2PO4雖然會促進牡丹試管苗株高與莖長增加，但同時會降低增殖系數與葉片數。多數研究結果表明，不同植物適宜的KH2PO4濃度差異顯著，蘋果矮化砧木SH6繼代培養的最適濃度為175 mg/L[19]，杏（Prunus armeniaca）試管苗培養的最適KH2PO4濃度為125 mg/L[12]，而油松（Pinus tabuliformis）成熟離體胚不定芽誘導所需最適KH2PO4濃度為340 mg/L[20]。此外，同種植物的不同品種適宜的KH2PO4濃度也存在較大差異，如在使用MS的基礎上，KH2PO4濃度對白鶴芋屬（Spathiphyllum）不同品種增殖系數的影響存在差異[21]。因此，皇冠牡丹試管苗增殖階段的最佳KH2PO4質量濃度為481 mg/L（2.83倍），但對于其他牡丹品種還需要根據實際情況具體分析。

鈣元素在細胞分裂、細胞壁形成和分生組織生長過程中是非常重要的[22]，前人研究發現高濃度Ca2+對牡丹試管苗的增殖效果有促進作用，將MS培養基中CaCl2濃度提升至原濃度的2倍可顯著提高Mme de Vatry牡丹試管苗的增殖系數，并減輕莖尖壞死和玻璃化程度[6]。然而，不同牡丹品種的最適鈣鹽濃度具有較大差異，同樣以WPM作為增殖培養基，正午牡丹的最適Ca（NO3）2·4H2O濃度為1 668 mg/L（3.00倍），此時試管苗的增殖系數可達到3.0，子代腋芽較為粗壯[8]；而鳳丹牡丹的最適Ca（NO3）2濃度為1 544 mg/L（4.00倍），此時增殖系數可達3.07[9]，這可能是由牡丹品種間基因型不同所致。本研究發現，隨著Ca（NO3）2·4H2O濃度升高，皇冠牡丹試管苗的增殖系數與莖長呈先升高后下降的趨勢，而株高則持續上升，最佳Ca（NO3）2·4H2O質量濃度為1 963 mg/L（3.53倍），在該條件下試管苗較為健壯，分枝與莖葉數量較對照顯著提高，且莖尖壞死現象得到有效緩解，與前人研究結果一致。因此，在一定范圍內提高WPM中Ca（NO3）2·4H2O濃度是提高牡丹試管苗增殖效果的有效途徑，而其具體的作用機理也值得后續研究深入探索。

3.2 交互作用對皇冠牡丹試管苗有增殖和生長的影響

本研究結果顯示，K2SO4與KH2PO4、K2SO4與MgSO4·7H2O、KH2PO4與NH4NO3的交互作用對試管苗增殖效果影響顯著或極顯著。因電荷存在動態平衡，培養基中大量元素間的交互作用實則為離子間的交互作用[23]，因此本研究以分析離子間的交互作用與元素對植物的影響為主。

K2SO4與KH2PO4的交互作用對株高、莖長均有顯著或極顯著影響，當二者濃度同時增大時，增殖系數呈先升高后下降的趨勢，株高與莖長呈升高趨勢。因二者的陽離子相同，其交互作用實則為SO2-4與PO3-4間的交互作用，SO2-4提供硫元素，含硫氨基酸不僅是構成蛋白質的主要成分，還是細胞內某些化合物合成的介質之一[24]；PO3-4提供磷元素，磷是植物必需的大量元素，參與磷脂、核酸、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和輔酶等大分子合成[25]。已有研究結果表明，施磷能顯著提高牡丹植株葉片的葉綠素含量并促進光合作用[26]，而硫是植物光合作用過程中的重要組分，二者均與光合作用有關；Misson等[27]發現，在低磷環境下植物會加大對硫酸鹽的吸收轉運以合成硫脂，而硫脂可以在一定程度上代替磷脂，說明硫、磷元素在功能上存在重疊性，存在相互影響。目前關于SO2-4與PO3-4在植物體內的交互作用尚未見報道，但從本研究結果可以看出二者存在協同的交互作用，適宜的SO2-4與PO3-4濃度比會促進試管苗的增殖。但本研究也發現，當二者濃度同時超過2.50倍后，增殖系數與葉片數會出現下降趨勢，這可能是過高的離子濃度對植物產生了毒害作用。因此，在提高培養基內營養物質濃度以促進試管苗增殖的過程中，應注意保持培養基中離子濃度平衡，避免過高的濃度對植物生長產生負面影響。

本研究結果顯示，K2SO4與MgSO4·7H2O的交互作用對莖長有極顯著影響，當兩者濃度同時上升時，莖長呈先下降后上升的趨勢。已有研究結果表明鉀元素與鎂元素存在交互作用，高濃度鉀會抑制植物對鎂的吸收，并導致植物因缺鎂而生長不良[28]。這可能與二者相似的化學性質產生的拮抗作用有關[29]，而對細胞膜上相同轉運蛋白的競爭是二者產生拮抗作用的主要原因[30]，且鉀、鎂間的交互作用會影響植物對其他養分如氮、磷、鈣等的積累[31-32]。本研究中當K2SO4與MgSO4·7H2O濃度倍數介于0.5～2.0時，莖長呈下降趨勢，這與前人研究發現的鉀、鎂元素間的拮抗作用相符合；而當二者濃度倍數大于2.0后，莖長呈上升趨勢，這可能是由于更高濃度的鉀、鎂元素能抵消一部分拮抗作用對試管苗產生的負面影響。因此，在改良培養基中大量元素配方時應重視礦質元素間的平衡關系，盡量避免鉀、鎂元素間產生拮抗作用，而關于鉀、鎂元素在牡丹體內的作用機理則需要進一步研究。

本研究結果顯示，KH2PO4與NH4NO3間的交互作用對莖長有顯著影響，當KH2PO4濃度上升、NH4NO3濃度下降時，莖長呈升高趨勢。前人研究發現植物對二者需求的差異可能與基因型、統計方式和使用濃度范圍有關[33-35]。Akin等[11]在對榛子（Corylus heterophylla）所使用的DKW培養基中的離子濃度進行響應面法優化時也發現相似情況，即當KH2PO4為高濃度、NH4NO3為低濃度時，榛子Wepster能得到較高的芽質量，榛子Dorris和Wepster能達到理想芽長。這可能是由于NH4NO3與KH2PO4在產生交互作用時，隨著兩者濃度升高，NH4NO3與Ca（NO3）2·4H2O同時產生了反應，而Ca（NO3）2·4H2O和NH4NO3同時為試管苗提供氮元素，降低NH4+與NO-3比值能夠顯著促進牡丹試管苗增殖[7-9]，本研究據此優化得出結果，將NH4NO3濃度降低為基本WPM中濃度的0.50倍后，增殖效果得到顯著提升，與前人研究結果相似。

3.3 銨態氮（NH+4-N）和硝態氮（NO-3-N）濃度比值對皇冠牡丹增殖的影響

氮是植物生長過程中需求量最大的礦質元素，是組成蛋白質和核酸的必要成分。WPM為木本植物專用培養基[36]，供給植物的主要氮源為銨態氮（NH+4-N）和硝態氮（NO-3-N），其中NH4NO3提供NH+4-N，NH4NO3和Ca（NO3）2·4H2O共同提供NO-3-N。二者雖共同提供氮元素，但對植物生長的作用存在差異，關于培養基中NH+4-N與NO-3-N的濃度比值對試管苗增殖效果的影響已有諸多研究報道，結果顯示，較低的NH+4-N與NO-3-N的濃度比會促進試管苗的增殖與生長[11， 37-40]。在牡丹研究中也發現類似現象，例如Li等[7]通過降低MS培養基中NH+4-N與NO-3-N濃度比值以促進牡丹試管苗增殖，而后有試驗通過增加培養基中Ca（NO3）2·4H2O濃度，在NH+4-N與NO-3-N的濃度比值降低的同時提高培養基中Ca2+的濃度，顯著提高了牡丹試管苗的增殖效果[8-9]。這表明降低培養基中NH+4-N與NO-3-N的濃度比值有利于牡丹試管苗的增殖，這可能是由于高濃度NH4+會促進植物吸收過多水分，從而導致試管苗枝條壞死、存活率降低[40-41]，同時較低的NH+4-N與NO-3-N的濃度比值可以更好地緩沖培養基的pH，減少培養基pH波動對試管苗的影響[42]。本研究也得到類似結果，將Ca（NO3）2·4H2O濃度提升至3.50倍，NH4NO3降低至0.50倍后，試管苗增殖系數得到顯著提升，并且莖尖壞死現象得到緩解。綜上可見，WPM中原有的NH+4-N與NO-3-N的濃度比值無法滿足牡丹試管苗的增殖需要，在一定范圍內提高培養基中Ca（NO3）2·4H2O濃度并降低NH4NO3濃度，是促進皇冠牡丹試管苗增殖生長的有效途徑。當然，不同牡丹品種的適宜濃度存在較大差異，關于NH+4-N與NO-3-N的濃度比值對牡丹試管苗產生影響的機理研究還尚在探索階段，還需進一步研究。

4 結論

本研究基于響應面法，優化得到皇冠牡丹增殖培養專用WPM大量元素配方[K2SO4 2 257 mg/L、MgSO4·7H2O 907 mg/L、KH2PO4 481 mg/L、NH4NO3 200 mg/L、Ca（NO3）2·4H2O 1 963 mg/L]，建立了高效的皇冠牡丹增殖培養體系，在該條件下試管苗的增殖效率（增殖系數2.43、株高4.62 cm、莖長1.30 cm、葉片數6.75張）得到顯著提高。

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（責任編輯：陳海霞）