百香果SPL轉錄因子家族成員鑒定及其對低溫脅迫的響應

摘要：SPL（SQUAMOSA啟動子結合類蛋白質）是一類特異存在于植物中的轉錄因子，參與植物生長發育的多個過程。為明確百香果SPL轉錄因子家族成員特征及其對低溫脅迫的響應，本研究利用生物信息學方法和百香果基因組數據，對百香果SPL家族基因的結構、染色體分布、共線性關系及其編碼蛋白質理化性質、進化關系進行分析，并通過低溫和常溫處理明確了百香果幼苗葉片SPL家族基因的相對表達量差異。結果表明，從百香果基因組中鑒定出19個SPL家族成員，分布于7條染色體上，其中包含3對共線性基因對。系統進化分析結果顯示該家族分為9個亞族。百香果PeSPL基因啟動子區域存在大量激素響應元件和逆境脅迫響應元件。低溫脅迫下，百香果PeSPL2、 PeSPL3、 PeSPL6、 PeSPL7、PeSPL8和PeSPL9 6個基因的相對表達量極顯著上升，PeSPL13和PeSPL18 2個基因的相對表達量顯著下降。本研究結果可為進一步揭示百香果SPL基因對低溫脅迫的響應機制提供依據。

關鍵詞：百香果；SPL基因家族；低溫脅迫；表達分析

中圖分類號：S667.9文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2024）07-1320-10Identification of SPL transcription factor gene family members and their response to cold stress in passion fruitREN Rui，ZHANG Han，JIANG Wenjie，PAN Jiayi，FANG Ting

（College of Horticulture， Fujian Agriculture and Forestry University/Institute of Horticultural Plant Genetics and Breeding， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou 350002， China）

Abstract：SPL （SQUAMOSA promoter-binding protein-like） is a plant-specific transcription factor that participates in many processes of plant growth and development. In order to clarify the characteristics of SPL transcription factor family members and their response to low temperature stress in passion fruit， bioinformatics methods and genome data of passion fruit were used to analyze the structure， chromosome distribution， collinear relationship of SPL family genes in passion fruit， as well as the physicochemical properties and evolutionary relationship of SPL family genes encoded proteins. The relative expression differences of SPL family genes in the leaves of passion fruit seedlings were clarified by low temperature treatment and normal temperature treatment. The results showed that 19 SPL family members were identified from the genome of passion fruit， which were distributed on seven chromosomes， including three pairs of collinear gene pairs. SPL gene family of passion fruit was divided into nine branches according to results of phylogenetic tree. There were many cis-acting elements in the promoter region of PeSPL genes of passion fruit， which responsed to hormones and stress. Under low temperature stress， the relative expression levels of PeSPL2， PeSPL3， PeSPL6， PeSPL7， PeSPL8 and PeSPL9 were extremely significantly increased， and the relative expression levels of PeSPL13 and PeSPL18 were significantly decreased. The results of this study can provide a basis for further revealing the response mechanism of passion fruit SPL gene to low temperature stress.

Key words：passion fruit;SPL gene family;cold stress;expression analysis

SPL（SQUAMOSA啟動子結合類蛋白質）又稱為SBP-box蛋白 （SQUAMOSA promoter binding protein），是綠色植物特有的一類轉錄因子，在植物生長發育、激素響應、光信號轉導等方面發揮重要作用[1-2]。1996年，Klein等[3]從金魚草中發現并首先分離出SPL基因AmSBP1和AmSBP2，因其編碼蛋白質可與花發育基因SQUAMOSA的啟動子結合，因此被命名為SQUAMOSA啟動子結合類蛋白質（SBP）[4]。

目前，擬南芥[5]、水稻[6]、馬尾松[7]、番茄[8]、蘋果[9]、草莓[10]和甜橙[11]等植物中SPL家族基因的成員已經得到鑒定，并分別鑒定出17個、19個、11個、15個、27個、14個、15個SPL成員。SPL基因在植物生長發育中起重要的調控作用[12-18]。AtSPL8通過影響赤霉素（GA）合成和花藥發育來調節擬南芥生長發育過程[16]。AtSPL3基因的組成型表達會導致擬南芥植株的花期提前[5]。AtSPL2和AtSPL11基因能調控擬南芥的開花過程[19]。Stone等[18]研究發現，AtSPL14不僅能調控植物對伏馬菌素B1的抗性，還能影響到擬南芥的株型結構。此外，SPL基因在植物響應非生物脅迫方面也發揮著重要作用。在擬南芥中過表達中國野生葡萄資源的VpSBP16基因可提高其耐鹽和抗干旱能力[20]；擬南芥中miR156-SPL9-DFR通路協同調控植物生長與非生物脅迫響應之間的關系[19]；茶樹中多個SBP基因的表達量在低溫處理后呈現顯著上調[21]。

百香果（Passiflora edulis Sims）是西番蓮科西番蓮屬藤本植物，又被稱作雞蛋果和西番蓮等，其果實香氣濃郁且富含多酚類化合物、生物堿以及黃酮類化合物等多種對人體有益的活性成分，具有較高的食用價值和藥用價值[22-24]。由于百香果原產于南美洲的熱帶地區，抗寒能力較差，低溫冷害已成為世界各國百香果產業發展的重要限制因子[25-26]。因此，對百香果SPL基因家族成員進行鑒定及對其低溫脅迫下的表達特征進行分析，可為百香果SPL基因的抗寒功能研究及耐低溫百香果品種選育提供理論依據。

1材料和方法

1.1植物材料

2023年5月20日在福建農林大學園藝植物遺傳育種實驗室選取6株長勢基本一致的3個月苗齡臺農百香果幼苗作為試驗材料，其中3株放入人工氣候箱進行4 ℃低溫脅迫處理8 h，另外3株置于25 ℃環境下培養，其他條件與低溫處理組一致，8 h后取各植株中上部葉片，迅速置于液氮中冷凍，于-80 ℃冰箱保存，用于基因表達模式分析。

1.2百香果SPL基因家族成員的鑒定

擬南芥SPL蛋白序列下載自擬南芥基因組數據庫TAIR（https ：//www.arabidopsis.org/），百香果基因組序列下載自國家基因庫生命大數據平臺（CNGBdb）[24]。以模式植物擬南芥的SPL基因的編碼蛋白序列為模板，利用Tbtools軟件設定E值<1×10-5，在百香果的蛋白質數據庫[24]中進行同源對比，得到百香果SPL基因家族候選序列，進一步利用NCBI-CCD和Pfam數據庫對候選序列進行SBP-box結構域完整性的鑒定。

1.3百香果SPL家族基因編碼蛋白質理化性質及亞細胞定位利用TBtools軟件進行百香果SPL家族基因編碼蛋白質的理化性質預測。利用在線網站WoLFPSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp）進行百香果SPL家族基因編碼蛋白質的亞細胞定位。

1.4百香果SPL基因家族成員基因結構及蛋白質保守基序分析利用在線網站GSDS2.0（http：//gsds.gao-lab.org/）分析百香果SPL家族基因的結構。利用MEME網站（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）分析百香果SPL家族成員編碼蛋白質的保守基序，并利用TBtools軟件進行結果的可視化表達。

1.5百香果SPL家族系統進化樹構建及分析

設置自展系數（Booststrap）為1 000次，利用MEGA7軟件采用鄰近法（Neighbor-joining method）進行百香果和擬南芥的SPL家族成員系統進化樹構建。

1.6百香果SPL家族基因染色體定位及共線性分析

利用TBtools軟件進行百香果SPL基因的染色體定位和基因共線性分析。

1.7百香果SPL家族基因啟動子順式作用元件分析

提取百香果SPL基因起始密碼子前2 000 bp片段作為啟動子序列，利用PlantCARE在線網站 （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進行順式作用元件預測分析，并利用TBtools軟件進行數據可視化表達。

1.8百香果SPL家族基因低溫脅迫響應分析

參照Redzol試劑盒[賽百盛（北京）基因技術有限公司]說明書提取臺農百香果葉片的總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質量。使用Code AH341-01反轉錄試劑盒（北京全式金生物技術股份有限公司產品）將臺農百香果RNA反轉錄為cDNA，于-80 ℃保存備用。以Pe60S基因[27]為內參基因，SYBR Green I Master Mix 為PCR擴增預混液[寶日醫生物技術（北京）有限公司產品]，利用LightCycler 96 實時定量PCR 系統（瑞士Hoffmann-La Roche 有限公司產品）檢測常溫和低溫處理下百香果葉SPL基因的表達水平，所用引物序列見表1。使用2-△△Ct方法[28]計算SPL基因的相對表達量，利用SPSS軟件中的Duncan’s新復極差法進行不同處理SPL基因相對表達量的差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1百香果SPL基因家族成員的鑒定

在百香果基因組中共篩選得到19個SPL家族基因，根據其在染色體上的排列順序分別命名為PeSPL1～PeSPL19（表2）。百香果SPL家族基因編碼蛋白質的氨基酸數量為141～1 078個，相對分子量和等電點分別為1.613×104～11.971×104和5.32～9.40，不穩定系數為41.03～66.19，脂溶指數和親水性指數分別為40.14～89.89和-1.211～-0.046。除PeSPL10蛋白定位于細胞質，PeSPL12蛋白定位于葉綠體，其他百香果SPL家族蛋白均定位于細胞核。

2.2百香果SPL家族基因結構和保守基序（Motif）分析PeSPL家族基因的結構如圖1所示。從圖中可以看出，PeSPL所有成員均含有內含子和外顯子，但內含子和外顯子數量存在較大的差異。PeSPL3、PeSPL14、PeSPL15、PeSPL19基因各有1個內含子，PeSPL5、PeSPL6、PeSPL7、PeSPL13、PeSPL17基因各有2個內含子，PeSPL4、PeSPL9、PeSPL11、PeSPL16基因各有3個內含子，PeSPL10、PeSPL12基因各有5個內含子，PeSPL8、PeSPL18、PeSPL1、PeSPL2基因分別有4個、6個、9個和10個內含子。PeSPL1和PeSPL2基因分別含有10個和11個外顯子，PeSPL8、PeSPL10、PeSPL12和PeSPL18基因含有5～7個外顯子，其他13個基因含有2～4個外顯子。PeSPL基因編碼蛋白質含有2～10個保守基序（Motif1～Motif10），其中PeSPL11和PeSPL12含有全部10個保守基序，而PeSPL17蛋白僅有2個保守基序（Motif1和Motif3），所有基因編碼蛋白質均包含保守基序Motif1和Motif3（圖2）。

2.3百香果SPL家族成員系統進化樹構建及分析

擬南芥和百香果SPL家族基因編碼蛋白質的系統進化樹如圖3所示。從圖中可以看出，整個進化樹被分為9個亞族。除Ⅶ亞族之外，其余8個亞族都含有百香果SPL家族成員。其中，Ⅰ、Ⅴ、Ⅷ和Ⅸ亞族中均含有3個百香果SPL家族成員，數量最多；其次是Ⅱ、Ⅳ和Ⅵ亞族，均含有2個百香果SPL家族成員；Ⅲ亞族中僅含有1個百香果SPL家族成員。

2.4百香果SPL家族基因的染色體定位與共線性分析百香果SPL家族基因的染色體定位和共線性關系如圖4所示。19個PeSPL基因定位在百香果的7條染色體上。其中，1號染色體上分布得最多，有12個成員，2號染色體上有2個成員，3號、5號、6號、7號和9號染色體上各有1個成員。19個PeSPL基因間存在3對共線性基因對（PeSPL16與PeSPL18、PeSPL6與PeSPL9、PeSPL7與PeSPL8）。上述共線性關系說明百香果SPL基因家族在進化過程中發生了基因復制，從而導致百香果SPL家族基因的多樣性。

2.5百香果SPL家族基因啟動子順式作用元件分析百香果SPL家族基因啟動子順式作用元件如圖5所示。從圖中可以看出，19個PeSPL基因啟動子均具有光響應元件。大多數PeSPL基因啟動子具有激素響應元件，如生長素響應元件、茉莉酸甲酯響應元件、脫落酸（ABA）響應元件等，PeSPL10基因啟動子具有5個生長素響應元件和12個茉莉酸甲酯響應元件，PeSPL11基因啟動子上含有7個脫落酸響應元件。百香果SPL基因的啟動子中，還存在大量與逆境脅迫響應相關的元件，如低溫響應元件、干旱誘導響應元件等。除PeSPL14基因外，其他PeSPL基因啟動子均具有厭氧誘導元件，PeSPL4基因啟動子中有4個低溫響應元件，PeSPL8基因啟動子中有3個干旱誘導響應元件。

2.6百香果SPL基因家族在低溫脅迫條件下的表達分析低溫脅迫下，百香果SPL家族基因的相對表達量如圖6所示。從圖中可以看出，8個PeSPL基因的相對表達量在低溫處理后呈現顯著或極顯著變化，其中PeSPL2、 PeSPL3、 PeSPL6、 PeSPL7、 PeSPL8 和PeSPL9 6個基因的相對表達量極顯著上升，PeSPL13 和PeSPL18 2個基因的相對表達量顯著下降，說明這些基因可能參與了百香果響應低溫的過程。*和**分別表示處理間差異顯著（P<0.05）和差異極顯著（P<0.01）。

3結論與討論

SPL基因家族已經被證明在植物胚胎發育[29]、果實成熟[30]以及逆境脅迫響應[19-21]中發揮重要作用。本研究利用同源比對與結構域篩選相結合的方法從百香果基因組中鑒定出19個PeSPL家族基因。19個PeSPL的外顯子數目為2～11個，差異較大，這與蘋果[9]和甜橙[11]等作物中SPL家族成員外顯子數目差異大的特征一致。本研究還發現部分同屬于一個進化亞族的PeSPL基因的結構亦存在差異，例如PeSPL2和PeSPL4、PeSPL10和PeSPL14、PeSPL16和PeSPL18，原因可能是同一亞族內的不同基因在進化過程中出現了外顯子的丟失或增加。此外，PeSPL蛋白的氨基酸長度差異也較大，這可能會導致該基因家族成員的功能多樣性。

系統發育分析結果顯示百香果和擬南芥SPL家族成員可以分為9個亞族，與甜橙一致[11]。部分百香果SPL成員與擬南芥SPL成員親緣關系較近，例如PeSPL5、PeSPL11和PeSPL12與AtSPL6聚為1類。Padmanabhan等[31]的研究結果表明，擬南芥AtSPL7基因在植物抗病過程中發揮重要作用，推測與AtSPL7位于進化樹同一亞族的PeSPL10也有類似功能。對百香果SPL家族成員的染色體定位發現，除4號和8號染色體外，其余7條染色體上均有PeSPL基因，其中1號染色體上最多，共有12個。進一步的共線性分析結果表明，PeSPL家族基因存在3對共線性基因，表明該家族在物種進化中存在基因復制現象。本研究結果可為深入理解百香果SPL家族基因的進化過程提供理論參考。

SPL基因家族在響應植物逆境脅迫過程中發揮重要功能。如水稻的OsSPL3基因通過正向調控OsWRKY71基因的表達進而響應低溫脅迫[32]，SPL9基因的過表達可提高CBF2基因的表達量進而增強擬南芥植株的抗寒性[33]。本研究發現，百香果SPL家族基因啟動子上存在大量低溫、干旱等逆境響應相關的順式作用元件；實時定量PCR分析亦發現低溫脅迫下有8個基因的相對表達量發生了顯著或極顯著變化，推測這些基因可能參與了百香果低溫響應過程。本研究結果可為進一步解析百香果SPL基因的功能和作用機制、明確百香果SPL基因對低溫脅迫的響應機制提供基礎和依據。

參考文獻：

[1]汪先菊，張紹宇，徐澤，等. 桃SPL基因家族成員鑒定及基因表達與果實發育的相關性分析[J]. 農業生物技術學報，2020，28（9）：1521-1534.

[2]FENG X， WANG Y， ZHANG N， et al. Systematic identification，evolution and expression analysis of the SPL gene family in sugarcane （Saccharum spontaneum）[J]. Tropical Plant Biology，2021，14（3）：313-328.

[3]KLEIN J， SAEDLER H， HUIJSER P. A new family of DNA binding proteins includes putative transcriptional regulators of the Antirrhinum majus floral meristem identity gene SQUAMOSA[J].Molecular and General Genetics，1996，250：7-16.

[4]BIRKENBIHL R P， JACH G， SAEDLER H， et al. Functional dissection of the plant-specific SBP-domain： overlap of the DNA-binding and nuclear localization domains[J]. Journal of Molecular Biology，2005，352（3）：585-596.

[5]CARDON G H， HOHMANN S， NETTESHEIM K， et al. Functional analysis of the Arabidopsis thaliana SBP-box gene SPL3：a novel gene involved in the floral transition[J]. The Plant Journal，1997，12（2）：367-377.

[6]XIE K B， WU C Q， XIONG L Z. Genomic organization， differential expression， and interaction of SQUAMOSA promoter-binding-like transcription factors and microRNA156 in rice[J]. Plant Physiology，2006，142（1）：280-293.

[7]王春昱，范付華. 馬尾松SPL基因家族鑒定及其響應低磷脅迫的表達分析[J]. 農業生物技術學報，2023，31（3）：509-517.

[8]SALINAS M， XING S， HOHMANN S， et al. Genomic organization， phylogenetic comparison and differential expression of the SBP-box family of transcription factors in tomato[J]. Planta，2012，235（6）：1171-1184.

[9]LI J， HOU H， LI X， et al. Genome-wide identification and analysis of the SBP-box family genes in apple （Malus×domestica Borkh.）[J]. Plant Physiol Biochem，2013，70：100-114.

[10]XIONG J S， ZHENG D， ZHU H Y， et al. Genome-wide identification and expression analysis of the SPL gene family in woodland strawberry Fragaria vesca[J]. Genome，2018，61（9）：675-683.

[11]楊杰，陳蓉，胡文娟，等. 甜橙SPL基因家族的鑒定及其在成花誘導中的表達分析[J]. 西北植物學報，2022，42（1）：48-56.

[12]YU N， CAI W J， WANG S， et al. Temporal control of trichome distribution by microRNA156-targeted SPL genes in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Cell，2010，22（7）：2322-2335.

[13]WU G， POETHIG R S. Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3[J]. Development，2006，133（18）：3539-3547.

[14]WANG H， NUSSBAUM-WAGLER T， LI B， et al. The origin of the naked grains of maize[J]. Nature，2005，436（7051）：714-719.

[15]ZHANG Y， SCHWARZ S， SAEDLER H， et al. SPL8， a local regulator in a subset of gibberellin-mediated developmental processes in Arabidopsis[J]. Plant Mol Biol，2007，63（3）：429-439.

[16]UNTE U S， SORENSEN A M， PESARESI P， et al. SPL8， an SBP-box gene that affects pollen sac development in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2003，15（4）：1009-1019.

[17]ERIKSSON M，MOSELEY JL，TOTTEY S， et al. Genetic dissection of nutritional copper signaling in chlamydomonas distinguishes regulatory and target genes[J]. Genetics，2004，168（2）：795-807.

[18]STONE J M， LIANG X， NEKL E R，et al. Arabidopsis AtSPL14， a plant-specific SBP-domain transcription factor， participates in plant development and sensitivity to fumonisin B1[J]. The Plant Journal，2005，41（5）：744-754.

[19]CUI L， SHAN J， SHI M， et al. The miR156-SPL9-DFR pathway coordinates the relationship between development and abiotic stress tolerance in plants[J]. Plant Journal，2014，80（6）：1108-1117.

[20]HOU H， JIA H， YAN Q， et al. Overexpression of a SBP-Box gene （VpSBP16） from Chinese wild vitis species in Arabidopsis improves salinity and drought stress tolerance[J]. International Journal of Molecular Sciences，2018，19（4）：940.

[21]ZHANG D， HAN Z， LI J， et al. Genome-wide analysis of the SBP-box gene family transcription factors and their responses to abiotic stresses in tea （Camellia sinensis）[J]. Genomics，2020，112（3）：2194-2202.

[22]陳媚，劉迪發，徐麗，等. 西番蓮研究進展[J]. 中國南方果樹，2020，49（6）：182-189.

[23]徐青，安松，李玉嬌，等. 不同產地紫果百香果主要功能成分含量及抗氧化活性研究[J]. 中國果樹，2023（5）：76-83.

[24]MA D， DONG S， ZHANG S， et al. Chromosome-level reference genome assembly provides insights into aroma biosynthesis in passion fruit （Passiflora edulis）[J]. Molecular Ecology Resources，2021，21（3）：955-968.

[25]韋曉霞，王小安，陳瑾，等. 百香果低溫脅迫轉錄組及茉莉酸代謝基因分析[J]. 核農學報，2021，35（4）：815-825.

[26]LIANG J， FANG Y， AN C， et al. Genome-wide identification and expression analysis of the bHLH gene family in passion fruit （Passiflora edulis） and its response to abiotic stress[J]. International Journal of Biological Macromolecules，2022，225：389-403.

[27]MUNHOZ C F， SANTOS A A， ARENHART R A， et al. Analysis of plant gene expression during passion fruit-Xanthomonas axonopodis interaction implicates lipoxygenase 2 in host defence[J]. Annals of Applied Biology，2015，167（1）：135-155.

[28]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method[J]. Methods，2001，25：402-408.

[29]NODINE M D， BARTEL D P. MicroRNAs prevent precocious gene expression and enable pattern formation during plant embryogenesis[J]. Genes & Development，2010，24（23）：2678-2692.

[30]MANNING K， TR M， POOLE M， et al. A naturally occurring epigenetic mutation in a gene encoding an SBP-box transcription factor inhibits tomato fruit ripening[J].Nature Genetics，2006，38（8）：948-952.

[31]PADMANABHAN M S， MA S， BURCH-SMITH T M， et al. Novel positive regulatory role for the SPL6 transcription factor in the N TIR-NB-LRR receptor-mediated plant innate immunity[J]. PLoS Pathogens，2013，9（3）：e1003235.

[32]ZHOU M Q， TANG W. MicroRNA156 amplifies transcription factor-associated cold stress tolerance in plant cells[J]. Molecular Genetics and Genomics，2019，294（2）：379-393.

[33]ZHAO J L， SHI M， YU J， et al. SPL9 mediates freezing tolerance by directly regulating the expression of CBF2 in Arabidopsis thaliana[J]. BMC Plant Biology，2022，22：59.

（責任編輯：石春林）