單細胞轉錄組測序技術在家養動物中的應用

摘 要： "單細胞轉錄組測序技術（single cell RNA sequencing， scRNA-seq）可以能夠以高精度分辨率鑒定單個細胞類型和細胞狀態，打破普通轉錄組測序（bulk RNA sequencing， RNA-seq）無法探究目標細胞具體表達特征的困境，在各個領域的探索中起到重要作用，目前廣泛應用于人類及小鼠發育生物學、腫瘤學、免疫學、復雜疾病、腸道微生物組及臨床應用等諸多領域。近年來，scRNA-seq在畜牧業領域也開展了一些開創性的研究并獲得了一系列的成果，主要集中在動物繁殖性能、胚胎發育、關鍵性狀解析等方面，但相較于在人類上的應用還較為薄弱，在其他領域的應用也仍有待深入。本文主要綜述了scRNA-seq的工作流程及其在家養動物中應用的研究進展，以期為提高scRNA-seq分析效率以及在家養動物中的創新應用提供參考。

關鍵詞： 單細胞；轉錄組測序；家養動物

中圖分類號：S813.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3276-12

收稿日期：2024-02-02

基金項目：國家重點研發計劃青年科學家項目（2023YFF1001800）；國家重點研發計劃（2022YFF1000103）；國家自然科學基金（31802031;31960659）；中國農業科學院科技創新工程（CAAS-ZDRW202106；ASTIP-IAS13）；財政部和農業農村部：國家現代農業產業技術體系資助（CARS-38）

作者簡介：張肖旭（2000-），女，山東鄒城人，博士生，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： zhangxiaoxu_dk@163.com

通信作者：潘章源，主要從事動物功能基因組學研究，E-mail： zhypan01@163.com；儲明星，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： mxchu@263.net

Application of Single-Cell Transcriptome Sequencing Technology in Domesticated Animals

ZHANG" Xiaoxu， LI" Hao， FENG" Pingjie， YANG" Hao， LI" Xinyue， L Ran， PAN" Zhangyuan*， CHU" Mingxing*

（State Key Laboratory of Animal Biotech Breeding， Institute of Animal Science， Chinese Academy

of Agricultural Sciences， Beijing 100193，" China）

Abstract：" Single-cell transcriptome sequencing technology（scRNA-seq） can identify individual cell types and cell states with high-precision resolution， breaking the dilemma that ordinary transcriptome sequencing unable to probe the specific expression characteristics of target cells， and playing an important role in the exploration of various fields， which is now widely used in many fields， such as human and mouse developmental biology， oncology， immunology， complex diseases， intestinal microbiome and clinical applications. In recent years， scRNA-seq has also carried out some pioneering research in the field of animal husbandry， mainly focusing on animal reproductive performance， embryonic development， analysis of key traits， etc. However， the application of scRNA-seq in other fields remains to be in-depth compared to its application in humans. In this paper， we review the workflow of scRNA-seq and its application in domesticated animals is reviewed， intending to provide a reference for improving the efficiency of scRNA-seq analysis and its innovative application in domesticated animals.

Key words： single-cell; transcriptome sequencing; domesticated animals

*Corresponding authors：PAN Zhangyuan， E-mail： zhypan01@163.com; CHU Mingxing， E-mail： mxchu@263.net

細胞是機體最基本的結構組成及功能單位，細胞內表達的RNA決定細胞類型和功能，同一個體的所有細胞擁有相同的基因組，但不同細胞類型甚至每個細胞表達的RNA具有特異性［1］。以同質組織或是同類細胞為整體進行的普通轉錄組測序（bulk RNA sequencing， RNA-seq），測序結果是整個組織所有細胞的平均基因表達水平，掩蓋了組織中不同類型細胞的獨特性及異質性［2］，并且在研究復雜生物學機制過程中，組織內大量細胞很可能會將目標細胞的表達特征掩蓋，對探究微量細胞的遺傳信息有較大影響，且不利于對細胞病變過程的追蹤和生物多樣性的研究［3］；而單細胞轉錄組測序技術（single cell RNA sequencing， scRNA-seq）可通過微流控技術從動物組織分離出單個細胞，并對微量全轉錄組RNA擴增后進行高通量測序，得到單個細胞的表達譜特征，進而以高精度分辨率鑒定細胞類型和細胞狀態［4］，鎖定目標細胞以進行深入分析，是解析目標表型背后復雜分子細胞機制、探究細胞間異質性及特異性信息和細胞群體之間關系的有力工具［2，5-8］。scRNA-seq技術在單細胞分辨率下對遺傳信息進行測序，不僅能很好地解決細胞異質性問題，還能鑒定細胞亞群、繪制細胞圖譜，結合其他組學還可以挖掘差異基因表達背后的調控機制［9-11］。scRNA-seq已廣泛應用于人類發育生物學、腫瘤學、免疫學、復雜疾病、腸道微生物組及臨床應用等諸多領域，近年來在畜牧業領域也開展了一些開創性的研究并獲得了一系列的成果，尤其是在家養動物包括家豬、家禽和反芻動物中，較多應用于配子發生、生長發育和免疫與疾病研究方面，解析了家養動物生殖細胞的發育軌跡，注釋了肌肉和脂肪等組織的特異性細胞，揭示了免疫反應圖譜，為畜禽早期選育和優良性狀選育提供了重要依據，在畜牧業科研生產中具有巨大的應用潛力和廣闊的前景。盡管scRNA-seq技術在國內外已經建立了廣泛的商業化生產服務，但該技術在畜牧業中的標準化流程還需要進一步探索和梳理，為其在畜牧業中的應用提供線索［12］。

1 單細胞轉錄組測序技術簡介

2009年，Tang等［13］首次實現了單個細胞的mRNA高通量檢測，他們改進了對單個細胞mRNA的測序方法，檢測到小鼠囊胚單細胞中的基因高達5 270個，數量遠高于利用微陣列對數百個囊胚細胞的測序數據，這是scRNA-seq第一次進入人們的視野。2013年開發的單核RNA測序（single-nucleus RNA-seq， snRNA-seq）技術可以讓人們深入了解細胞核特有的調控機制，它具有易于從中樞神經系統等復雜組織和器官中分離出細胞的優勢，還能夠對冷凍組織樣品進行分析［14］。大多數已發表的scRNA-seq研究遵循相同的工作流程：分離單個細胞，捕獲RNA逆轉錄成cDNA，預擴增cDNA，制備文庫，高通量測序和數據分析。

1.1 單細胞的分離

從組織樣本中分離單個細胞是單細胞轉錄組測序的第一步。液態樣本如血液，對其進行密度梯度離心后可直接用于單細胞捕獲，固體組織樣本一般采用機械切割或刀片破碎進行分解，后采用適宜的消化酶對組織碎塊進行消化使其分離為單細胞懸液［15］。冷凍組織樣本需研磨后裂解細胞，去除雜質后加入蔗糖密度梯度離心，吸取細胞核層進行懸液制備。單細胞的分離應快速、準確以獲得完整且獨立的單細胞［16］。分離的方法主要有連續稀釋法、顯微操作法、熒光激活流式分選、激光捕獲顯微切割、微流控液滴等［17］。目前應用最為廣泛的是微流控液滴方法，應用該方法最具有代表性的平臺是10×Genomics［18］，其使用液滴作為隔離單細胞的載體，基于微流控技術將單個細胞與含有10×barcode、唯一分子標識符（unique molecular identifier， UMI）和poly（dT）VN序列的凝膠微珠包裹在一個凝膠珠（bead）中。磁珠在流動的管道中形成油包水的微液滴體系（gel bead in emulsion， GEM），單個細胞在微液滴中完成反轉錄，油滴破裂后，將cDNA進行擴增，并攜帶獨一無二的接頭。

1.2 單細胞轉錄組文庫構建及測序

單細胞轉錄組文庫制備和質量控制是關鍵環節［19］。單個GEM依次形成后再全部混合，細胞中的mRNA被反轉錄為帶有10×barcode和UMI信息的cDNA一鏈，引入適配序列或RNA聚合酶啟動子序列進行PCR或體外轉錄擴增cDNA。這一過程篩去了除mRNA外其余類型的RNA。對UMI序列進行飽和測序，準確量化轉錄物豐度［16］，在序列分析時，去除UMI序列并統計不同UMI的出現次數和頻率，所得的結果即為對應基因的表達矩陣，高效避免由聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）復制造成的數據偏移［15］。

2 單細胞轉錄組測序分析流程

測序完成后，原始數據首先應轉化為fastq格式，便于數據比對。為獲得有效的基因表達矩陣，各物種參考基因組的選擇和分析算法的選擇是整個序列比對和分析過程的核心問題［20-21］。scRNA-seq的分析大致可以分為常規分析和高級分析，常規分析例如細胞聚類、細胞簇的鑒定、功能富集分析、細胞周期階段的測定以及擬時序分析，高級分析可進行細胞間相互作用鑒定、轉錄因子活性分析、可變剪切等，也可以結合多組學研究表觀遺傳細胞特征，這些特征可以確定細胞表型，預測細胞分化的方向，獲得有關細胞間相互作用和系統發育的信息［22］。

2.1 質量控制

單細胞轉錄組測序數據結果可能受到細胞捕獲、文庫制備和測序程序產生的多種技術噪聲的影響。因此，過濾劣質數據對于后續分析至關重要。FastQC 是一種廣泛使用的工具，用于評估raw reads（去接頭前）和clean reads（去接頭后）的測序質量，由QC（quality control）值決定數據的好壞［23］。如果初步 QC 沒有發現影響較大的質量偏差，使用FastQC 后，則可以省略掉刪除異常細胞和去接頭這兩個步驟［24］。

2.2 reads比對

經過質量控制后，reads通過與參考基因組或轉錄組進行映射的方式分配給轉錄本。基于參考的比對工具大致分為兩種：當使用轉錄組作為參考時，使用包括 bowtie2 和 BWA（burrow-wheeler aligner）在內的剪接識別工具；當使用基因組作為參考時，使用如 TopHat2、STAR 和 HISAT2的剪接感知工具更有優勢，因為它們可以處理剪接對齊［24-25］。

2.3 表達定量與標準化

對raw reads進行標準化處理是一個關鍵步驟［26］，可糾正從解離樣本到生成測序數據之間的非生物（技術）差異［27-28］，使表達計數在細胞間具有可比性。這種差異可能是由于文庫制備、樣本測序深度（通常稱為文庫大小）、基因長度、讀數映射偏差、基因序列組成和序列相似性等原因造成的［29］。測序深度反映了在給定樣本中生成的二代測序（next generation sequencing， NGS）reads總量［30］。為了使不同樣本之間的文庫大小具有可比性，研究人員采用各種全局縮放因子對raw reads計數進行標準化處理［31］。

2.4 降維聚類

scRNA-seq數據呈現出高維特性，基因之間的低計數、零計數和高相關性特征與高維相結合，在分析中引入了噪聲和冗余信息，為后續分析帶來了極大挑戰。利用基因空間和細胞空間中的降維（dimension reduction， DR）可以提高分析速度，也提升了區分細胞異質性信號的能力。降維算法可將高維細胞空間投影到二維或三維的低維空間，常用的方法有主成分分析法（principal components analysis， PCA）和非線性降維方法，后者包括 t-分布隨機鄰域嵌入法（t-distributed stochastic neighbor embedding， t-SNE）和均勻流形近似和投影法（uniform manifold approximation and projection method， UMAP）。與 PCA 相比，非線性降維算法是隨機的，且高度依賴于參數的選擇，往往會扭曲全局結構，但它能夠應用于數據可視化中，因此現今t-SNE和UMAP更多的是作為細胞聚類的可視化工具［32］，便于后續的細胞類型注釋。

2.5 差異基因表達分析

標準化后的數據分析應根據試驗進行不同的設置［33-34］。差異基因表達分析（differential expression analysis， DE）是傳統RNA-seq研究的標志，可比較物種、表型等多種條件下的基因表達差異，并鑒定條件相關基因［35-37］。在scRNA-seq中，人們可以識別不同細胞類型或相同細胞類型的差異表達基因［32］。

3 單細胞轉錄組測序技術在家養動物中的應用

3.1 在豬上的應用

3.1.1 配子發生

雷佩佩［38］利用scRNA-seq在杜洛克公豬睪丸中鑒定了20個細胞群，根據marker基因將20個細胞群注釋為7個細胞類群，其中包括一個未被注釋過的新細胞群；通過對鑒定出的生殖細胞進行發育軌跡分析，篩選并驗證了CDH1和CD99是豬未分化精原細胞的分子標記物、PODXL2是分化精原細胞的分子標記物，為研究豬生殖細胞分化提供了理論基礎。Zhang等［39］通過scRNA-seq分析了豬睪丸中的精原細胞、精母細胞、精子細胞和三種體細胞類型，并將精原細胞劃分出了4個不同的亞群，確定了 CD99 和 PODXL2 分別作為未分化和分化精原細胞的新型細胞表面標記物，同時結合bulk RNA-seq數據，進一步驗證了豬生殖細胞類型定義的準確性。張發利等［40］收集了豬和綿羊睪丸發育的scRNA-seq數據，發現豬在精原細胞向精母細胞分化過程中有920個不同于綿羊的差異表達基因，它們參與調控減數分裂細胞周期過程。Zhang等［41］對關中黑豬7、30、60、90和150日齡時的睪丸單細胞轉錄組進行了分析，鑒定了5種類型的 sertoli 細胞、5種類型的 leydig 細胞和4種類型的管周肌細胞，并確定了PRND為sertoli 細胞的新marker基因。Zhao等［42］通過分析豬體外成熟的第二次減數分裂中期（MII）卵母細胞、體外受精合子和孤雌生殖激活的單細胞胚胎scRNA-seq數據集來表征卵母細胞到受精卵轉化過程中的3′UTR（3′ untranslated region）動態變化，為進一步研究3′UTR調控該轉化過程的分子機制提供了有用的信息。

3.1.2 生長發育

Wiarda等［43］利用scRNA-seq技術分析了豬十二指腸、空腸和回腸的上皮細胞，鑒定出豬特有的腸內分泌（enteroendocrine， EE）細胞亞群，發現EE細胞中的激素編碼基因和腸細胞中的營養轉運基因的表達呈近端到遠端的梯度，證明了區域特化的存在。Cai等［44］通過整合豬肌肉分化scRNA-seq 和染色質開放性測序（assay for transposase accessible chromatin with high-throughput sequencing， ATAC-seq）數據，以單細胞分辨率分析了發育中的豬體節和肌節的基因表達和染色質可及性，構建了豬骨骼肌本體發育的分化軌跡，探究基因表達和染色質可及性的動態變化，找尋出豬胚胎肌肉生成的2個關鍵調控因子。Xu等［45］提供了豬肌肉駐留細胞全圖譜，并注釋出新型和品種特異性細胞，可視化在擬時序分析軌跡上，同時分析發現不同的駐留細胞特征會顯著影響不同肌肉細胞類型的配體-受體相互作用網絡，證明人工選擇引起了肌肉駐留細胞特征的顯著變化。

3.1.3 免疫與疾病研究

Zhang等［46］構建了3月齡豬肺部的單細胞圖譜，通過研究肺部細胞異質性，系統地比較了豬肺與人肺各細胞類型的細胞通訊和呼吸道病毒受體表達模式的異同，提出了豬-人免疫生物學不相容性和凝血失調相關的 10 個基因的細胞型表達模式，基于豬肺和人肺共享的主要細胞類型構建了5個保守的轉錄因子（transcription factor， TF）調控網絡，此成果為豬肺研究乃至異種器官移植提供了指導。Li等［47］生成并整合了人-豬外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells， PBMCs）scRNA-seq 數據，構建了豬外周血免疫細胞亞群的整體基因表達圖譜，明確了免疫細胞亞群的不同分布，并分析了人和豬免疫細胞的不同轉錄譜。非洲豬瘟是一種傳染性極強、致死率極高的疾病，Zheng等［48］通過scRNA-seq技術探究了感染非洲豬瘟病毒（African swine fever virus， ASFV）的原代豬肺泡巨噬細胞的轉錄組結構，發現ASFV 感染抑制了干擾素和未折疊蛋白反應（unfolded protein response， UPR）信號轉導，同時激活宿主細胞凋亡通路。Fan等［49］對感染豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus， PEDV）的仔豬空腸進行了系統分析，確定了豬腸細胞類型，并發現了一種新的marker基因 DNAH11，還研究了不同類型細胞被感染PEDV的反應。

3.2 在禽上的應用

3.2.1 配子發生

Sun等［50］基于scRNA-seq，描述了多種雞雄性生殖細胞中的全基因組可變剪切，繪制了雄性雞生殖系細胞中可變剪切在全基因組范圍的綜合圖譜，篩選出胚胎干細胞、性腺原始生殖細胞和精原干細胞可變剪切中的階段特異性基因，解讀了雞生殖細胞可變剪切的機制。Jung等［51］ 首次針對鳥類的跨物種單細胞轉錄組分析，評估了斑馬雀和雞的原始生殖細胞（primordial germ cells， PGCs）及其周圍細胞，構建了雞性腺 PGCs 的單細胞轉錄組圖譜，發現了性腺 PGCs 和體細胞中幾種信號通路的種間差異，揭示了在系統發育上相距甚遠物種之間生殖細胞發育的差異，為了解鳥類生殖細胞的生殖生理以及利用PGCs修復瀕危鳥類和生產轉基因鳥類提供了基礎，并確定了物種特異性特征。Choi等［52］利用生殖細胞追蹤模型和scRNA-seq確定了雞雄性生殖細胞在性別決定后發育過程中轉錄水平發生變化的信號通路，驗證了雄性生殖細胞進入有絲分裂停滯期和靜止期的信號通路互作情況。

3.2.2 生長發育

Li等［53］在雞孵化后5 d和100 d的發育階段進行scRNA-seq，相較于5 d的發育階段，100 d的細胞聚類更能顯示出清晰的邊界，首次描述了雞骨骼肌在兩個發育階段的異質性；同時在篩選出的上調基因中發現了APOA1和COL1A1基因與脂肪細胞marker基因ADIPOQ在胸部肌肉中共同表達，證明APOA1和COL1A1基因是雞肌肉內脂肪細胞的生物標記物。Mantri等［54］將scRNA-seq和空間轉錄組學與數據整合算法相結合，研究了雞心的四腔從早期到晚期階段的發育過程，確定了心外膜細胞系中上皮細胞和間充質細胞之間的轉錄差異，明確了先天性心臟病相關基因的空間分辨基因表達。

3.2.3 免疫與疾病研究

Wu等［55］利用scRNA-seq和基因編輯技術描述雞脾的傳統樹突狀細胞（conventional dendritic cells， cDCs）的特征，分析表明雞脾中只有1個表達趨化因子受體 XCR1 的 cDC 亞群，通過基因敲除方法，發現敲除 XCR1能阻止 cDC 與 CD8+ T 細胞的這種聚集，表明雞和哺乳動物XCR1+ cDCs 在驅動 CD8+ T 細胞反應中是保守的。Qu等［56］根據雞PBMCs進行scRNA-seq研究，確定了8個細胞群及其潛在的marker基因，發現T細胞群對感染禽白血病病毒 J 亞群（avian leukosis virus subgroup J， ALV-J）的反應更強，并使用擬時序分析，發現雞CD4+ T細胞可以分化為輔助T細胞1（T-helper 1， Th1）樣和輔助T細胞2（T-helper 2， Th2）樣細胞，ALV-J 感染激活的 CD4+ T 細胞可能傾向于分化成 Th1 樣細胞。Dai等［57］系統分析了分別感染 H5N1 高致病性禽流感病毒（highly pathogenic avian influenza virus， HPAIV）和 H9N2 低致病性禽流感病毒（low pathogenic avian influenza virus， LPAIV）的雞肺組織的轉錄組，揭示了雞感染 H5N1 和 H9N2禽流感病毒（avian influenza virus， AIV）后肺部組織中復雜而獨特的免疫反應圖譜，并破譯了 AIV 驅動雞炎癥反應的潛在機制。

3.3 在反芻動物上的應用

3.3.1 配子發生

高源［58］利用scRNA-seq技術對性成熟前后安格斯牛的睪丸進行研究，首次獲得了牛青春期轉錄細胞圖譜，通過聚類分析將睪丸生殖細胞聚為13個類群，分別鑒定出了每個細胞群特異表達的基因。Yang等［59］首次利用scRNA-seq技術對綿羊精子發生過程進行了全面的單細胞轉錄組研究，在睪丸細胞中鑒定了所有已知的生殖細胞和體細胞，以及一個意外含有白細胞的體細胞，并分析發現了生殖細胞的幾個階段特異性marker基因；功能富集分析表明，在睪丸生殖細胞中，細胞周期、配子發生、蛋白質加工和mRNA監控途徑的幾個通路顯著富集，而在睪丸體細胞中，核糖體通路顯著富集。Su等［60］分別分析了在新生兒時期、青春期和成年期階段湖羊睪丸細胞的組成以及3個影響精子發生的激素的表達變化，發現生殖細胞比例隨著年齡增長逐漸增加，sertoli細胞的比例逐漸減少，而leydig細胞的比例則先增加后減少；FSHR、LHR和AR主要在這三類細胞中表達，其中 LHR 和 FSHR 的表達隨年齡增長而減少，而 AR 的表達則先增加后減少。隨后，蘇杰［61］構建出湖羊睪丸發育圖譜，研究了出生后不同日齡湖羊睪丸生精細胞的X染色體劑量補償和雄性特異致死復合體（male specific lethal， MSL）在維持X染色體劑量的功能作用，并系統分析了湖羊出生后7個日齡的睪丸細胞組成變化、差異基因表達、信號通路變化及生殖細胞分化軌跡。Yu等［62］將關中奶山羊睪丸組織分離出11 753個單細胞進行轉錄組測序，聚類分出16個細胞群，包括6個體細胞群和10個生殖細胞亞群，還篩選并確定了在關中奶山羊精原細胞中表達的兩個特定基因： TKTL1和AES，為奶山羊育種研究提供理論和技術支持。Jia等［63］研究了胚胎和綿羊母體子宮內膜的動態轉錄變化，剖析了胚胎伸長過程中分化的17種細胞類型，根據特異性基因表達描述了不同滋養層細胞系的特征，分析子宮內膜衍生出13種細胞類型并對胚胎發育的分子反應做出闡述。

3.3.2 生長發育

Cai等［64］研究了妊娠期、哺乳期和成年期發育中的牛骨骼肌的細胞類型、分子特征、轉錄和表觀遺傳調控及模式，擬時序分析顯示骨骼肌三個發育階段發現的不同細胞亞群有明顯的排列順序，預測了單個細胞未來可能的轉錄狀態以及相鄰細胞之間的分化發育動態，試驗還整合了 scRNA-seq 和 scATAC-seq 結果，發現了一系列特異表達的TF，它們可能是促進牛骨骼肌發育過程中細胞命運轉換的候選因子。葉娜［65］構建了天祝白牦牛生長期毛囊的單細胞轉錄圖譜，鑒定了生長期毛囊發育過程中的主要細胞類型，通過擬時序分析繪制出表皮細胞譜系以及真皮細胞譜系在毛囊發育中的分化軌跡，為探究牦牛毛絨性狀的分子育種提供理論基礎。張衛東等［66］從單細胞水平分析了絨山羊毛囊發生過程中涉及的關鍵細胞轉錄信息，鑒定出多個絨山羊皮膚結構關鍵細胞類群和其他功能細胞類群，篩選出毛乳頭細胞特異性表達基因427個。劉澤昊［67］利用scRNA-seq技術首次建立了高精度的絨山羊初級毛囊與次級毛囊的單細胞轉錄組圖譜，并發現了不同發育階段毛囊干細胞的特征分子，基于擬時序分析揭示了絨山羊毛囊干細胞在發育過程中的分化軌跡，識別到毛囊干細胞在發育過程中存在3種分化狀態。葛偉［68］首先建立了從少量毛囊組織中分離毛囊干細胞的技術平臺，繪制了陜北白絨山羊毛囊發育過程中誘導階段、器官形成階段以及細胞分化階段的單細胞轉錄圖譜，并鑒定了陜北白絨山羊毛囊形態發生過程中所涉及的主要細胞類型，對其分子特征以及其分化調控關系進行了詳細描繪。Wang等［69］為探究綿羊毛囊發育和羊毛彎曲的分子機制分別制備了卷毛羔羊皮和直毛羔羊皮的單細胞懸液，鑒定出19個細胞類型及其特征，通過擬時序分析和細胞間通訊分析，揭示了基質祖細胞的分化軌跡和細胞間互作的信號通路，確定了綿羊毛彎曲的分子機制。He等［70］對呼倫貝爾草原短尾羊和烏珠穆沁羊16 d胚胎發育的細胞進行分群鑒定，分別獲得了8種和13種細胞類群，并建立了不同細胞群中差異基因的表達譜，通過功能富集分析揭示細胞類群中新發現的信號通路。而后何亭漪［71］發現在短尾羊發育過程中，有多信號通路共同協作調控尾部發育，其中間充質細胞向脊索細胞轉化是調控的重要過程。Yuan等［72］利用五萬多個單細胞轉錄組提供了綿羊瘤胃發育的全面轉錄圖譜，鑒定了8種主要細胞類型，明確了瘤胃早期乳頭形成和乳頭角質化的過程，并確定 TBX3 為潛在的marker基因，同時發現富集的棘層細胞在揮發性脂肪酸（volatile fatty acid， VFA）代謝和免疫反應中發揮了關鍵作用。Deng等［73］對綿羊和山羊的瘤胃組織展開了分析，明確了瘤胃細胞、瘤胃微生物和發育相關的核心轉錄調控網絡的過渡特征，綜合分析驗證了宿主細胞與微生物群互作的趨同發展模式，這種相互作用會調節瘤胃細胞中的基因表達，從而改變發酵、纖維消化和免疫防御等過程。

3.3.3 免疫與疾病研究

寇佳怡［74］首次描繪了完整的黃牛肺單細胞全轉錄圖譜，注釋出9個細胞大類、39個細胞類型，其中定義新細胞類型9個，篩選出347個差異表達基因并發現它們主要集中在免疫細胞中，同時發現9個潛在的新marker基因，豐富了牛肺的單細胞數據。Barut等［75］對奶牛腸系膜淋巴結（lymph nodes， LN）中的單核吞噬細胞進行了scRNA-seq，發現了10個樹突狀細胞（dendritic-cell， DC）集群和7個單核/巨噬細胞集群，定義了 LN 駐留亞群及其祖細胞，以及高度活化的遷移性樹突狀細胞亞群，還揭示了 cDC2 的潛在分化途徑，形成了一個炎性 cDC2 群，其轉錄與假定的 DC3 和單核細胞衍生 DC 非常相似。Huang等［76］構建了湖羊四腔胃的單細胞圖譜，發現免疫相關模塊中樞基因在四腔胃組織中的T細胞、單核細胞和巨噬細胞中高表達，確定了參與免疫調節的一些關鍵受體和信號傳導。

4 單細胞轉錄組測序技術的創新應用

scRNA-seq技術的快速革新使其在各個領域的探索中起到重要作用，與其他技術的結合可以挖掘出更加豐富的生物學信息。目前在人和小鼠上的應用更加前沿。杜源［77］利用scRNA-seq結合細胞示蹤技術，探究了肝細胞移植后狀態的變化和分區特征，更加明確了細胞再生肝的機制。Zeng等［78］利用空間翻譯組測序（ribosome-bound mRNA mapping， RIBOmap）方法，基于小鼠腦組織中 5 413 個基因繪制出包含119 173 個細胞的單細胞分辨率空間翻譯圖譜，從空間層面以單細胞分辨率系統地研究轉錄組水平的mRNA翻譯，揭示了細胞類型特異性和腦區特異性翻譯調控。Yi等［79］通過scRNA-seq聯合成像質譜分析（imaging mass spectrometry， IMS）揭示了活化的恒定自然殺傷T細胞（invariant natural killer T cells， iNKT）通過增加自然殺傷細胞（natural killer cell， NK）和 T 細胞免疫力以及減少腫瘤相關巨噬細胞在胰腺癌肝轉移中的保護功能。Wang等［80］分析單細胞轉錄組數據，結合免疫熒光/免疫組織化學染色、蛋白質組學和代謝組學分析等多組學方法和體外試驗探索中性粒細胞在胰腺導管腺癌中的異質性和促腫瘤機制。

越來越多的研究者將scRNA-seq技術應用于跨物種分析中。Li等［81］對小鼠、大鼠、豬、獼猴和人類回腸上皮單細胞轉錄組圖譜進行跨物種分析，揭示了物種之間的保守和差異細胞類型和功能，鑒定了豬、獼猴和人回腸中新的CA7細胞類型，揭示了腸細胞、腸內分泌細胞和paneth細胞中的獨特表達模式，并確定了保守和物種特異性的腸道干細胞marker基因；對跨物種藥物吸收的檢查表明，小鼠回腸中的藥物代謝更接近人類，而獼猴回腸中的藥物轉運與人類更相似。隨著跨不同物種的單細胞數據集快速生成，開發出能夠輕松探索和比較這些數據的新型軟件變得至關重要。這些軟件可以更深層次、多方面地挖掘這些單細胞圖譜數據，使研究人員能夠高效調查細胞類型、識別與他們自己的研究相關的標記，并比較不同數據集和物種之間的特征。

如今scRNA-seq技術已經十分熱門，世界各地的研究人員已經開發出許多新的計算方法和軟件工具來充分利用scRNA-seq數據集，研究人員需根據自身需求挑選當前可用的技術。Xu等［4］利用autoCell結合圖嵌入和概率深度高斯混合模型來推斷高維稀疏 scRNA-seq 數據的分布，驗證發現，在識別人類植入前胚胎的細胞發育軌跡方面，autoCell 的插值提高了現有工具的性能，為 scRNA-seq 數據的端到端分析提供了一個工具箱。Xiong等［82］針對scRNA-seq丟失數據的缺點提出了一種用于 scRNA-seq 數據估算的單細胞圖對比學習方法：scGCL（single-cell graph contrastive learning），并驗證了其在聚類性能和基因歸因方面優于現有的最先進的歸因方法。Wu等［83］提出了一種針對 scRNA-seq 數據的多視圖聚類與圖學習算法（supporting clustering with contrastive learning， MCGL），利用多視角學習從不同角度全面表征scRNA-seq數據，可以更好地描述細胞的拓撲關系，也能夠更好地提高細胞聚類性能。Liu等［7］設計了一個異構圖神經網絡模型 CAME，來學習比對完成且已知的細胞和基因嵌入，以便從 scRNA-seq 數據中進行跨物種細胞類型分配和基因模塊提取，發現兩個物種之間的共享特征和差異特征，對于基因組注釋不全的非模式動物也適用。Zappia等［84］開發了scRNA-tools 數據庫和網站（www.scRNA-tools.org），對目前已有的分析工具進行了總結，記錄了這些工具的下載出處、可用于哪些任務以及描述這些工具的工作方式，有利于幫助研究人員選擇所需的分析軟件（表1）。

5 總結與展望

諸多研究表明，轉錄組已經步入了單細胞測序時代。scRNA-seq技術在家豬、家禽和反芻動物的研究中已取得了一系列成果，為家養動物配子發生、生長發育和免疫疾病的分子機制研究提供了有力的工具。在配子發生角度，多項研究從生殖器官尤其是睪丸組織展開分析，鑒定出睪丸組織中的細胞類型，分析發現了生殖細胞的幾個階段特異性marker基因和分子標記物，并鑒定出生殖細胞發育軌跡。在生長發育角度，研究人員著手于對畜禽肌肉分化、胚胎及器官發育和營養轉運進行探究；對于毛用反芻動物，毛囊發生過程涉及的關鍵轉錄信息也被愈來愈多的科研人員所揭示。在免疫與疾病角度，通過研究病理細胞和健康細胞的異質性，揭示感染疾病后細胞的免疫反應圖譜，為動物育種和疾病防控提供了重要的參考。

scRNA-seq技術確實擁有解決細胞異質性的優點，卻較于傳統的 bulk RNA-seq 更為昂貴，且敏感細胞可能會因為解離過度而破碎，針對于此局限，可以通過反卷積的方法，將scRNA-seq數據作為參考（reference）反向鑒定bulk數據中的細胞類型。此外，scRNA-seq分析深度有限，無法找到具體的調控位點和調控元件，需要聯合其他組學共同挖掘。目前，單細胞測序技術在人的腫瘤、免疫、生殖等生物醫學領域得到了廣泛應用，而在畜牧學中的研究主要聚焦于動物繁殖性能、胚胎發育、解析關鍵性狀等方面，而在畜禽疫病以及產肉和繁殖等生產性狀的調控機制方面的應用還有待進一步研究和闡明深入。可以聯合空間轉錄組獲得細胞的空間位置信息和基因表達數據，揭示生產性狀相關細胞的發育層次結構，建立起細胞分化過程中的動態圖譜，為改良育種提供新的思路；也可以采用新算法研究RNA與RNA、RNA與蛋白的互作關系，繪制表觀基因組、轉錄組和翻譯組的空間多組學圖譜，綜合了解家畜和家禽的免疫應答機制，揭示特定細胞亞群在疾病抗性中的關鍵作用；還可以結合現代醫學技術，在畜禽模式動物中模擬疾病和器官發育［85］，為疾病治療在臨床應用中瓶頸的突破提供新想法。

參考文獻（References）：

［1］ 熊和麗，沙 茜，劉韶娜，等.單細胞轉錄組測序技術在動物上的應用研究［J］.生物技術通報，2022，38（3）：226-233.

XIONG H L，SHA Q，LIU S N，et al.Application of single-cell transcriptome sequencing in animals［J］.Biotechnology Bulletin，2022，38（3）：226-233.（in Chinese）

［2］ CHOE K，PAK U，PANG Y，et al.Advances and challenges in spatial transcriptomics for developmental biology［J］.Biomolecules， 2023，13（1）：156.

［3］ 李麗娟，師書玥，張村宇，等.單細胞轉錄組測序技術原理及其應用［J］.中國畜牧雜志，2019，55（2）：15-21.

LI L J，SHI S Y，ZHANG C Y，et al.Principle and application of single cell transceriptome sequencing［J］.Chinese Journal of Animal Science，2019，55（2）：15-21.（in Chinese）

［4］ XU J L，XU J L，MENG Y J，et al.Graph embedding and Gaussian mixture variational autoencoder network for end-to-end analysis of single-cell RNA sequencing data［J］.Cell Rep Methods，2023，3（1）：100382.

［5］ XU K，CHEONG C，VELDSMAN W P，et al.Accurate and interpretable gene expression imputation on scRNA-seq data using IGSimpute［J］.Brief Bioinform，2023，24（3）：bbad124.

［6］ TAN Z Y，CHEN X R，ZUO J M，et al.Comprehensive analysis of scRNA-Seq and bulk RNA-Seq reveals dynamic changes in the tumor immune microenvironment of bladder cancer and establishes a prognostic model［J］.J Transl Med，2023，21（1）：223.

［7］ LIU X Y，SHEN Q L，ZHANG S H.Cross-species cell-type assignment from single-cell RNA-seq data by a heterogeneous graph neural network［J］.Genome Res，2023，33（1）：96-111.

［8］ LU S，KELE"S.Debiased personalized gene coexpression networks for population-scale scRNA-seq data［J］.Genome Res，2023， 33（6）：932-947.

［9］ NAYDENOV D D，VASHUKOVA E S，BARBITOFF Y A，et al.Current status and prospects of the single-cell sequencing technologies for revealing the pathogenesis of pregnancy-associated disorders［J］.Genes （Basel），2023，14（3）：756.

［10］ LIU X Q，XU G，CHEN C S，et al.Evaluation of pulmonary single-cell identity specificity in scRNA-seq analysis［J］.Clin Transl Med，2022，12（12）：e1132.

［11］ FENG M，SWEVERS L，SUN J C.Hemocyte clusters defined by scRNA-Seq in Bombyx mori：in silico analysis of predicted marker genes and implications for potential functional roles［J］.Front Immunol，2022，13：852702.

［12］ LI X W，ZHANG Q，ZHU X C，et al.Standardization status of single-cell RNA sequencing technology in animal husbandry［J］. China Standardization，2023（1）：60-64.

［13］ TANG F C，BARBACIORU C，WANG Y Z，et al.mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell［J］.Nat Methods，2009， 6（5）：377-382.

［14］ GRINDBERG R V，YEE-GREENBAUM J L，MCCONNELL M J，et al.RNA-sequencing from single nuclei［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（49）：19802-19807.

［15］ 婁姬英，郭其新，畢瑜林，等.單細胞轉錄組測序技術及其在動物科學領域的應用［J］.農業生物技術學報，2023，31（5）：1074-1087.

LOU J Y，GUO Q X，BI Y L，et al.Single-cell transcriptome sequencing technology and its application in the field of animal science［J］.Journal of Agricultural Biotechnology，2023，31（5）：1074-1087.（in Chinese）

［16］ KOLODZIEJCZYK A A，KIM J K，SVENSSON V，et al.The technology and biology of single-cell RNA sequencing［J］.Mol Cell，2015，58（4）：610-620.

［17］ 康彥東，王興東，郭韶珂，等.單細胞測序技術及其在畜牧科學研究中的應用［J］.中國牛業科學，2022，48（4）：41-45.

KANG Y D，WANG X D，GUO S K，et al.Single-cell sequencing technology and its application in animal science research［J］.China Cattle Science，2022，48（4）：41-45.（in Chinese）

［18］ 易蘭蘭，賀德勇，許 宏，等.單細胞轉錄組測序技術在動物腸道中的應用研究進展［J］.飼料研究，2023，46（11）：159-163.

YI L L，HE D Y，XU H，et al.Study progress of application of single-cell transcriptome sequencing technology in animal intestine［J］. Feed Research，2023，46（11）：159-163.（in Chinese）

［19］ LI X L，GIBSON G，QIU P.Gene representation in scRNA-seq is correlated with common motifs at the 3′ end of transcripts［J］. Front Bioinform，2023，3：1120290.

［20］ NIE X E，QIN D，ZHOU X Y，et al.Clustering ensemble in scRNA-seq data analysis：methods，applications and challenges［J］. Comput Biol Med，2023，159：106939.

［21］ THURMAN A L，RATCLIFF J A，CHIMENTI M S，et al.Differential gene expression analysis for multi-subject single-cell RNA-sequencing studies with aggregateBioVar［J］.Bioinformatics，2021，37（19）：3243-3251.

［22］ KHOZYAINOVA A A，VALYAEVA A A，ARBATSKY M S，et al.Complex analysis of single-cell RNA sequencing data［J］.Biochemistry （Mosc），2023，88（2）：231-252.

［23］ 彭 巍，賈可欣，張子敬，等.單細胞測序技術及其在畜禽遺傳育種中的應用研究新進展［J］.中國畜牧雜志，2022，58（10）：44-49.

PENG W，JIA K X，ZHANG Z J，et al.New progress on single cell sequencing technology and its application to animal genetics and breeding［J］.Chinese Journal of Animal Science，2022，58（10）：44-49.（in Chinese）

［24］ SINGH A，HERMANN B P.Bulk and single-cell RNA-Seq analyses for studies of spermatogonia［M］∥OATLEY J M，HERMANN B P.Spermatogonial Stem Cells：Methods and Protocols.New York：Humana，2023：37-70.

［25］ KRIANOVIC＇ K，ECHCHIKI A，ROUX J，et al.Evaluation of tools for long read RNA-seq splice-aware alignment［J］. Bioinformatics， 2018，34（5）：748-754.

［26］ XU L，XUE T，DING W Y，et al.Comparison of scRNA-seq data analysis method combinations［J］.Brief Funct Genomics，2022， 21（6）：433-440.

［27］ STUART T，BUTLER A，HOFFMAN P，et al.Comprehensive integration of single-cell data［J］.Cell，2019，177（7）：1888-1902.e21.

［28］ LI X T，ZHANG S X，WONG K C.Deep embedded clustering with multiple objectives on scRNA-seq data［J］.Brief Bioinform， 2021，22（5）：bbab090.

［29］ CHOI Y H，KIM J K.Dissecting cellular heterogeneity using single-cell RNA sequencing［J］.Mol Cells，2019，42（3）：189-199.

［30］ GAO S.Data analysis in single-cell transcriptome sequencing［M］∥HUANG T.Computational Systems Biology：Methods and Protocols.New York：Humana，2018：311-326.

［31］ CHOUDHARY S，SATIJA R.Comparison and evaluation of statistical error models for scRNA-seq［J］.Genome Biol，2022， 23（1）：27.

［32］ DONG X R，BACHER R.Analysis of single-cell RNA-seq data［M］∥FRIDLEY B，WANG X F.Statistical Genomics.New York： Humana，2023：95-114.

［33］ BOULAND G A，MAHFOUZ A，REINDERS M J T.Consequences and opportunities arising due to sparser single-cell RNA-seq datasets［J］.Genome Biol，2023，24（1）：86.

［34］ YIP S H，SHAM P C，WANG J W.Evaluation of tools for highly variable gene discovery from single-cell RNA-seq data［J］.Brief Bioinform，2019，20（4）：1583-1589.

［35］ ZHANG S Q，XIE L J，CUI Y X，et al.Detecting fear-memory-related genes from neuronal scRNA-seq data by diverse distributions and Bhattacharyya distance［J］.Biomolecules，2022，12（8）：1130.

［36］ SUN Y T，QIU P.Domain adaptation for supervised integration of scRNA-seq data［J］.Commun Biol，2023，6（1）：274.

［37］ LU S，KELE S.Dozer：debiased personalized gene co-expression networks for population-scale scRNA-seq data［J］.bioRxiv，2023.

［38］ 雷佩佩.基于單細胞測序解析豬精原細胞的異質性［D］.楊凌：西北農林科技大學，2021.

LEI P P.The analysis of heterogeneity in porcine spermatogonia based on the single cell sequencing［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2021.（in Chinese）

［39］ ZHANG L K，LI F Y，LEI P P，et al.Single-cell RNA-sequencing reveals the dynamic process and novel markers in porcine spermatogenesis［J］.J Anim Sci Biotechnol，2021，12（1）：122.

［40］ 張發利，朱可心，葛 偉，等.豬與綿羊睪丸發育特征的單細胞轉錄組差異的比較分析［J］.豬業科學，2023，40（5）：106-109.

ZHANG F L，ZHU K X，GE W，et al.Comparative analysis of single-cell transcriptomic differences in testicular developmental characteristics between pigs and sheep［J］.Swine Industry Science，2023，40（5）：106-109.（in Chinese）

［41］ ZHANG L K，GUO M，LIU Z D，et al.Single-cell RNA-seq analysis of testicular somatic cell development in pigs［J］.J Genet Genomics，2022，49（11）：1016-1028.

［42］ ZHAO H，WU Z W，ZHANG R，et al.Dynamic changes of 3′UTR length during oocyte-to-zygote transition of in vitro pig embryos［J］.Reprod Domest Anim，2023，58（5）：605-613.

［43］ WIARDA J E，BECKER S R，SIVASANKARAN S K，et al.Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs［J］.J Anim Sci，2023，101（1）：skac318.

［44］ CAI S F，HU B，WANG X Y，et al.Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of myogenic differentiation in pig［J］.BMC Biol，2023，21（1）：19.

［45］ XU D D，WAN B Y，QIU K，et al.Single-cell RNA-sequencing provides insight into skeletal muscle evolution during the selection of muscle characteristics［J］.Adv Sci （Weinh），2023，10（35）：e2305080.

［46］ ZHANG L J，ZHU J C，WANG H Y，et al.A high-resolution cell atlas of the domestic pig lung and an online platform for exploring lung single-cell data［J］.J Genet Genomics，2021，48（5）：411-425.

［47］ LI J，XU Y N，ZHANG J Y，et al.Single-cell transcriptomic analysis reveals transcriptional and cell subpopulation differences between human and pig immune cells［J］.Genes Genomics，2024，46（3）：303-322.

［48］ ZHENG Y X，LI S，LI S H，et al.Transcriptome profiling in swine macrophages infected with African swine fever virus at single-cell resolution［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2022，119（19）：e2201288119.

［49］ FAN B C，ZHOU J Z，ZHAO Y X，et al.Identification of cell types and transcriptome landscapes of porcine epidemic diarrhea virus-infected porcine small intestine using single-cell RNA sequencing［J］.J Immunol，2023，210（3）：271-282.

［50］ SUN C H，JIN K，ZUO Q S，et al.Characterization of alternative splicing （AS） events during chicken （Gallus gallus） male germ-line stem cell differentiation with single-cell RNA-seq［J］.Animals （Basel），2021，11（5）：1469.

［51］ JUNG K M，SEO M，HAN J Y.Comparative single-cell transcriptomic analysis reveals differences in signaling pathways in gonadal primordial germ cells between chicken （Gallus gallus） and zebra finch （Taeniopygia guttata）［J］.Faseb J，2023，37（1）：e22706.

［52］ CHOI H J，JUNG K M，PARK K J，et al.Single-cell transcriptome analysis of male chicken germ cells reveals changes in signaling pathway-related gene expression profiles during mitotic arrest［J］.FEBS Open Bio，2023，13（5）：833-844.

［53］ LI J H，XING S Y，ZHAO G P，et al.Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing［J］.BMC Genomics，2020，21（1）：752.

［54］ MANTRI M，SCUDERI G J，ABEDINI-NASSAB R，et al.Spatiotemporal single-cell RNA sequencing of developing chicken hearts identifies interplay between cellular differentiation and morphogenesis［J］.Nat Commun，2021，12（1）：1771.

［55］ WU Z G，SHIH B，MACDONALD J，et al.Development and function of chicken XCR1+ conventional dendritic cells［J］.Front Immunol，2023，14：1273661.

［56］ QU X Y，LI X B，LI Z W，et al.Chicken peripheral blood mononuclear cells response to avian leukosis virus subgroup J infection assessed by single-cell RNA sequencing［J］.Front Microbiol，2022，13：800618.

［57］ DAI M M，ZHU S F，AN Z H，et al.Dissection of key factors correlating with H5N1 avian influenza virus driven inflammatory lung injury of chicken identified by single-cell analysis［J］.PLoS Pathog，2023，19（10）：e1011685.

［58］ 高 源.安格斯牛睪丸組織非編碼RNA鑒定及單細胞轉錄圖譜繪制［D］.楊凌：西北農林科技大學，2021.

GAO Y.Non-coding RNA identification and single-cell transcriptome atlas of angus bull testis［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2021.（in Chinese）

［59］ YANG H，MA J Y，WAN Z，et al.Characterization of sheep spermatogenesis through single-cell RNA sequencing［J］.Faseb J，2021， 35（2）：e21187.

［60］ SU J，SONG Y L，YANG Y Y，et al.Study on the changes of LHR，FSHR and AR with the development of testis cells in Hu sheep［J］.Anim Reprod Sci，2023，256：107306.

［61］ 蘇 杰.出生后湖羊睪丸發育圖譜、組織結構及X染色體劑量補償研究［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2022.

SU J.Studies on testis development atlas，structure and X-chromosome dose compensation after Hu sheep birth［D］.Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2022.（in Chinese）

［62］ YU X W，LI T T，DU X M，et al.Single-cell RNA sequencing reveals atlas of dairy goat testis cells［J］.Zool Res，2021，42（4）：401-405.

［63］ JIA G X，MA W J，WU Z B，et al.Single-cell transcriptomic characterization of sheep conceptus elongation and implantation［J］. Cell Rep，2023，42（8）：112860.

［64］ CAI C C，WAN P，WANG H，et al.Transcriptional and open chromatin analysis of bovine skeletal muscle development by single-cell sequencing［J］.Cell Prolif，2023，56（9）：e13430.

［65］ 葉 娜.基于單細胞轉錄組測序對天祝白牦牛生長期毛囊轉錄圖譜的構建［D］.蘭州：西北民族大學，2021.

YE N.Construction of transcription map of hair follicles in growing period of Tianzhu white yak based on single cell transcriptome sequencing［D］.Lanzhou：Northwest Minzu University，2021.（in Chinese）

［66］ 張衛東，鄭玉杰，葛 偉，等.單細胞測序對絨山羊毛乳頭細胞的鑒定［J］.中國農業科學，2022，55（12）：2436-2446.

ZHANG W D，ZHENG Y J，GE W，et al.Identification of cashmere dermal papilla cells based on single-cell RNA sequencing technology［J］.Scientia Agricultura Sinica，2022，55（12）：2436-2446.（in Chinese）

［67］ 劉澤昊.單細胞測序解析遼寧絨山羊初級與次級毛囊的轉錄組圖譜與分子特征［D］.沈陽：沈陽農業大學，2022.

LIU Z H.Single-cell sequencing reveals that transcriptome map and molecular features of primary and secondary hair follicles in Liaoning cashmere goats［D］.Shenyang：Shenyang Agricultural University，2022.（in Chinese）

［68］ 葛 偉.單細胞分辨率解析絨山羊及小鼠毛囊發生的轉錄調控機制［D］.楊凌：西北農林科技大學，2019.

GE W.Dissecting the transcriptional regulatory mechanism underlying cashmere goat and murine hair follicle morphogenesis at single-cell resolution［D］.Yangling：Northwest Aamp;F University，2019.（in Chinese）

［69］ WANG S H，WU T Y，SUN J Y，et al.Single-cell transcriptomics reveals the molecular anatomy of sheep hair follicle heterogeneity and wool curvature［J］.Front Cell Dev Biol，2021，9：800157.

［70］ HE T Y，GUO W R，YANG G，et al.A single-cell atlas of an early mongolian sheep embryo［J］.Vet Sci，2023，10（9）：543.

［71］ 何亭漪.單細胞轉錄組測序分析呼倫貝爾草原短尾羊和烏珠穆沁羊16天胚胎的基因表達差異［D］.呼和浩特：內蒙古農業大學，2021.

HE T Y.Single-cell transcriptome sequencing analyses the gene expression differences in 16-day embryos of HulunBuir short-tailed sheep and Ujumqin sheep［D］.Hohhot：Inner Mongolia Agricultural University，2021.（in Chinese）

［72］ YUAN Y，SUN D M，QIN T，et al.Single-cell transcriptomic landscape of the sheep rumen provides insights into physiological programming development and adaptation of digestive strategies［J］.Zool Res，2022，43（4）：634-647.

［73］ DENG J，LIU Y J，WEI W T，et al.Single-cell transcriptome and metagenome profiling reveals the genetic basis of rumen functions and convergent developmental patterns in ruminants［J］.Genome Res，2023，33（10）：1690-1707.

［74］ 寇佳怡.黃牛肺臟單細胞轉錄圖譜的構建及初步分析［D］.成都：西南民族大學，2022.

KOU J Y.Construction and preliminary analysis of single cell transcriptional map in the lung of cattle［D］.Chengdu：Southwest Minzu University，2022.（in Chinese）

［75］ BARUT G T，KREUZER M，BRUGGMANN R，et al.Single-cell transcriptomics reveals striking heterogeneity and functional organization of dendritic and monocytic cells in the bovine mesenteric lymph node［J］.Front Immunol，2022，13：1099357.

［76］ HUANG K L，YANG B，XU Z B，et al.The early life immune dynamics and cellular drivers at single-cell resolution in lamb forestomachs and abomasum［J］.J Anim Sci Biotechnol，2023，14（1）：130.

［77］ 杜 源.單細胞組學聯合細胞示蹤技術探究細胞移植再生肝臟的機制［D］.南昌：南昌大學，2023.

DU Y.Unveiling the mechanisms of liver regeneration by hepatocyte transplantation using cell tracing and single-cell RNA sequencing［D］.Nanchang：Nanchang University，2023.（in Chinese）

［78］ ZENG H，HUANG J H，REN J Y，et al.Spatially resolved single-cell translatomics at molecular resolution［J］.Science，2023， 380（6652）：eadd3067.

［79］ YI Q J，WANG J，LIU T T，et al.scRNA-Seq and imaging mass cytometry analyses unveil iNKT cells-mediated anti-tumor immunity in pancreatic cancer liver metastasis［J］.Cancer Lett，2023，561：216149.

［80］ WANG L W，LIU Y H，DAI Y T，et al.Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment［J］.Gut，2023，72（5）：958-971.

［81］ LI H N，WANG X D，WANG Y L，et al.Cross-species single-cell transcriptomic analysis reveals divergence of cell composition and functions in mammalian ileum epithelium［J］.Cell Regen，2022，11（1）：19.

［82］ XIONG Z H，LUO J W，SHI W W，et al.scGCL：an imputation method for scRNA-seq data based ongraph contrastive learning［J］. Bioinformatics，2023，39（3）：btad098.

［83］ WU W M，ZHANG W S，HOU W M，et al.Multi-view clustering with graph learning for scRNA-Seq data［J］.IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform，2023，20（6）：3535-3546.

［84］ ZAPPIA L，PHIPSON B，OSHLACK A.Exploring the single-cell RNA-seq analysis landscape with the scRNA-tools database［J］. PLoS Comput Biol，2018，14（6）：e1006245.

［85］ 汪浩浩，陳慶杰，劉清華，等.單細胞RNA測序技術及其在醫學研究中的應用［J］.醫學研究雜志，2023：1-7.

WANG H H，CHEN Q J，LIU Q H，et al.Single-cell RNA sequencing technology and its application in medical research［J］.Journal of Medical Research，2023：1-7.（in Chinese）

（編輯 郭云雁）