鴨短喙與侏儒綜合征病毒分離與鑒定

摘 要： 山東某櫻桃谷鴨場出現以患鴨短喙、長舌、生長不良為主要特征的疾病，疑似感染鴨短喙與侏儒綜合征病毒（duckling short beak and dwarfism syndrome virus ， SBDSV）。本研究旨在分離鑒定該病毒，并檢測其對櫻桃谷鴨的致病性。首先，通過臨床癥狀、病理變化、病料PCR檢測，確定感染鴨短喙侏儒綜合征病毒。其次，用SPF鴨胚分離培養病毒后，對病毒進行電鏡觀察和同源性與系統發育樹分析，再檢測病毒尿囊液EID50。最后，動物回歸試驗中，給2日齡櫻桃谷鴨口服病毒感染鴨胚尿囊液，觀察致病特點，以及用PCR和間接免疫熒光試驗檢測病毒分布。結果顯示：SPF鴨胚接毒后96～120 h鴨胚死亡，電鏡觀察病毒粒子大小為20～50 nm，尿囊液 EID50為10-4.85·0.2 mL-1。尿囊液PCR檢測SBDSV為陽性，證明從鴨胚中成功分離培養SBDSV。該病例主要臨床表現短喙和體重降低，感染后2周內持續排毒，VP2片段與鴨短喙侏儒綜合征病毒序列的相似性為99.8%，表明是由鴨短喙與侏儒綜合征病毒感染引起，命名為SBDS-SD株。動物回歸試驗中，出現短喙、腹瀉、體重顯著降低等與自然病例相似的臨床癥狀。本試驗成功分離到一株鴨短喙與侏儒綜合征病毒，并驗證其對櫻桃谷鴨具有致病性，為該病的進一步研究提供基礎。

關鍵詞： 鴨短喙與侏儒綜合征；致病性試驗；病毒增殖培養；電鏡觀察

中圖分類號： S852.659.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3623-08

收稿日期：2023-09-04

基金項目：在青高校服務青島重點學科（獸醫）（025-1219002）

作者簡介：孫雨點（1998-），女，山東棗莊人，碩士生，主要從事動物疫病診斷與防治研究，E-mail： 577954259@qq.com；宋紫玥（1998-），女，河北保定人，在讀碩士生，主要從事動物疫病診斷與防治研究，E-mail：13463244973@163.com。孫雨點和宋紫玥為同等貢獻作者

通信作者：楊瑞梅，主要從事動物疫病診斷與防治研究，E-mail：yrm.cc@163.com

Isolation and ldentification of Duckling Short Beak and Dwarfism Syndrome Virus

SUN" Yudian， SONG" Ziyue， ZHANG" Hongliang， QIN" Zhihua， SHAN" Hu， YANG" Ruimei*

（College of Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University， Qingdao 266109， China）

Abstract：" A disease characterized by short beak， long tongue， and poor growth was observed in a cherry valley duck farm in Shandong， suspected to be infected with short beak and dwarfism syndrome virus （SBDSV）. This study aimed to isolate and identify the virus， and to test its pathogenicity to cherry valley ducks. First， the infection of short beak and dwarfism syndrome virus was confirmed by clinical symptoms， pathological changes， and PCR detection of the diseased materials. Second， after isolating and culturing the virus in SPF duck embryos， it was observed by electron microscopy and analyzed by homology and phylogenetic tree， and then the EID50 of the virus allantoic fluid was tested. Finally， in the animal reversion test， 2-day-old cherry valley ducks were orally administered with allantoic fluid， and the pathogenic characteristics were observed， as well as the virus distribution was detected by PCR and indirect immunofluorescence assay. The results showed that SPF duck embryos died at 96-120 hours post-inoculation， and virus particles of 20-50 nm in size were observed by electron microscopy. The allantoic fluid had an EID50 of 10-4.85·0.2 mL-1. The allantoic fluid was positive for SBDSV by PCR， confirming the successful isolation and cultivation of SBDSV from duck embryos. The main clinical manifestations of this case were short beak and weight loss. The virus was shed continuously for two weeks after infection. The VP2 fragment had a 99.8% similarity with the sequence of duck short beak and dwarfism syndrome virus， indicating that it was caused by the infection of this virus， which was named SBDS-SD strain. In the animal challenge experiment， clinical symptoms similar to those of the natural case， such as short beak， diarrhea and significant weight loss， were observed. This experiment successfully isolated a strain of short beak and dwarfism syndrome virus and verified its pathogenicity to cherry valley ducks， providing a basis for further research on this disease.

Key words： duck short beak and dwarf syndrome; pathogenicity test; virus proliferation culture; electron microscope observation

*Corresponding author：" YANG Ruimei， E-mail：yrm.cc@163.com

鴨短喙與侏儒綜合征（duckling short beak and dwarfism syndrome， SBDS），也稱鴨短嘴矮小綜合征、鴨長舌病、鴨短嘴病、鴨大舌病等，該病毒于2015年初開始在我國福建、四川、江蘇、山東等地區櫻桃谷鴨及半番鴨中流行，對肉鴨養殖業產生較大影響。該病毒與鵝細小病毒有較高同源性，主要感染1月齡以內的雛鴨，發病率達10%～30%，以軟腳、腹瀉、短喙、體重降低、舌頭外露、嚴重生長障礙、易骨折及羽毛發育不良為主要臨床特征，僵鴨率達80%以上，直接導致養殖鴨品質差、產量驟降，目前尚無有效的疫苗，給養鴨業造成嚴重的經濟損失［1-4］。

本研究將疑似鴨短喙與侏儒綜合征的病料進行鑒定，通過接種SPF鴨胚分離鑒定該病原，對2日齡櫻桃谷肉鴨進行致病性試驗。旨在為侏儒綜合征病毒（duckling short beak and dwarfism syndrome virus ， SBDSV）的流行病學、臨床診斷、發生發展和防治提供可靠的資料。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

病料來自山東某地市發病櫻桃谷鴨場；SPF鴨胚購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所；櫻桃谷鴨胚購自江蘇圣安養殖場；2日齡櫻桃谷鴨由本實驗室孵化；兔多克隆抗體由本實驗室制備并保存；DNA提取試劑盒、DL1000 DNA Marker、Ex Taq DNA 聚合酶等購自寶日醫生物技術（北京）有限公司；青-鏈霉素雙抗、柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自上海生工生物技術有限公司。

1.2 病料樣品處理

無菌采集發病鴨肝、脾組織，剪碎勻漿后按照1∶4的比例加入滅菌0.9%生理鹽水。于-80℃冰箱反復凍融3次后，12 000 r·min-1離心15 min，取上清加入青鏈霉素雙抗，置4℃過夜作用［5-6］。

1.3 病料樣品PCR檢測

取“1.2”中上清液200 μL用總DNA試劑盒按照說明書提取核酸。根據NCBI上公布的基因序列（GenBank No. KU844283.1）設計并合成特異性引物，以樣品DNA為模板進行PCR擴增。上游引物為5′-GAGCATCAACTCCCGTATGTCC-3′，下游引物為5′-CTACTTCCTGCTCGTCCGTGA-3′，擴增片段長度為661 bp。PCR反應體系25 μL：ddH2O 8.5 μL，Ex Taq DNA聚合酶12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL。PCR擴增條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸40s， 30個循環；72 ℃延伸5 min。對PCR產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

使用本實驗室保存的鴨呼腸孤病毒（DRV）、鴨星狀病毒（DASTV）、鴨圓環病毒（DUCV）、禽流感病毒（AIV）、禽腺病毒（FADV）上下游引物，進行PCR檢測，排除感染其他鴨常見疫病。

1.4 病毒分離與培養

將“1.2”中濾液以尿囊腔途徑接種11日齡SPF鴨胚，0.2 mL·胚-1，同時使用滅菌生理鹽水接種作為陰性對照，置于孵化器中孵育，每日觀察死亡情況，棄去接種后24 h內死亡鴨胚，將24 h后死亡鴨胚置于4℃過夜，無菌收取鴨胚尿囊液，并取少量尿囊液進行無菌檢驗，-80℃冷凍保存。

1.5 測序與分析

對“1.3”中PCR產物進行測序，并將基因序列與GenBank中的GPV與MDPV參考株進行同源性比對，利用DNAMAN軟件構建系統進化樹，分析分離株的遺傳變異情況。

1.6 病毒純化與電鏡觀察

利用超速離心法純化病毒，將收集的尿囊液低速離心后，取上清液，用超速冷凍離心機離心，將沉淀重懸于0.01mol·L-1 PBS中，于-80℃中保存，取20 μL用于透射電鏡觀察［1］。

1.7 鴨胚尿囊液EID50

無菌條件下取SPF鴨胚尿囊液分別按不同的稀釋度（10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8）接種9日齡健康鴨胚，0.2 mL·枚-1，每個梯度接種6枚，同時設置接種滅菌生理鹽水對照組，棄去接種后24 h內因外界因素干擾致死的鴨胚，收取接種后120 h的鴨胚尿囊液，PCR檢測其感染情況，從胚體大小、全身出血情況等方面與對照組比較，根據Reed-Muench法計算分離毒的EID50［6］。

1.8 鴨短喙與侏儒綜合征病毒對櫻桃谷鴨的致病性試驗

1.8.1 臨床癥狀觀察

將24只2日齡健康櫻桃谷鴨平均分為攻毒組和對照組。攻毒組每只口服EID50為10-4.85·0.2 mL-1的病毒尿囊液0.5 mL，對照組口服滅菌生理鹽水0.5 mL，分開飼養，連續觀察35 d。攻毒后，每天上、下午觀察臨床癥狀，采集攻毒后第3、5、7天的泄殖腔拭子與咽拭子。于攻毒后第14、21、35天對每只試驗鴨測喙長，稱體重。

體重及喙長數據以“平均值±標準差（x-±s）”表示，統計分析采用SPSS軟件通過ANOVA、Least significance difference（LSD）方法進行計算。當0.01＜P＜0.05時，存在統計學差異，當P＜0.01，統計學差異極顯著［1-2，7］。

1.8.2 發病死亡鴨組織間接免疫熒光檢測

將待檢發病鴨組織無菌新鮮切面在載玻片上輕壓獲得樣本，樣本自然干燥。使用10%甲醛固定樣本15 min，將樣本完全浸入PBS中洗滌3次，每次5 min。將固定好的玻片標本置于濕盒中，加入本實驗室制備的兔多克隆抗體（1∶50），置于37℃溫箱中孵育30 min，洗滌3次，加入FITC標記IgG山羊抗兔抗體（含0.01% EVS blue），避光置于37℃溫箱中孵育30 min，洗滌3次，滴1滴80%甘油緩沖液，蓋玻片封片，熒光顯微鏡鏡檢［8-9］。

1.8.3 組織病理切片觀察

取發病鴨心、肝、脾、腎組織， 用4%多聚甲醛固定， 常規進行石蠟切片、HE染色并進行鏡檢。

2 結 果

2.1 PCR檢測結果

采用PCR方法檢測組織樣品濾液、經SPF鴨胚培養的病毒尿囊液、未攻毒的鴨胚尿囊液，再使用DRV、DASTV、DUCV、AIV、FADV的引物檢測是否存在其他病毒，結果表明該病料感染且僅感染鴨短喙與侏儒綜合征病毒（圖略）。

2.2 病毒繁殖及EID50測定

將陽性尿囊液接種到11日齡SPF鴨胚中，孵化收胚并收集尿囊液。結果顯示，攻毒后，病毒在鴨胚內增繁殖，主要集中在96～120 h導致鴨胚死亡，死亡胚體嚴重出血，尿囊液清亮，明顯生長不良，相對于正常鴨胚體積小一半，鴨胚尿囊膜水腫增厚。

根據Reed-Muench法計算繁殖病毒尿囊液EID50，鴨短喙與侏儒綜合征病毒的EID50為10-4.85·0.2 mL-1。

2.3 同源性及進化樹分析結果

將分離得到的SBDS-SD株病毒部分序列與GenBank中記載的國內外的5個鵝細小病毒株序列及7個番鴨細小病毒株序列進行比對，結果顯示，本研究分離的SBDS-SD病毒株與經典鵝細小病毒株（U25749）的核苷酸與氨基酸序列相似性分別為95.9%和88.5%，與經典番鴨細小病毒株（U22967）的核苷酸與氨基酸序列相似性分別為78.1%和46.7%，由此推測，本研究中從在櫻桃谷鴨中分離得到的毒株是從鵝細小病毒變異進化而來。

根據遺傳進化分析可見，本研究分離株SBDS-SD株與在同一分支SBDS-GPV-M15株（KU844283.1）聚于同一小分支內，親緣關系最近，綜合相似性判斷，SBDS-SD株與SBDS-GPV-M15株可能起源于同株病毒（圖1）。

2.4 病毒的電鏡觀察結果

在透射電鏡下觀察到直徑約20 nm，球形無囊膜病毒粒子，具有典型細小病毒的形態特征。

2.5 鴨短喙與侏儒綜合征病毒對櫻桃谷鴨的致病性試驗

2.5.1 臨床試驗結果

對照組櫻桃谷鴨精神狀態、采食和生長發育均正常。攻毒后第3、5、7天的咽拭子、肛拭子、死亡鴨脾組織PCR檢測均為陽性。

攻毒組于攻毒后第7天陸續出現足底出血，無法站立、腿部外翻（圖2d～f）等臨床癥狀，并隨日齡增加逐漸加重，表現為不同程度精神差，羽毛蓬松，聚堆、厭食、喜臥，病鴨排灰白色稀便，第9天出現第1例短喙特征（圖2a），第20天后，攻毒組與對照組鴨體型差距顯著增大（圖2g），判定攻毒組鴨出現生長不良、僵鴨，出現明顯的舌頭外露，喙整體變短（圖2b、c）等癥狀。

據統計，1月齡內攻毒后出現死亡（5/12），喜臥軟腳（8/12），喙變短至變形（4/12），舌頭外露即長舌鴨（4/12），體重顯著降低（Plt;0.05或Plt;0.01），表明生長發育受阻（10/12，表1），呈僵鴨或殘鴨，羽毛生長不良或斷翅，1月齡后，主要表現為僵鴨、生長不良和短喙，其發病率約80%，死亡率約40%。患鴨體重較健康鴨平均下降30%～40%，嚴重者相較于正常鴨體重減少50%～60%。

2.5.2 發病死亡鴨組織間接免疫熒光結果

對攻毒鴨肝脾組織觸片進行IFA檢測，結果顯示，在熒光顯微鏡下觀察可見到不同程度的亮綠色熒光病灶（圖3），表明該死亡鴨感染鴨短喙與侏儒綜合征病毒。

2.5.3 病鴨組織病理學變化

眼觀病理變化：外觀上，出現明顯喙變短，體型小，脛骨外翻；剖檢病死鴨，其肝、脾、腎有少量出血點，無其他明顯病理變化；攻毒后20d內病死鴨，腸黏膜輕度脫落變薄，附帶黏液、少量出血點，無其他顯著病變。

肝組織（圖4a），肝細胞發生細胞腫脹（黑色箭頭），胞質疏松淡染，可見少量肝細胞脂肪變性（紅色箭頭），胞質中可見大小不一的圓形空泡；少量靜脈血管淤血。脾組織（圖4b），白髓淋巴細胞數量較少；紅髓包括靜脈竇和含有網狀細胞、巨噬細胞、淋巴細胞和紅細胞的網狀脾索，無明顯異常。腎組織（圖4c）中可見少量腎小管上皮細胞細胞腫脹（黑色箭頭），胞質疏松淡染；腎小球未見明顯異常，未見明顯的炎性細胞浸潤。心肌組織（圖4d）中可見心肌間質收縮（黑色箭頭），胞質疏松淡染，未見明顯炎癥。

3 討 論

該短喙與侏儒病例在國外已有報道，最初由鵝細小病毒引起小鵝瘟，主要感染鵝與番鴨，病毒的變異致使半番鴨感染出現短喙、生長不良、僵鴨等癥狀。1971年，法國西南部曾發生出現該病例，經血清學診斷后判定由GPV引發，但未進行病原分離與致病性研究［10］。匈牙利病例中，分離出該病原為GPV，臨床剖檢半番鴨病變不明顯，組織病理學觀察可見輕度心肌炎及脾網狀內皮增生［11］。1989年，我國臺灣地區分離1株鴨源鵝細小病毒，2008年，在漳州等地區出現了由NGPV引起短喙與矮小特征傳染病，從2015年開始，我國福建省、山東省、安徽省、江蘇省、浙江省、河南省等鴨養殖業密集地區陸續出現相似癥狀，現已分離出多株病毒。肖世峰等［12］對SBDS-GPV-M15 株進行致病性研究，首次明確了該病毒對櫻桃谷鴨也具有強致病性。伴隨著新型疫病的出現，以及水禽類其他病毒病混合感染，僅僅依靠物理消毒保護，并不能達到理想的養殖效果，目前，暫無較好的預防保護生物制品，對鴨養殖業產生較大影響。

鴨胚培養是常用的病毒培養方式之一，由于鴨胚胎組織分化程度低，且為同一物種，病毒易于在其內增殖，并且感染的鴨胚組織中病毒含量高，易于收集，SPF鴨胚來源充足、操作簡單，短時間內能獲得大量的病毒液，在培養鴨源病毒具有重要意義［13］。本實驗室分離毒株在SPF鴨胚上進行增殖特性研究，表明該病毒可在鴨胚上穩定傳代增殖，導致鴨胚尿囊膜增厚，胚體變小、出血，輕度水腫，攻毒后約96～120 h可致胚體死亡，有較強的規律性。該病毒可以在鴨胚上得到成功復制，這為獲得高純度的病毒以及該病免疫預防的深入研究奠定了基礎。

通過人工攻毒試驗，櫻桃谷鴨發病情況與自然感染情況一致。該病毒對鴨體重及喙長有嚴重影響，并且會在感染后持續排毒，前期導致腹瀉、無法站立、足底出血、精神沉郁，1月齡以內死亡率約40%，隨著日齡的增長，鴨喙逐漸變短導致舌頭外露，病鴨體重差異顯著，約80%生長發育受阻，成為僵鴨，預計適齡出欄鴨體重比健康鴨體重平均減少1 kg左右（按照10元·kg-1計算，不包括淘汰鴨的損失，出欄鴨每只凈收入減少10元）［14］，致使養殖場嚴重經濟損失。收集第3代病毒尿囊液，測定其EID50為10-4.85·0.2 mL-1，該病原與小鵝瘟病毒同源性較高，但并不出現典型小鵝瘟腸病變，在生產實踐中該病毒感染日齡越小的雛鴨后期的癥狀越顯著，剖檢后，眼觀無顯著器官組織病理變化，對發病鴨組織切片染色觀察，發現心、肝、腎組織有輕度出血及細胞水腫。

序列分析是分析病毒之間親緣關系最可靠的方法，對克隆到的 DNA 片段進行序列分析，將該毒株序列與GenBank發表的參考毒株基因序列比對，可知該毒株與中國范圍內鵝細小病毒株的核苷酸序列相似性為93.6%～99.8%之間，氨基酸序列相似性為83.4%～99.5%之間，其中，SBDS-SD株的與SBDS-GPV-M15 株（KU844283.1）的核苷酸序列相似性為99.8%，與 SBDS-GPV-M15 株的氨基酸相似性為99.5%，與該福建分離株相似性最高。但SBDS-SD株與歐洲GPV分離株（GQ457906）相似性較低，或與地理差異有關。

4 結 論

本試驗使用SPF鴨胚擴繁病毒，成功從發病鴨場的病料中分離一株鴨短喙與侏儒綜合征病毒，并得到穩定毒力的病毒尿囊液，進化樹分析顯示該病毒與SBDS-GPV-M15株可能有共同的起源。該病毒可導致鴨胚死亡，胚體生長不良，2日齡櫻桃谷鴨能表現出典型短喙、體重顯著減輕、生長障礙等臨床癥狀，驗證了其對鴨胚、2日齡櫻桃谷鴨有較強致病性，本研究為鴨短喙與侏儒綜合征病毒的防控技術提供借鑒，也為今后多種鴨病的混合感染研究奠定基礎。

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（編輯 白永平）