mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞增殖和凋亡的影響

摘 要： 旨在研究馬立克病病毒（Marek′s disease virus， MDV）編碼的mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞增殖和凋亡的影響，將mdv1-miR-M4-5p模擬物、抑制物及其陰性對照轉染MDCC-MSB1細胞后48 h，采用實時熒光定量PCR （qRT-PCR）檢測細胞中mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2以及caspase-9、caspase-3、cyt-c、cyclinD1、Bcl-2等增殖和凋亡相關分子的轉錄；CCK-8檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞周期和凋亡。結果顯示：與對照組相比，mdv1-miR-M4-5p模擬物轉染顯著上調MDCC-MSB1細胞中mdv1-miR-M4-5p、cyclinD1、Bcl-2的轉錄水平，下調TGF-β1、Smad2、cyt-c、caspase-9和caspase-3的表達轉錄，促進細胞的增殖，減少G1期細胞，增加S和G2細胞，降低細胞凋亡率。與對照組相比，mdv1-miR-M4-5p抑制物轉染后MDCC-MSB1細胞的增殖、凋亡及其相關分子轉錄的結果與mdv1-miR-M4-5p模擬物轉染后的結果相反。綜上，Mdv1-miR-M4-5p可促進MDCC-MSB1細胞增殖，抑制其凋亡，這可能是通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路來實現的。

關鍵詞： mdv1-miR-M4-5p；MDV；增殖；凋亡；TGF-β1/Smad2

中圖分類號：S858.31;Q255;Q279

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）08-3678-10

收稿日期：2023-11-08

基金項目：國家自然科學基金（U1504308;31702207）；河南省科技研發計劃聯合基金資助項目（232103810029）；河南科技大學省部級科技創新平臺培育項目（2015SPT004）

作者簡介：余祖華（1977-）女，河南商城人，副教授，博士，主要從事動物疫病病原與分子免疫學研究，E-mail： yzhd05@163.com

通信作者：丁 軻，主要從事動物傳染病與微生態研究，E-mail： keding19@163.com

Effects of mdv1-miR-M4-5p Encoded by MDV on Proliferation and Apoptosis of MDCC-

MSB1 Cells

YU" Zuhua1，2， GAO" Mengru1，2， HEnbsp; Lei1，2， WEI" Ying1，2， CHEN" Jian1，2， CHEN" Songbiao1，2，

DING" Ke1，2，3*

（1.Laboratory of Functional Microbiology and Animal Health/The Key Laboratory of Animal Disease and Public Health， College of Animal Science and Technology，" Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023，" China; 2.Luoyang Key Laboratory

of Live Carrier Biomaterial and Animal Disease Prevention and Control， Luoyang 471023，" China;

3.College of Animal Science and Technology，

Henan UniversityInstitute of Science and Technology， Luoyang

471023Xinxiang 453003，" China）

Abstract：" The purpose of this experiment was to study the effects of mdv1-miR-M4-5p analog encoded by Marek′s disease virus （MDV） on proliferation and apoptosis of MDCC-MSB1 cells. In this study， mdv1-miR-M4-5p mimics， inhibitors and their negative controls were transfected into MSB1 cells for 48 h. Real-time quantitative fluorescent PCR （qRT-PCR） was used to detect the transcription of mdv1-miR-M4-5p， TGF-β1， Smad2 signaling molecules， caspase-9， caspase-3， cyt-c， cyclinD1， Bcl-2 et al other molecules related to proliferation and apoptosis in MDCC-MSB1 cells. Cell proliferation was detected by CCK-8 and cell cycle and apoptosis were detected by flow cytometry. The results showed that compared with the control group， the transcription levels of mdv1-miR-M4-5p， cyclinD1 and Bcl-2 in MDCC-MSB1 cells transfected with mdv1-miR-M4-5p mimics was significantly up-regulated. The transcription of TGF-β1， Smad2， cyt-c， caspase-9 and caspase-3 was down-regulated， the proliferation of MDCC-MSB1 cells was promoted， the the number of G1 phase cells were decreased， the S and G2 cells were increased， and the apoptosis rate was decreased. Compared with the control group， the results of the proliferation and apoptosis of MDCC-MSB1 cells and the expression of related molecules transfected with mdv1-miR-M4-5p inhibitor were opposite to those transfected with mdv1-miR-M4-5p mimics. The results showed that Mdv1-miR-M4-5p could promote the proliferation and inhibit the apoptosis of MDCC-MSB1 cells. This may be conducted by inhibiting the TGF-β1/Smad2 signaling pathway.

Key words： mdv1-miR-M4-5p; MDV; proliferation; apoptosis; TGF-β1/ Smad2

*Corresponding author：" DING Ke， E-mail： keding19@163.com

MicroRNAs （miRNAs）是一類保守的非編碼小RNA，大小為22～25 nt，它通過靶向腫瘤啟動子或抑制基因在腫瘤的發生和發展中發揮重要地調控作用，目前已成為近年來重要的研究熱點之一［1-3］，且病毒編碼的miRNAs在疾病和腫瘤發生過程中具有重要的調控功能［4-7］。

MiR-155是宿主編碼的具有多種功能的miRNA，它在維持細胞增殖、抵抗細胞死亡、誘導血管生成、促進腫瘤侵襲和遷移等方面發揮重要的調控作用，是一種與多種腫瘤密切相關的miRNA［8-11］。馬立克病（Marek′s disease， MD）是由馬立克病病毒（Marek′s disease virus， MDV）感染引起的一種以雞T淋巴細胞增生為主要特征的高度傳染性免疫抑制病與腫瘤病［12］。MDV1編碼的mdv1-miR-M4和由卡波西肉瘤相關皰疹病毒（Kaposi sarcoma-associated herpes virus，KSHV）編碼的Mir-K12-11都是miR-155的功能性類似物。研究表明，mdv1-miR-M4-5p在MDV感染的雞胚成纖維細胞、MDV誘導的腫瘤組織、MDV轉化的腫瘤細胞系和血清外泌體中表達上調［13-14］，在病毒感染潛伏期、溶細胞期和淋巴瘤轉化期間具有典型的表達模式［15］。缺失不同毒力MDV毒株的mdv1-miR-M4后，MDV的致瘤活性喪失或顯著降低［16-17］。近年來，研究者對許多mdv1-miR-M4-5p靶基因及其調控機制進行研究和論證。如Zhao等［18］報道mdv1-miR-M4-5p可能通過負調控PU.1、CEBPβ、HIVEP2、BCL2L13、PDCD6等宿主基因導致惡性細胞轉化。Chi等［19］通過TargetScan 和 RNAhybrid兩種生物信息學軟件對mdv1-miR-M4-5p 可能調控的宿主靶基因進行預測，并通過驗證發現潛伏TGF-β結合蛋白1 （Latent TGF-β-binding protein 1，LTBP1）是mdv1-miR-M4-5p的重要靶基因，mdv1-miR-M4-5p可通過靶向下調LTBP1的表達而顯著降低TGF-β1的分泌。TGF-β1是細胞或組織中TGF-β家族中最豐富、最有效的因子，它調節細胞生物學特性的各個方面，包括細胞增殖、遷移、黏附、存活、分化和浸潤［20-23］。Smads蛋白家族是TGF-β1信號的關鍵下游信號分子。一旦TGF-β1被激活，下游的Smad2和/或Smad3被磷酸化，與Smad4形成轉錄復合物。該復合物在細胞核中積累，并在細胞核中傳遞TGF-β1信號以調節轉錄。多項研究表明TGF-β1/Smad2 信號通路參與腫瘤的發生過程［24-27］。FethiLouafi等［28］研究發現miR-155可抑制Smad2蛋白的表達及其磷酸化水平，進而影響TGF-β通路調控的下游基因的表達。Chi等［19］通過雞TGF-β/BMP Signaling Pathway PCR Array等試驗驗證在MDV感染過程中，mdv1-miR-M4-5p可以抑制TGF-β通路的信號傳遞，促進細胞增殖。但mdv1-miR-M4-5p抑制LTBP1、TGF-β1的表達是否繼續影響Smad2的表達以及mdv1-miR-M4-5p對腫瘤細胞增殖、凋亡及其關鍵分子表達的影響還需明確。因此，本研究在馬立克病病毒轉化的腫瘤細胞系MDCC-MSB1細胞中過表達和抑制表達mdv1-miR-M4-5p的基礎上，檢測mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞增殖和凋亡的影響，同時檢測對TGF-β1、Smad2以及細胞增殖和凋亡過程中的關鍵分子表達轉錄的影響，為探究mdv1-miR-M4-5p在MDV致瘤中的調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑

MDCC-MSB1細胞為本實驗室凍存。RPMI 1640培養基、青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；胰蛋白胨磷酸肉湯（TPB）和RNase、Propidium Iodide購自Sigma公司；轉染試劑Lipo8000TM轉染試劑購自中國碧云天生物技術有限公司; TRIzol RNA提取試劑購自Ambion公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit、TB Green Premix Ex TaqTM II、CCK-8檢測試劑盒等購自TaKaRa公司; 自Sigma公司；AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司；6孔細胞板、96孔細胞板、25 cm2細胞瓶、離心管等購自廣州潔特生物過濾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 mdv1-miR-M4-5p模擬物、抑制物的合成

根據miRBase數據庫中mdv1-miR-M4-5p成熟體序列委托廣州銳博生物科技有限公司合成mdv1-miR-M4-5p模擬物（mimic）、抑制物（inhibitor）及其陰性對照（mimic NC、inhibitor NC）。

1.2.2 熒光定量引物的設計與合成

參考文獻［11］方法設計mdv1-miR-M4-5p和U6的頸環熒光定量PCR擴增引物。采用Primer 5.0軟件設計TGF-β1/Smad2信號分子、細胞增殖和凋亡過程中的關鍵分子的熒光定量PCR引物（表1）。設計的引物送通用生物（安徽）股份有限公司合成。

1.2.3 細胞培養和轉染

用含有10%FBS、1%青霉素-鏈霉素溶液和10% TPB的 RPMI1640 培養基重懸MDCC-MSB1細胞，置于37℃、5% CO2飽和濕度條件下培養。按照5×105·孔-1的細胞量將處于對數生長期、生長狀態良好的MDCC-MSB1細胞加入6孔細胞培養板，37℃、5％CO2培養箱中培養過夜。試驗分為4組，分別為mdv1-miR-M4-5p mimic組、mdv1-miR-M4-5p mimic NC組、mdv1-miR-M4-5p inhibitor組和mdv1-miR-M4-5p inhibitor NC組。按照Lipo8000TM轉染試劑操作說明進行轉染，于轉染后48 h收獲各組細胞進行相關檢測。

1.2.4 RNA的提取和Real-time PCR

使用TRIzol試劑提取細胞總RNA，經Nanodrop-1000核酸蛋白測定儀測定總RNA的濃度和純度后，用PrimeScriptTM RT reagent Kit進行逆轉錄。然后用表1中的特異性的熒光定量PCR引物和TB Green Premix Ex TaqTM II對mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2、cyclinD1、caspase-3、caspase-9、Bcl-2和cyt-c進行qRT-PCR。循環參數：50 ℃ 2 min， 95 ℃ 3 min， 95 ℃ 30 s， 60 ℃ 30 s，循環40次。分別以U6和GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法分析試驗數據，比較各轉染組細胞中基因相對表達量的差異。

1.2.5 CCK-8檢測

按照CCK-8檢測試劑盒檢測說明進行檢測。將轉染處理后的各組MDCC-MSB1細胞，分別按照4 000個細胞·孔-1的密度接種到96孔板中，每組設3個重復孔，同時設空白對照組（僅加細胞培養基）。分別在轉染后0、24、48、72 h，于每孔加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后用酶標儀在450 nm波長測定光密度（OD），統計分析并繪制細胞生長曲線。

1.2.6 細胞周期測定

在轉染48 h后，收集各組細胞沉淀，用冷PBS潤洗2次后，加入100 μL PBS重新懸浮細胞，再緩慢加入700 μL預冷的80%乙醇后，在4℃固定4 h；1 500 r·min-1離心5 min，細胞沉淀用冷PBS潤洗2次，加入200 μL PBS重懸細胞，加入10 μL RNase（1 mg·mL-1），37℃孵育30min；然后加入10 μL PI（400 μg·mL-1）4℃下避光染色30 min，用流式細胞儀檢測分析。

1.2.7 AnnexinV-APC/7-AAD染色

采用annexin-apc/7-AAD染色和流式細胞儀檢測MDCC-MSB1細胞的凋亡情況。轉染48 h后收集各組細胞，用冷PBS潤洗2次，1 200 r·min-1離心5min后使用AnnexinV-APC/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒的說明進行染色。用500 μL Binding Buffer重懸細胞，加入5μL AnnexinV-APC和5μL 7-AAD后在室溫下避光孵育15 min。用流式細胞儀檢測分析，計算早期和晚期凋亡細胞的百分比。

1.2.8 統計分析

用SPSS 19.0和GraphPad Prism （Version 6.0）軟件進行數據統計分析。試驗數據以“x-±s”表示。兩組間顯著性比較采用學生t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析和LSD檢驗。*. Plt;0.05，代表數據差異顯著，**. Plt;0.01代表數據差異極顯著。

2 結 果

2.1 實時熒光定量PCR檢測結果

將mdv1-miR-M4-5p模擬物、mdv1-miR-M4-5p抑制物及其陰性對照轉染MDCC-MSB1細胞后48 h，通過實時熒光定量PCR檢測mdv1-miR-M4-5p、TGF-β1、Smad2、caspase-3、caspase-9、cyclinD1、Bcl-2、cyt-c的相對轉錄水平。如圖1所示，與陰性對照（NC）相比，轉染mdv1-miR-M4-5p mimic后，mdv1-miR-M4-5p的轉錄水平極其顯著升高（Plt;0.01），TGF-β1、Smad2、caspase-3、caspase-9和cyt-c的轉錄均顯著降低（Plt;0.01），cyclinD1和Bcl-2的轉錄顯著升高（Plt;0.01）。轉染mdv1-miR-M4-5p inhibitor后，mdv1-miR-M4-5p的轉錄水平極顯著下降（Plt;0.01），TGF-β1、Smad2、caspase-3、caspase-9和cyt-c的轉錄均顯著升高（Plt;0.01），cyclinD1和Bcl-2的轉錄顯著降低（Plt;0.01）。

2.2 Mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞增殖的影響

為了確定mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞增殖的影響，采用CCK-8檢測各轉染的細胞增殖情況。如圖2所示，在轉染后24～72 h，與陰性對照（NC）相比，轉染mdv1-miR-M4-5p mimic后，MDCC-MSB1細胞的增殖能力顯著增強（Plt;0.01），轉染mdv1-miR-M4-5p inhibitor后，MDCC-MSB1細胞的增殖能力極顯著降低（Plt;0.01）。

2.3 Mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞周期的影響

為了檢測mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞周期的影響，采用流式細胞術分析細胞周期分布。如圖3所示，與陰性對照（NC）相比，轉染mdv1-miR-M4-5p mimic的MDCC-MSB1細胞G1期和G2期細胞比例顯著降低（Plt;0.05），S期細胞比例顯著增加（Plt;0.05）。而轉染mdv1-miR-M4-5p inhibitor的MDCC-MSB1細胞G1期細胞比例顯著增加（Plt;0.05），G2期細胞比例顯著降低（Plt;0.05），S期細胞比例差異不顯著（P＞0.05）。

2.4 Mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞凋亡的影響

為了評估mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞凋亡的影響，采用流式細胞儀檢測各組MDCC-MSB1細胞的凋亡百分比。如圖4所示，與陰性對照（NC）相比，轉染mdv1-miR-M4-5p mimic的細胞的凋亡細胞比例差異不顯著（Pgt;0.05），而轉染mdv1-miR-M4-5p inhibitor的細胞的凋亡細胞的比例顯著升高（Plt;0.01）。

3 討 論

在腫瘤疾病中某些miRNAs表達量呈現減少、缺失或顯著提高，表明miRNAs在腫瘤發生過程中扮演著重要的角色。miR-155在多種疾病的發生、發展中發揮重要的調節作用［29-30］，可引發B細胞白血病和淋巴瘤［31］。HSV、KSHV和EBV等病毒miRNA可以通過靶向前凋亡基因抑制細胞凋亡［32-34］。MDV病毒編碼Mdv1-miR-M4-5p與miR-155具有保守的種子序列，是miR-155的同功分子，在MDV誘導的淋巴瘤中起重要作用［16-17］。

Chi等［19］研究表明，miR-M4-5p通過靶向抑制LTBP1的表達，導致TGF-β1的分泌和激活顯著降低，從而抑制TGF-β信號傳導，最終激活宿主癌基因c-Myc的過表達。然而，mdv1-miR-M4-5p是否影響細胞增殖和凋亡以及抑制TGF-β1后是否抑制Smad2還需要試驗驗證。

在本研究中，作者通過將mdv1-miR-M4-5p模擬物和抑制物轉染MDCC-MSB1細胞，在調控mdv1-miR-M4-5p的表達水平的基礎上來檢測mdv1-miR-M4-5p對MDCC-MSB1細胞增殖、凋亡的影響，同時分析了TGF-β1、Smad2和細胞增殖和凋亡相關標志物的表達變化。CCK-8和細胞周期檢測結果顯示，mdv1-miR-M4-5p過表達后，MDCC-MSB1細胞的增殖能力極顯著增強；且處于分裂期的細胞比例顯著升高，而抑制mdv1-miR-M4-5p的表達后細胞的增殖能力極顯著降低，且處于分裂期的細胞比例顯著降低。CyclinDl蛋白與細胞周期密切相關，在細胞增殖調控中起關鍵作用［35-36］。在本研究中，過表達mdv1-miR-M4-5p可引起cyclinD1轉錄上調，抑制mdv1-miR-M4-5p表達可引起cyclinD1轉錄上調，這表明mdv1-miR-M4-5p表達的變化會影響MDCC-MSB1細胞的增殖和細胞周期，mdv1-miR-M4-5p可能通過調控Cyclin D1的表達促進MDCC-MSB1細胞的增殖和細胞周期進程。通過細胞凋亡檢測結果可以看出，雖然mdv1-miR-M4-5p過表達后細胞的凋亡率無顯著性變化，但mdv1-miR-M4-5p抑制表達后細胞的凋亡率增加極顯著，表明mdv1-miR-M4-5p可抑制MDCC-MSB1細胞凋亡。Bcl2是細胞凋亡的抑制劑，作為最重要的抗凋亡因子，其高表達可以阻止cyt-c的釋放，并有效抑制caspase-9和caspase-3的激活，防止細胞凋亡［37］。在本研究中，mdv1-miR-M4-5p過表達上調了Bcl-2的轉錄，下調了cyt-c、caspase-9、caspase-3的轉錄，相反，mdv1-miR-M4-5p的抑制表達引起Bcl-2轉錄的下調，cyt-c、caspase-9、caspase-3轉錄的上調。在前期研究中，作者發現雞TGF-β1可抑制MDCC-MSB1細胞增殖、遷移與侵襲，促進其凋亡［38］，而在本研究中，過表達mdv1-miR-M4-5p可引起TGF-β1和Smad2轉錄的下調，而抑制mdv1-miR-M4-5p的表達引起TGF-β1和Smad2轉錄的上調，這表明mdv1-miR-M4-5p可抑制TGF-β1、Smad2的轉錄。結合Chi等［19］研究表明，mdv1-miR-M4-5p靶向下調LTBP1表達后，抑制TGF-β1、Smad2信號分子的表達，影響細胞的增殖和凋亡。

4 結 論

本研究結果表明，mdv1-miR-M4-5p可促進MDCC-MSB1細胞的增殖，抑制其凋亡，同時調節增殖、凋亡相關基因的表達，抑制TGF-β1/Smad2信號通路可能是其作用機制。

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（編輯 白永平）