高脂飲食誘導胰島素抵抗過程中肝臟能量代謝特征的研究

摘 要： 本研究旨在通過建立胰島素抵抗全過程的小鼠模型，研究在這個過程中，肝內線粒體功能和能量代謝的變化情況。試驗選取60只雄性C57BL6小鼠，隨機選取30只飼喂普通維持飼料作為對照組（Con組），另外30只飼喂高脂飼料作為高脂飲食組（HFD組）進行造模，分別于飼喂的第4、6、8、10和12周，各組隨機選取6只小鼠進行處理，經胰島素抵抗評估和病理組織學檢查確認成功建立胰島素抵抗全過程的模型。在第8和12周，采集鼠尾血液，進行葡萄糖耐受試驗（glucose tolerance tests， IGTT）和胰島素耐受試驗（insulin tolerance tests，ITTs）。在第4、6、8、10和12周，采集小鼠的血清和肝組織樣品進行試驗：1）檢測空腹血糖和血清含量；2）ELISA法檢測肝組織中的Srebp-1c酶、PFK1 和COX-Ⅰ含量；3）生化檢測血清中的ALT和AST含量；4）Western blot法檢測肝組織中的PI3K、Akt、P-Akt、GLUT4、GSK-3β、P-GSK-3β、FOXO1、P-FOXO1、SIRT1、AMPK、P-AMPK、PGC-1α蛋白表達量；5）采用透射電鏡、HE染色、油紅O染色、PAS染色檢測肝病理組織和結構的變化。結果表明：1）12周的高脂日糧引起小鼠肥胖、HOMA-IR增加，油紅O染色顯示，明顯的脂肪沉積，成功誘導小鼠胰島素抵抗全過程模型；2）胰島素抵抗過程中，小鼠ALT和AST增加，HE結果顯示，明顯的脂滴空泡、肝細胞結構紊亂；3）在飼喂高脂日糧的第4周之后，肝胰島素上游信號開始受到影響；4）與Con-6組相比，HFD-6組小鼠肝內的GLUT4蛋白表達量和P-FOXO1/FOXO1比值、PFK1含量顯著下降（P＜0.01）；與Con-4組相比，HFD-4組小鼠肝內的GSK-3β磷酸化、Srebp-1c酶水平逐漸降低（P＜0.05）；PAS結果顯示從第8周開始，HFD組小鼠肝細胞內糖原含量減少；5）與Con-4組相比，HFD-4組小鼠肝的AMPK、P-AMPK、SIRT1含量顯著降低（P＜0.01和P＜0.001）；6）HFD組小鼠肝中Mfn2在第10周出現上升，Drp1蛋白的表達呈現先降低后升高的趨勢；7）與HFD-6組相比，HFD-6組小鼠肝中的PINK1和Parkin蛋白明顯下降（P＜0.05）。綜上表明，肝作為代謝的主要器官，在飼喂60%高脂飼料后，會發生選擇性胰島素抵抗，在抵抗后整體上能量分解代謝減弱、線粒體損傷增強，而清除損傷線粒體的自噬功能卻減弱，另外在第8、10周時出現了短暫的線粒體生物發生與融合增強現象，說明由于肝能量缺乏導致了短暫的代償作用。本研究從發生全過程的角度闡釋肝胰島素抵抗中的能量代謝特征和規律，為進一步深入研究營養過剩影響細胞能量代謝的機制提供參考。

關鍵詞： 高脂飲食（HFD）；胰島素抵抗；肝；線粒體；能量代謝；小鼠

中圖分類號： S856. 5

文獻標志碼：A 文章編號： 0366-6964（2024）09-4172-14

Study on the Characteristics of Liver Energy Metabolism during the Induction of Insulin Resistance by High Fat Diet

WANG" Jingxuan， DAI" Lizhi， WANG" Zhenyu， LIU" Ying， YU" Tong， YAN" Min， WANG" Ruilong， XIAO" Jianhua*

（Key Laboratory for Prevention and Control of Common Animal Diseases in General Higher

Education Institutions of Heilongjiang Province， College of Veterinary Medicine，

Northeast Agricultural University， Harbin 150030，" China）

Abstract：" The purpose of this study is to investigate the changes in mitochondrial function and energy metabolism in the liver during the entire process of insulin resistance by establishing a mouse model. A total of 60 male C57BL6 mice were randomly selected and divided into three groups： a control group （Con group） fed with normal maintenance feed; a high-fat diet group （HFD group） fed with high-fat feed. The model was established by randomly selecting six mice from each group at weeks 4， 6， 8， 10， and 12 of feeding. The successful establishment of the whole-process model of insulin resistance was confirmed by insulin resistance assessment and histopathological examination. At the 8th and 12th weeks of the experiment， blood was collected from the tail of the mice for IGTT and ITTs. At weeks 4， 6， 8， 10， and 12 of the experiment， serum and liver tissue samples were collected from the mice for testing： 1） fasting blood glucose and serum content were measured; 2） The contents of Srebp-1c enzyme， PFK "and COX-I in liver tissues were detected by ELISA. 3） Biochemical detection of ALT and AST levels in serum; 4） Western blot was used to detect expression level of PI3K， Akt， P-Akt， GLUT4， GSK-3β， P-GSK-3 β， FOXO "P-FOXO "SIRT "AMPK， P-AMPK， and PGC-1 α protein in liver tissue; 5） Transmission electron microscopy， HE staining， oil red O staining， and PAS staining were used to detect changes in the pathological organization and structure of the liver. The results showed that： 1） 12 weeks of high-fat diet caused obesity and increased HOMA-IR in mice， and oil red O staining showed significant fat deposition， successfully inducing a model of insulin resistance in the entire mouse. During insulin resistance， the levels of ALT and AST in mice increased， and HE results showed significant lipid droplet vacuoles and structural disorder of liver cells. 3） After the fourth week of feeding a high-fat diet， the upstream signaling of insulin in the liver began to be affected; Compared with the Con-6 group， the expression of GLUT4 protein and the ratio of P-FOXO1/FOXO1 as well as the content of PFK1 in the liver of HFD-6 group mice significantly decreased （Plt;0.01）; Compared with the Con-4 group， the GSK-3β expression in the liver of the HFD-4 group mice Phosphorylation and Srebp-1c enzyme levels gradually decreased （Plt;0.05）; The PAS results showed that from the 8th week， the glycogen content in the liver cells of HFD mice decreased; Compared with the Con-4 group， the AMPK， P-AMPK， and SIRT1 contents in the liver of the HFD-4 group significantly decreased （Plt;0.01 and Plt;0.001）; 6） In the HFD group， the expression of Mfn2 in the liver increased at week 10， while the expression of Drp1 protein showed a trend of decrease first and then increase. Compared with the HFD-6 group， the PINK1 and Parkin proteins in the liver of the HFD-6 group mice decreased significantly （Plt;0.05）. In summary， the liver， as the main organ of metabolism， undergoes selective insulin resistance after feeding 60% high-fat feed. After resistance， overall energy catabolism decreases， mitochondrial damage increases， and autophagy， which clears damaged mitochondria， weakens. In addition， there is a brief increase in mitochondrial biogenesis and fusion at weeks 8 and 10， indicating a temporary compensatory effect due to energy deficiency in the liver. This study explains the characteristics and regularities of energy metabolism in hepatic insulin resistance from the perspective of the entire process， providing a reference for further studying the mechanism of excess nutrients affecting cellular energy metabolism.

Key words： high fat diet （HFD）; insulin resistance; liver; mitochondria; energy metabolism; mice

*Corresponding author： XIAO Jianhua，E-mail：Xiaojianhua@neau.edu.cn

現如今，隨著社會經濟的發展，寵物的生活方式和飲食結構也發生了重大變化［1］。高脂肪高糖飲食加上運動的減少，使得動物糖尿病病例逐年增多，引起了廣泛的關注［2］。

胰島素抵抗是組織細胞對胰島素的反應性和敏感性降低，使胰島素不能有效促進組織細胞對葡萄糖的吸收和利用［3］。隨著病程的延長，最終發展為糖尿?。?］。近年來，這類疾病的發病率逐年上升，嚴重影響動物的健康和生活質量，同時也給動物主人造成了很大的精神困擾和經濟負擔［4］。有調查表明，在我國6月齡至6歲的家養貓中，肥胖率超過了10%［5］。我國寵物犬的肥胖率高達約45%［6］。因此，由于攝入過多的能量所導致的動物患能量代謝性疾病，越來越受到研究人員的關注，研究犬、貓等動物胰島素抵抗的發病機制顯得尤為重要。

肝是胰島素作用的敏感組織，它負責調解機體能量平衡，控制能量的生成、儲存和消耗，在調節糖、脂及能量代謝、維持血糖血脂濃度方面發揮著重要的作用［7］。王侃侃［8］的研究表明，長期飼喂高脂日糧會影響肝的能量代謝。但目前，尚無研究表明在動物胰島素抵抗發生發展的過程中，肝的能量代謝是怎樣變化的。所以，本試驗通過飼喂高脂飼料建立C57BL6小鼠胰島素抵抗模型，對整個胰島素抵抗發生過程中相關信號通路和線粒體指標進行檢測，進而分析評價能量代謝的特征與變化趨勢，為研究肝胰島素抵抗發生過程、線粒體功能與能量代謝變化趨勢等提供一定的理論基礎和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 動物

60只4周齡的C57BL6雄性小鼠購自遼寧長生生物技術股份有限公司。動物合格證號SCXK（遼）2020-0001。購買當天即將全部小鼠進行分籠飼養，每籠一只（小鼠籠規格：290 mm×178 mm×160mm），飼養于東北農業大學臨床獸醫系動物飼養房［溫度（23±3）℃］。動物飼養及處理均遵循東北農業大學動物福利與倫理規范的要求。

1.1.2 主要試劑與器材

小鼠維持飼料購自遼寧長生生物技術有限公司，60%高脂飼料（D12492）購自常州鼠一鼠二生物科技有限公司。葡萄糖注射液購自辰欣藥業股份有限公司。小鼠胰島素ELISA試劑盒、小鼠SREBP-1c酶ELISA試劑盒、小鼠SREBP-1c酶ELISA試劑盒、小鼠PFK1酶ELISA試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。小鼠ATP含量測試盒購自南京建成生物工程研究所。辣根酶標記山羊抗小鼠 IgG、辣根酶標記山羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。PI3K、Akt、GLUT4、GSK-3β、FOXO1、Drp1抗體購自Cell Signaling Technology公司。P-Akt、P-AMPK、SIRT1、P-GSK-3β、P-FOXO1、PINK1、Parkin購自萬類生物技術公司。AMPK、PGC-1α、Mfn2購自Abcam貿易有限公司。

全自動WB化學發光成像系統（Tanon5200）購自上海天能科技有限公司。全自動生化分析儀（BS-280）購自南京貝登醫療股份有限公司。低溫高速離心機（H1-16KR）購自美國賽默飛世爾科技公司。病理顯微鏡（Eclipse Ts2R）購自尼康映像儀器銷售有限公司。4、-20℃冰箱購自青島海爾集團。紫外可見分光光度計購自天美科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與處理

適應性喂養1周后將小鼠隨機分為2組：對照組（Con，n=30，飼喂4%脂肪含量的飼料）和高脂飲食組（HFD，n=30，飼喂60%脂肪含量的飼料）。參照韋雪梅等［9］的造模方法，各組均自由采食、自由飲水。每組均設置4、6、8、10、12周5個檢測時間點。在5個檢測時間點的上午9：00，記錄體重（精確到0.1 g）。在第8和12周對2組小鼠進行葡萄糖耐受試驗（glucose tolerance tests， IGTTs），在IGTTs的3 d后，進行胰島素耐量試驗（insulin tolerance tests，ITTs），根據結果確認胰島素抵抗模型的成功建立。試驗周期為12周。

1.2.2 樣品采集

在飼喂的4、6、8、10和12周，應用眼球摘除法迅速采集小鼠血液，靜置30 min后3 000 r·min-1離心25 min，取上層血清于-80℃冰箱中保存備用。小鼠安樂死后，迅速采集肝組織，生理鹽水沖凈后濾紙吸干，稱取重量（g），將一部分肝組織放入-80℃保存，另一部分放入4%多聚甲醛溶液中固定。

1.3 IGTTs和ITTs

飼喂8和12周后，對2組小鼠進行IGTTs。均禁食12 h，腹腔注射50%葡萄糖（1g·kg-1）。鼠尾采血法獲取全血，分別于注射后0、15、30、60和120 min對各組小鼠的血糖值用血糖儀進行測定并記錄。0 min時即小鼠空腹血糖值（FBG， mmol·L-1）。

IGTTs后，小鼠恢復1 d。禁食12 h后，腹腔注射魚精蛋白生物合成胰島素注射液（0.5 U·kg-1），分別于注射后0、30、60、90、120 min測定并記錄血糖值，繪制ITTs曲線。

1.4 胰島素抵抗指數的評估

用ELISA試劑盒檢測小鼠空腹血清胰島素（FINs， μIU·mL-1）含量。

計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）評估胰島素抵抗的程度：

胰島素抵抗指數（HOMA-IR）=［空腹血糖（FBG） （mmol·L-1）×空腹血清胰島素（FINs） （μIU·mL-1）/22.5］

1.5 血清中ALT、AST含量的檢測

取出血清樣本，用全自動生化分析儀檢測2組小鼠血清ALT和AST的水平變化。

1.6 肝的病理組織學檢測

在飼喂的4、6、8、10和12周后，隨機選擇Con組和HFD組小鼠各6只，每只小鼠的肝組織取部分固定于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，另一部分于-80 ℃冷凍，石蠟切片和冰凍切片送東北農業大學大型儀器設備共享服務平臺進行制作。光學顯微鏡觀察肝組織結構的變化。

1.7 肝中ATP、線粒體呼吸鏈復合物（COX-Ⅰ）、Srebp1c和 PFK1含量的檢測

測定肝中ATP、線粒體呼吸鏈復合物（COX-Ⅰ）、Srebp1c和 PFK1的含量，具體步驟按照試劑盒說明書進行操作。

1.8 Western blot檢測相關蛋白表達

稱取0.1 g肝組織，加入1 mL裂解液（RIPA∶PMSF=99∶1）裂解組織，4 ℃12 000 r·min-1離心15 min，取上清，即為總蛋白。BCA方法測量組織蛋白濃度，規定蛋白濃度為3 μg·μL-1。蛋白上樣量為5 μL，經SDS-PAGE電泳后轉印于NC膜上，取出NC膜置于5%脫脂奶粉中封閉2h，加入一抗，4℃過夜（PI3K、Akt、GLUT4、GSK-3β、FOXO1、Drp1、AMPK、PGC-1α、Mfn2=1∶5 000稀釋；P-Akt、P-AMPK、SIRT1、P-GSK-3β、P-FOXO1、PINK1、Parkin=1∶200稀釋）。第2天洗膜后加入相應的山羊抗兔IgG二抗（1∶8 000）和山羊抗鼠IgG二抗（1∶8 000）室溫孵育2h。滴加ECL化學發光液，在全自動發光成像系統上曝光顯影，用Image J軟件進行條帶的灰度值分析，以β-tubulin為內參計算目的蛋白相對表達量。

1.9 數據統計與分析

所有數據均采用GraphPad Prism 8.0統計分析作圖，數值應用“±s”表示。以單因素方差分析法分析差異性，*.Plt;0.05表示明顯差異，**.Plt;0.01表示顯著差異，***.Plt;0.001表示極顯著差異，ns.Pgt;0.05表示無顯著差異。

2 結 果

2.1 胰島素抵抗模型的建立

各周Con組小鼠體型適中且穩步增長，HFD組小鼠體重大幅增加（圖1A）。在飼喂60%高脂飼料的第4周，HFD組小鼠的空腹血糖水平就顯著高于Con組小鼠（P＜0.01），并且HFD組的小鼠的空腹血糖水平隨著體重的增加而逐漸升高（圖1B）。與Con-4組相比，HFD-4組小鼠的空腹胰島素水平（FINs）明顯升高（Plt;0.05），并且在6、8、10和12周時，HFD組小鼠的FINs顯著高于各周的Con組小鼠（Plt;0.01）（圖1C）。將各組小鼠的FBG和FINs代入計算其HOMA-IR的公式中，結果顯示，從第4周開始，HFD組小鼠的HOMA-IR就極顯著高于Con組（Plt;0.001）（圖1D）。隨著高脂飼料飼喂的時間的延長，HFD組小鼠的HOMA-IR呈時間依賴性增加。IGTTs和ITTs的結果顯示，在注射葡萄糖（圖1E）和胰島素（圖1F）120 min后，飼喂高脂肪飲食12周的HFD組小鼠的血糖濃度仍高于喂食高脂肪食物8周的HFD組小鼠。

以上結果提示，飼喂12周高脂飼料引起小鼠肥胖、空腹血糖值和空腹胰島素含量居高不下、葡萄糖不耐受以及胰島素敏感性下降，說明成功誘導了穩定的小鼠胰島素抵抗模型。

2.2 高脂飲食會導致小鼠肝損傷

檢測各組小鼠肝功能指標ALT和AST的水平，結果發現，與Con組相比，HFD組小鼠的ALT含量從第6周開始明顯增加（Plt;0.05），并呈持續顯著增加趨勢（Plt;0.01和Plt;0.001）（圖1G）。各組小鼠肝組織中AST含量也顯示出相似的結果。在飼喂高脂飼料的第6周，與Con組相比，HFD組小鼠肝中的AST含量開始顯著增加（Plt;0.05），隨后增加趨勢更顯著（Plt;0.01和Plt;0.001）（圖1H）。

HE染色結果顯示，與Con組相比，在HFD-8、HFD-10和HFD-12組小鼠肝中，中央靜脈周圍的細胞內存在許多大小不等的脂滴空泡（圖2A紅色箭頭），肝小葉結構不清晰，肝細胞排列松散不規則（圖2A）。

以上結果提示，對小鼠飼喂6周的60%高脂飼料就會開始引起肝出現異常，在12周時已出現穩定的肝損傷狀態。再次印證了12周60%高脂飼料的飼喂，可以造成穩定的胰島素抵抗肝損傷模型。

2.3 高脂飲食影響小鼠肝胰島素途徑的上游信號傳導

與Con組相比，在飼喂高脂飼料的第4周，HFD組小鼠肝組織中PI3K的蛋白表達量就明顯降低（P＜0.05）。隨后，隨著高脂日糧飼喂時間的延長，PI3K表達量呈下降趨勢（圖3A）。HFD組小鼠肝組織中Akt的磷酸化水平在飼喂4周后開始有明顯變化，且逐漸降低。與HFD-4組相比，HFD-12組肝中的P-Akt/Akt比值極顯著下降（P＜0.001）（圖3B）。

2.4 高脂飲食影響小鼠肝胰島素途徑的下游葡萄糖代謝

GLUT4蛋白表達的結果顯示，從第6周開始，與Con組相比，HFD組小鼠肝中GLUT4含量開始顯著下降（P＜0.01）。與HFD-4組相比，HFD-6組小鼠肝中的GLUT4蛋白表達量顯著下降（Plt;0.01）。在飼喂高脂飼料的第12周，肝中的GLUT4含量達到最低水平，但與HFD-10組相比沒有顯著差異（Pgt;0.05）（圖3C）。

HFD組小鼠肝內GSK-3β磷酸化蛋白表達量，在飼喂高脂飼料的4周開始有明顯變化，GSK-3β磷酸化水平逐漸降低（P＜0.05）。在飼喂高脂飼料的12周中，HFD組小鼠肝中的P-GSK-3β/GSK-3β比率呈逐漸下降的趨勢（圖3D）。

PAS結果顯示，Con組小鼠肝細胞內紫色較深，糖原含量較多。HFD-8、HFD-10、HFD-12組小鼠肝細胞內紫色染色變淺，糖原含量較少（圖2C）。

FOXO1蛋白的表達結果顯示，在飼喂高脂飼料的第6周，HFD組小鼠肝中的P-FOXO1/FOXO1比值開始下降，且與第4周相比顯著下降（P＜0.01），并且在第10周比值下降到最低水平，第12與10周在統計學上無顯著差異（P＞0.05）（圖3E）。

HFD組小鼠肝中的PFK1含量在第6周，與Con-6組相比顯著下降（Plt;0.01），隨后出現時間依賴性下降（圖4B）。

以上結果提示，在胰島素抵抗發生的過程中，小鼠肝在不同時間上影響了糖代謝的各個方面。在第4周，糖原合成能力受到影響；在第6周，葡萄糖轉運、糖異生、糖酵解功能開始受到影響。說明長期的高脂飲食對肝糖代謝功能的影響不是同時發生的。

2.5 高脂飲食影響小鼠肝胰島素途徑的下游脂質代謝

在飼喂高脂飼料的第4周，與Con組相比，HFD組小鼠肝中Srebp-1c酶的含量明顯升高（Plt;0.05）。在第10周，HFD組小鼠肝Srebp-1c酶的含量達到最高，且與12周無顯著差異（P＞0.05）（圖4A）。

油紅O染色結果顯示，HFD組小鼠肝內脂肪堆積逐漸密集、嚴重，紅染面積范圍不斷擴大加深。鏡下可見，HFD-10和HFD-12組的小鼠肝內有大量的紅色脂肪滴，并伴有嚴重的脂質沉積，顯示出嚴重的脂肪肝（圖2D）。

結果表明，在高脂肪攝入導致的胰島素抵抗發生后，脂肪的合成能力逐漸增強，肝內脂肪的含量逐漸升高。

2.6 高脂飲食影響小鼠肝線粒體生物發生

肝透射電鏡結果顯示，Con組小鼠鏡下細胞核形狀較為規整，處于融合狀態的線粒體較多（圖2B）。HFD組小鼠肝細胞的細胞核形狀不規整，脂肪滴較多，且10、12周時肝細胞內線粒體處于分裂狀態較多（圖2B）。

在飼喂高脂飼料的第6周，HFD組小鼠肝ATP含量開始下降，下降程度與飼喂時間正相關（圖4C）。肝內COX-Ⅰ的下降趨勢與ATP相同（圖4D）。飼喂過程中，ATP與COX-Ⅰ的下降存在相關性，并與60%高脂日糧飼喂時間正相關（圖4E）。

在飼喂高脂飼料的過程中，AMPK和P-AMPK蛋白表達量，總體上呈現出下降的趨勢。在第4周，與Con組相比，HFD組小鼠肝內AMPK及其磷酸化水平的表達量就顯著下降（Plt;0.01）。有趣的是，與第4和8周相比，第6周HFD組小鼠肝的AMPK蛋白表達量均顯著降低（P＜0.01）；P-AMPK蛋白表達量也呈現出相同的趨勢（圖3G、圖3H）。

與Con-4組相比，HFD-4組小鼠肝SIRT1含量極顯著降低（Plt;0.001）。在6～10周，HFD組小鼠肝內的SIRT1蛋白表達量在統計學上無意義，保持低水平的穩態（P＞0.05）。在第12周，與HFD-10組相比，HFD組小鼠肝內的SIRT1蛋白表達顯著下降（P＜0.01）（圖3F）。PGC-1α的變化趨勢與SIRT1大體一致。值得注意的是，與HFD-8組相比，HFD-10組小鼠肝中PGC-1α蛋白的表達顯著增加（Plt;0.01）（圖3I）。

以上結果提示，在飼喂高脂飼料誘導的胰島素抵抗后，小鼠肝細胞內的能量相對缺乏，因此通過反饋調節激活AMPK/PGC-1α信號通路來促進線粒體的生物發生為機體供能，但隨著抵抗嚴重，這一機制似乎未能彌補胰島素抵抗的狀態，因此在第12周時，AMPK/PGC-1α信號的激活程度降低。

2.7 高脂飲食影響小鼠肝線粒體的融合、分裂和自噬

Mfn2蛋白結果表明，在飼喂高脂飼料的第4周，與Con組相比，HFD組小鼠肝內Mfn2蛋白就顯著下降（P＜0.01）。HFD組小鼠肝內的Mfn2蛋白表達總體看逐漸降低，但有趣的是，在第10周出現上升，且與第8和12周相比均顯著升高（P＜0.01）（圖5A）。

HFD組小鼠肝中Drp1蛋白的表達呈現先降低后增加的趨勢。在飼喂的第4和6周，與Con組相比，HFD組小鼠肝Drp1蛋白含量均下降（Plt;0.01和Plt;0.05）。但第8周時，Con組與HFD組小鼠肝內Drp1的蛋白表達量無顯著差異（P＞0.05）。與Con組和HFD-8組相比，在第10和12周，HFD組小鼠肝內Drp1蛋白表達量均極顯著增加（P＜0.001）（圖5B）。

在飼喂高脂飼料的第6周，HFD組小鼠肝中PINK1和Parkin蛋白表達開始下降，與HFD-4組相比有顯著差異（Plt;0.05）。第8、10周，兩蛋白穩定低表達，HFD組間無差異（P＞0.05）。至12周，與HFD-10組相比，PINK1和Parkin蛋白表達下降（P＜0.01和P＜0.05）（圖5C、5D）。相關性分析顯示，PINK1和Parkin蛋白的下降程度與高脂飼料飼喂時間正相關（圖5E）。

結果提示，在高脂飲食誘導的胰島素抵抗發生后，線粒體自身可能通過代償作用激活AMPK/PGC-1α信號通路，從而促進融合蛋白Mfn2的表達使線粒體供能，但隨著抵抗逐漸嚴重，這種代償最終失去作用。由于在胰島素抵抗后期，線粒體分裂增加，使得能夠正常發揮作用的線粒體數量大大降低，而此時小鼠肝內線粒體自噬逐漸下降，造成受損線粒體無法及時被清除，這又反過來影響線粒體的自噬活性，最終造成線粒體的代謝紊亂和功能障礙。

3 討 論

3.1 長期高脂飲食成功誘導小鼠胰島素抵抗模型

肝是胰島素的敏感組織，肝在調節糖、脂以及能量代謝，維持血糖血脂濃度方面發揮著重要的作用［10］。由于持續的高脂肪攝入，會導致胰島素的功能逐漸減弱［11］。大量研究表明，持續的高脂肪攝入會引起胰島素抵抗，并降低肝對胰島素的敏感性［12-13］。在本試驗中，HFD組小鼠在飼喂高脂飼料的第4、6、8、10和12周，HOMA-IR均高于相應的Con組，并且在12周時達到最大的穩定水平。此外，IGTTs和ITTs的結果顯示，在第8周時，葡萄糖就極度不耐受，隨后檢測了12周，結果發現葡萄糖的耐受情況仍在降低，已經達到了C57BL6小鼠糖尿病前期的標準數值。這說明飼喂12周60%的高脂飼料成功誘導了穩定的胰島素抵抗全階段小鼠模型。

HOMA-IR的增加，反映了胰島素敏感性的降低，這導致糖脂代謝異常。長時間高脂飲食誘導胰島素抵抗后，肝糖原合成能力減弱，能量以脂質形式儲存在肝［10，14］。此外，由于胰島素抵抗后肝胰島素信號通路受損，葡萄糖進入肝的能力降低［15-16］。因此肝通過增強糖異生維持細胞能量［17］。隨著肝內脂肪逐漸堆積，肝酶（AST、ALT）的含量逐漸升高［1］。本試驗中，HFD組小鼠ALT、AST的含量逐漸升高，這對肝產生損傷，引發脂肪肝。本試驗通過肝HE、PAS和油紅O染色發現，HFD組小鼠在胰島素抵抗發生的過程中，肝內糖原含量逐漸減少，脂肪含量逐漸增多，大量脂肪沉積，并發生嚴重的脂肪肝現象。綜上，在高脂飲食誘導C57BL6小鼠胰島素抵抗發生的過程中，小鼠肝酶升高，肝糖原較少、脂肪沉積增多，肝組織內分裂和損傷線粒體增多，肝損傷逐漸加重。

3.2 長期高脂飲食影響小鼠肝內胰島素信號通路及其下游糖、脂代謝能力

在機體攝入葡萄糖后，葡萄糖刺激β細胞分泌胰島素，進而激活PI3K［18-19］。PI3K磷酸化第二信使Akt，Akt在調節代謝、生長、增殖、存活、轉錄和蛋白質合成等多種細胞功能中發揮重要作用［20-21］。在本試驗中，從PI3K、AKT、P-AKT的蛋白表達結果可看出，2組同周時間點相比：在4周胰島素抵抗前，HFD組的PI3K與P-AKT的表達水平已經開始降低，雖然表達水平低于Con組，但機體還未發生胰島素抵抗，胰島素還能發揮其作用，在8周抵抗后胰島素作用逐漸減弱。說明長期能量過剩導致的胰島素抵抗會降低肝胰島素信號通路的活性，并且這種抑制作用隨著胰島素抵抗的惡化而變得更加嚴重。

肝是重要的胰島素靶向器官［22］。在進食后，肝內胰島素信號會調控葡萄糖和脂肪利用［23-24］。這些機制主要由Akt激活后作用的多種效應底物控制［20］?；罨腁kt：1）激活肝內GLUT4蛋白以促進肝內葡萄糖攝?。?5］。2）磷酸化糖原合成酶激酶-3（GSK-3）并抑制其活性從而促進肝糖原的合成［26］。3）促進肝細胞內FOXO1磷酸化，從而抑制糖異生［27］。4）促進Srebp-1c的表達和肝內脂肪合成［28］。5）通過AMPK信號通路抑制Srebp-1c的活化［29］。6）促進糖酵解的重要酶PFK1的表達，使葡萄糖被分解利用［30］。在本研究中，GLUT4和P-GSK3β的結果表明，在高脂飲食誘導小鼠胰島素抵抗的發展過程中，細胞外長期的能量過剩，會損害肝對葡萄糖的攝取轉運能力、肝內糖原的合成能力，這導致葡萄糖在血液內進入肝的能力減弱。因此，機體此時會促進糖異生能力以滿足肝細胞的能量需求。本研究P-FOXO1和FOXO1的檢測結果支持了這一觀點。小鼠肝中PFK1的含量在第6周開始下降，表明此時肝糖酵解能力開始下降。在12周時達到最低水平，表明在肝胰島素抵抗的發展過程中，肝糖酵解能力在逐漸下降，隨著抵抗的嚴重會加劇這種損害。在飼喂高脂飼料的過程中，小鼠肝中Srebp-1c酶的含量逐漸升高，說明在胰島素抵抗的發生過程中，肝內脂肪的生成能力逐漸增強，肝內脂肪含量逐漸升高，提示在抵抗發生后，脂肪的生成能力并不受到抑制，這種“選擇性”的抵抗值得進一步探究。

綜上所述，當機體持續攝入過多能量時，這些多余的能量就會被轉運到肝等組織中存儲。在正常的機體內，能量的存儲與利用之間有一個相對的穩定平衡狀態，一旦長時間處于能量過剩條件下時，這種平衡會被打破。在胰島素抵抗發生過程中，肝能量存儲與利用的平衡就會被打破，葡萄糖轉運至肝的能力可能逐漸減弱，肝內糖原合成能力可能逐漸減弱，含量減少，肝糖異生能力可能逐漸增強，肝內糖酵解的能力可能逐漸減弱，而此時能量大多以脂肪的形式沉積于肝內，那么肝內能量調控具體如何變化仍有待進一步研究，這時需要將重點放在細胞的“能量感受器”線粒體上。

3.3 長期高脂飲食導致小鼠肝內的線粒體能量代謝失衡

大量研究證明，線粒體功能損傷是誘發胰島素抵抗的主要機制之一［31］。線粒體呼吸鏈的作用代表著線粒體最基本的功能［32］。其中，線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ（COX-Ⅰ）具有一系列氧化還原中心的作用，可以將電子從NADH傳遞至 CoQ，驅動ATP的合成［33］。當機體缺乏能量時，線粒體呼吸鏈的作用會增強，驅動更多的ATP的合成為機體供能。當胞內能量缺乏時，ATP含量降低，造成AMP/ATP比值的變化，這一變化會直接調控AMPK的表達。AMPK的激活在線粒體的能量生成中具有核心地位，它可以激活SIRT 使下游的參與能量代謝的PGC1-α激活，從而促進線粒體的生物發生，為機體提供能量［34］。SIRT1也可使 AMPK上游激酶LKB去乙酰化而激活AMPK，這合理地解釋了AMPK/SIRT1協同參與調節能量代謝。

本研究在飼喂高脂飼料的第4周時，HFD組的ATP含量和COX-I含量與Con組接近。然而，從6周開始，HFD組均低于Con組，說明高脂飲食誘導的胰島素抵抗會減弱線粒體的呼吸功能，從而減少線粒體的產生。本研究在胰島素抵抗發生過程的5個時間點，HFD組小鼠肝內的AMPK、P-AMPK、SIRT1、PGC-1α的蛋白表達水平均低于Con組。此試驗誘導胰島素抵抗的過程中，HFD組小鼠持續攝入高脂飼料，體內能量一直相對充裕，因此可能對能量的需求不高，因此這些蛋白表達水平與對照組比相對較低，線粒體的生物發生能力和線粒體的能量產出較低。而Con組小鼠由于飼喂的是普通維持飼料，其機體內能量代謝仍處于正常狀態，能激活AMPK/SIRT1/PGC-1α信號通路促使線粒體生成能量。但是從HFD組的5個時間點對比來看，細胞外長期的能量過剩似乎會對細胞內能量的平衡產生影響，在第8或10周，HFD組AMPK、PGC-1α的蛋白表達水平有著升高的跡象，但仍顯著低于Con組，在12周時表達又降低。這可能是由于在胰島素抵抗發生后，肝胰島素信號活性降低，葡萄糖轉運至肝內的能力減弱，此時肝細胞內的能量主要以脂肪的方式貯存在肝內，在胰島素抵抗后肝可能不足以動用這些“存儲的能量”。因此，肝會增強糖異生的能力來為細胞供能。雖然細胞外部能量過剩，但是線粒體作為能量感受器，監測到肝細胞內部能量似乎相對缺乏，因此可能會通過反饋調節激活AMPK、SIRT1、PGC-1α信號通路來促進線粒體的生物發生為機體供能，這種能量間的嚴格調控也是機體自身的保護作用，但隨著抵抗逐漸嚴重，這一調節功能似乎未能彌補胰島素抵抗后所導致的能量代謝失衡狀態，ATP的含量也并不能因此而升高，所以在12周最后表達又降低。

線粒體功能受損與胰島素抵抗有一定關系，主要是由于隨著高能量的持續攝入，使線粒體呈現“超負荷”工作狀態，以減少機體內過多的能量［35］。線粒體的融合與分裂事件，是線粒體根據不同條件強化自身功能的一種重要方式，它們之間的動態平衡對線粒體的健康十分重要［36-37］。Mfn2參與線粒體外膜融合，線粒體的融合或許更有利于增強線粒體的功能，可提高細胞氧化磷酸化水平、增強線粒體呼吸，有利于能量產生［38］。Drp1調控線粒體分裂增強，會使機體內氧化磷酸化水平和ATP含量下降，因此線粒體的分裂似乎不利于能量的產生［39］。

融合蛋白Mfn2的表達情況檢測顯示，在5個時間點HFD組的Mfn2表達水平均低于Con組，HFD組由于能量過剩，線粒體不需要通過增加融合來為機體供能。同時，PGC-1α的激活能促進線粒體的融合功能，在本試驗中，試驗組的PGC-1α與Mfn2的表達水平均低于對照組同步驗證了試驗結果，說明在高脂飼料誘導的肝胰島素抵抗會減弱線粒體的融合功能。在肝胰島素抵抗發生后，線粒體自身可能會通過反饋調節，通過激活AMPK信號通路激活PGC-1α，來促進融合蛋白Mfn2的表達增強線粒體供能的能力，但是隨著抵抗的嚴重這種代償可能會失去作用，導致最后表達降低。因此猜測在肝臟胰島素抵抗發生后，線粒體的融合功能可能存在先升高再降低的趨勢，對于線粒體的融合功能在胰島素抵抗的發生過程中具體如何變化仍有待進一步研究。通過透射電子顯微鏡結果可以看出，高脂飼料飼喂的HFD組小鼠肝內線粒體處于分裂狀態的較多，10、12周HFD組小鼠鏡下線粒體分裂程度較高。Western blot結果中也顯示，HFD組的Drp1在4、6周時表達低于Con組，在第8周后高于Con組。猜測可能是因為在胰島素抵抗前，線粒體的功能正常，其融合與分裂之間的動態平衡未被打破。但是在胰島素抵抗后，線粒體可能需要通過增強自身的分裂水平對自身修復并保護：一方面將逐漸增多的受損線粒體從網絡中分離進行自噬清除，另一方面降低線粒體對底物的攝入以減少氧化對線粒體造成的損傷。

線粒體的自噬與線粒體的融合分裂相互影響，共同發揮作用，維持線粒體的穩態。線粒體分裂是線粒體自噬的前提，分裂會將受損的線粒體從線粒體網絡中分離出來，從而協助線粒體自噬的發生［40］。PINK1和PARKIN蛋白在線粒體自噬中發揮重要作用［41］。本研究發現，隨著高脂飼料飼喂時間的延長，HFD組小鼠肝中PINK1和Parkin蛋白水平逐漸降低，提示線粒體自噬能力逐漸減弱。這表明，在胰島素抵抗的發生過程中，即使線粒體的分裂能力在逐漸增強，但是隨著受損的線粒體逐漸增多，線粒體的自噬水平可能不足以完全清除損傷的線粒體；而且在胰島素抵抗后，細胞內氧化磷酸化水平、線粒體呼吸能力減弱，AMPK等能量調控蛋白表達水平較低，線粒體自噬水平可能因此受到抑制。

4 結 論

飼喂12周60%高脂飼料可以成功誘導C57BL6小鼠胰島素抵抗，且胰島素抵抗的發展過程是漸進性的，在第6、8周時發生了胰島素抵抗及肝的損傷，在抵抗的發展過程中肝內脂肪沉積逐漸增多。其次，在胰島素抵抗發生的過程中，肝胰島素信號通路活性逐漸減弱，肝內葡萄糖轉運、肝內糖原合成逐漸減弱，肝內糖酵解逐漸減弱，而肝糖異生與脂肪生成卻逐漸增強，說明攝入的高能量飼料導致肝發生了選擇性的胰島素抵抗。另外，在胰島素抵抗發生的過程中，肝線粒體的呼吸逐漸減弱，生物發生和融合總體逐漸減弱，在抵抗后出現短暫的代償性增強，但隨后又開始減弱，肝線粒體分裂逐漸增強，肝線粒體自噬逐漸減弱。

參考文獻（References）：

［1］ 潘玉艷. 硫普羅寧致脂肪肝患者肝酶水平升高［J］. 藥物不良反應雜志， 2009， 11（3）：209-210.

PAN Y Y. Increased liver enzyme levels after Tiopronin administration in a patient with fatty liver［J］. Adverse Drug Reactions Journal， 2009， 11（3）：209-210. （in Chinese）

［2］ 張麗紅， 張盈盈， 吳玄光. 犬糖尿病研究進展［J］. 中國獸醫雜志， 2008， 44（8）：64-65.

ZHANG L H， ZHANG Y Y， WU X G. Research progress of dog diabetes［J］. Chinese Journal of Veterinary Medicine， 2008， 44（8）：64-65. （in Chinese））.

［3］ SAMUEL V T， SHULMAN G I. Mechanisms for insulin resistance：common threads and missing links［J］. Cell， 2012， 148（5）：852-871.

［4］ KADOWAKI T， YAMAUCHI T， KUBOTA N， et al. Adiponectin and adiponectin receptors in insulin resistance， diabetes， and the metabolic syndrome［J］. J Clin Invest， 2006， 116（7）：1784-1792.

［5］ 張治國. 犬貓肥胖病防治探究［J］. 中獸醫學雜志， 2020（10）：82-83.

ZHANG Z G. Exploration of prevention and treatment of obesity in dogs and cats［J］. Chinese Journal of Traditional Veterinary Science， 2020（10）：82-83. （in Chinese）

［6］ 范禧勝， 溫賢章， 江從芳. 犬的肥胖癥［C］//第十五次全國養犬學術研討會暨第七次全國小動物醫學學術研討會論文集. 南昌：中國畜牧獸醫學會， 2013.

FAN X S， WEN X Z， JIANG C F. Obesity in dogs［C］//Proceedings of the 15th National Academic Symposium on Dog Breeding and the 7th National Academic Symposium on Small Animal Medicine. Nanchang：Chinese Society of Animal Husbandry and Veterinary Medicine， 2013. （in Chinese）

［7］ KUBOTA N， TOBE K， TERAUCHI Y， et al. Disruption of insulin receptor substrate 2 causes type 2 diabetes because of liver insulin resistance and lack of compensatory beta-cell hyperplasia［J］. Diabetes， 2000， 49（11）：1880-1889.

［8］ 王侃侃. 膳食能量和蛋氨酸限制對小鼠脂代謝和氧化應激的影響［D］. 無錫：江南大學， 2016.

WANG K K. Effects of dietary energy and methionine restriction on lipid metabolism and oxidative stress in mice［D］. Wuxi：Jiangnan University， 2016. （in Chinese）

［9］ 韋雪梅， 邱 霓， 熊 燕. 高脂飼養致小鼠胰島素抵抗對脂肪肝形成的影響［J］. 中國病理生理雜志， 2016， 32（10）：1875-1880.

WEI X M， QIU N， XIONG Y. Effect of insulin resistance on fatty liver in high-fat diet-fed mice［J］. Chinese Journal of Pathophysiology， 2016， 32（10）：1875-1880. （in Chinese）

［10］ KONSTANTYNOWICZ-NOWICKA K， HARASIM E， BARANOWSKI M， et al. New evidence for the role of ceramide in the development of hepatic insulin resistance［J］. PLoS One， 2015， 10（1）：e0116858.

［11］ KAHN C R， NEVILLE D M， ROTH J. Insulin-receptor interaction in the obese-hyperglycemic mouse［J］. J Biol Chem， 1973， 248（1）：244-250.

［12］ KAHN S E， HULL R L， UTZSCHNEIDER K M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes［J］. Nature， 2006， 444（7121）：840-846.

［13］ SONG A， WANG C， REN L P， et al. Swimming improves high-fat induced insulin resistance by regulating lipid and energy metabolism and the insulin pathway in rats［J］. Int J Mol Med， 2014， 33（6）：1671-1679.

［14］ AL-SHARE Q Y， DEANGELIS A M， LESTER S G， et al. Forced hepatic overexpression of CEACAM1 curtails diet-induced insulin resistance［J］. Diabetes， 2015， 64（8）：2780-2790.

［15］ RIBEIRO R T， LAUTT W W， LEGARE D J， et al. Insulin resistance induced by sucrose feeding in rats is due to an impairment of the hepatic parasympathetic nerves［J］. Diabetologia， 2005， 48（5）：976-983.

［16］ PARK E， GIACCA A. Mechanisms underlying fat-induced hepatic insulin resistance［J］. Future Lipidol， 2007， 2（5）：503-512.

［17］ PETERSEN K F， KRSSAK M， NAVARRO V， et al. Contributions of net hepatic glycogenolysis and gluconeogenesis to glucose production in cirrhosis［J］. Am J Physiol， 1999， 276（3）：e529-e535.

［18］ FARRAR C， HOUSER C R， CLARKE S. Activation of the PI3K/Akt signal transduction pathway and increased levels of insulin receptor in protein repair-deficient mice［J］. Aging Cell， 2005， 4（1）：1-12.

［19］ LAU M T， LEUNG P C K. The PI3K/Akt/mTOR signaling pathway mediates insulin-like growth factor 1-induced E-cadherin down-regulation and cell proliferation in ovarian cancer cells［J］. Cancer Lett， 2012， 326（2）：191-198.

［20］ SARBASSOV D D， GUERTIN D A， ALI S M， et al. Phosphorylation and regulation of Akt/PKB by the Rictor-mTOR complex［J］. Science， 2005， 307（5712）：1098-1101.

［21］ CUI X B， WANG C， LI L， et al. Insulin decreases myocardial adiponectin receptor 1 expression via PI3K/Akt and FoxO1 pathway［J］. Cardiovasc Res， 2012， 93（1）：69-78.

［22］ HESSE D， RADLOFF K， JASCHKE A， et al. Hepatic trans-Golgi action coordinated by the GTPase ARFRP1 is crucial for lipoprotein lipidation and assembly［J］. J Lipid Res， 2014， 55（1）：41-52.

［23］ BERGLUND E D， VIANNA C R， DONATO J， et al. Direct leptin action on POMC neurons regulates glucose homeostasis and hepatic insulin sensitivity in mice［J］. J Clin Invest， 2012， 122（3）：1000-1009.

［24］ TAN J R， XU J H， WEI G H， et al. HNF1α controls liver lipid metabolism and insulin resistance via negatively regulating the SOCS-3-STAT3 signaling pathway［J］. J Diabetes Res， 2019， 2019：5483946.

［25］ LATVA-RASKU A， HONKA M J， STAN ACˇG" KOV "A， et al. A partial loss-of-function variant in AKT2 is associated with reduced insulin-mediated glucose uptake in multiple insulin-sensitive tissues：a genotype-based callback positron emission tomography study［J］. Diabetes， 2018， 67（2）：334-342.

［26］ BEAULIEU J M， GAINETDINOV R R， CARON M G. The Akt-GSK-3 signaling cascade in the actions of dopamine［J］. Trends Pharmacol Sci， 2007， 28（4）：166-172.

［27］ PUIGSERVER P， RHEE J， DONOVAN J， et al. Insulin-regulated hepatic gluconeogenesis through FOXO1-PGC-1α interaction［J］. Nature， 2003， 423（6939）：550-555.

［28］ SAJAN M P， ACEVEDO-DUNCAN M E， STANDAERT M L， et al. Akt-dependent phosphorylation of hepatic FoxO1 is compartmentalized on a WD40/ProF scaffold and is selectively inhibited by aPKC in early phases of diet-induced obesity［J］. Diabetes， 2014， 63（8）：2690-2701.

［29］ 王春怡， 郝夢嬌， 胡方利， 等. 黃芪散有效部位群對Ⅱ型糖尿病大鼠肝臟AMPK/SREBP-1c通路的影響［J］. 中藥新藥與臨床藥理， 2018， 29（6）：679-686.

WANG C Y， HAO M J， HU F L， et al. Effect of Huangqi San effective fractions on hepatic AMPK/SREBP-1c pathway in type 2 diabetes mellitus rats［J］. Traditional Chinese Drug Research and Clinical Pharmacology， 2018， 29（6）：679-686. （in Chinese）

［30］ CHAN C Y， DOMINGUEZ D， PARRA K J. Regulation of vacuolar H+-ATPase （V-ATPase） reassembly by glycolysis flow in 6-phosphofructo-1-kinase （PFK-1）-deficient yeast cells［J］. J Biol Chem， 2016， 291（30）：15820-15829.

［31］ ZICKERMANN V， WIRTH C， NASIRI H， et al. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I［J］. Science， 2015， 347（6217）：44-49.

［32］ KOZIE R， PIRCHER H， KRATOCHWIL M， et al. Mitochondrial respiratory chain complex I is inactivated by NADPH oxidase Nox4［J］. Biochem J， 2013， 452（2）：231-239.

［33］ HA B G， MOON D S， KIM H J， et al. Magnesium and calcium-enriched deep-sea water promotes mitochondrial biogenesis by AMPK-activated signals pathway in 3T3-L1 preadipocytes［J］. Biomed Pharmacother， 2016， 83：477-484.

［34］ SCHINNER S. AMPK regulates energy expenditure by modulating NAD+ metabolism and SIRT1 activity［J］. Yearbook Endocrinol， 2009， 2009：22-23.

［35］ TURNER N， HEILBRONN L K. Is mitochondrial dysfunction a cause of insulin resistance？［J］. Trends Endocrinol Metab， 2008， 19（9）：324-330.

［36］ WESTERMANN B. Bioenergetic role of mitochondrial fusion and fission［J］. Biochim Biophys Acta （BBA）-Bioenerg， 2012， 1817（10）：1833-1838.

［37］ KARBOWSKI M. Mitochondria on guard：role of mitochondrial fusion and fission in the regulation of apoptosis［M］//HETZ C. BCL-2 Protein Family：Essential Regulators of Cell Death. New York：Springer， 2010：131.

［38］ WANG W Z， ZHANG F， LI L， et al. MFN2 couples glutamate excitotoxicity and mitochondrial dysfunction in motor neurons［J］. J Biol Chem， 2015， 290（1）：168-182.

［39］ SCHMITT K， GRIMM A， DALLMANN R， et al. Circadian control of DRP1 activity regulates mitochondrial dynamics and bioenergetics［J］. Cell Metab， 2018， 27（3）：657-666. e5.

［40］ MENDL N， OCCHIPINTI A， MLLER M， et al. Mitophagy in yeast is independent of mitochondrial fission and requires the stress response gene WHI2［J］. J Cell Sci， 201 "124（20）：1339-1350.

［41］ MATSUDA N， SATO S， SHIBA K， et al. PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy［J］. J Cell Biol， 2010， 189（2）：211-221.

（編輯 白永平）