逆境條件下藥用植物酚酸類物質“內外大循環”代謝及作用機制探討

摘要：逆境脅迫是植物進化過程中必不可少的驅動因子，關于植物應對逆境脅迫的適應機制研究日趨深入。植物體內的次生代謝物含量中酚酸類大約占到30％，它具有抗微生物、抗氧化、抗細胞毒性和抗炎的作用，是植物抗逆脅迫過程中的主要“功臣”，也是藥用植物發揮臨床藥效的重要物質基礎。前期研究發現，連作條件下丹參植株體內的酚酸類成分含量增加，根際的鄰苯二甲酸、苯甲酸等物質能夠促進立枯絲核菌增殖，致使連作丹參木質素合成增加，提升植物對病原菌侵染的防御能力。故而本研究對酚酸類次生代謝物在藥用植物體內合成以及體外代謝的“全鏈條”代謝途徑進行綜合探討，總結酚酸類次生代謝物合成及分泌的全過程，以期為藥用植物抗逆、抗病應答研究提供理論支撐。

關鍵詞：酚酸；藥用植物；逆境脅迫；合成調控；根系分泌物；根際微生物

中圖分類號：S567 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2024）09-0164-08

植物在生長過程中會遇到水分、溫度、重金屬、病蟲害和生物互作等多種逆境脅迫，在面對這些脅迫時，植物會在體內、體外進化出多種適應機制。在體內，植物會主動或被動合成次生代謝產物參與本身的抗病、抗逆應答，緩解逆境脅迫。在體外，植物會通過根部分泌一系列次生代謝物，直接參與抗逆防御或作為信使在土壤中“招募”有益微生物，以最大限度地降低逆境脅迫對植物造成的損害。

對于藥用植物而言，次生代謝產物作為其主要活性成分既是在長期適應、對抗逆境條件下的產物，也是維護植物自身生長的必需營養物質。植物根系分泌物中含有大量的質子、離子以及各種有機物質，根據其合成途徑可以分為酚類、萜類、甾類、生物堿和黃酮類等，其中主要是酚酸類、黃酮類以及萜類。研究表明，酚酸類化合物除起到抗氧化、抑制病原體的防御作用外，還以根系分泌物的形式互作于根際微生物群落。首先，根際微生物環境可以通過激發植物模式觸發免疫的方式影響根系分泌物的種類和數量，其次，根系分泌物也可以通過改變土壤理化性質的方式影響根際環境。我們之前的研究也表明，在連作脅迫條件下，丹參根際土壤中的酚酸類物質含量顯著增加，且與立枯絲核菌等致病真菌存在協同效應。基于此，本研究主要探討藥用植物在面對各種逆境脅迫時，酚酸類次生代謝物在植物體內及根際微環境中的代謝過程和作用機制，以期為植物抗病抗逆應答提供理論支撐。

1基于碳骨架結構的酚酸類根系分泌物研究

酚酸類物質是植物最大的次生代謝物組酚類物質中的一種，從簡單的芳環到復雜的環，這些化合物均來源于苯丙氨酸，因此也被稱為苯丙烷類化合物。

1.1種類和作用

根據碳骨架結構酚酸類物質可以分為苯甲酸和苯丙烯酸兩類，其中以苯甲酸為母核的C5-C1型酚酸包括對羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸、水楊酸、沒食子酸以及原兒茶酸等：另一類以苯丙烯酸為母核的C6-C3型酚酸包括阿魏酸、對香豆酸以及咖啡酸等。

研究表明，這些酚酸類化合物主要有兩個作用。一是抑制病原菌的生長繁殖：如煙草中的咖啡酸在面對細菌性病原菌感染時，通過激活苯丙氨酸解氨酶和氧化物酶來促進木質素和羥脯氨酸的積累，形成強大的物理屏障，有效防治細菌性枯萎病；玉米、大豆間作時肉桂酸通過限制大豆疫霉菌孢子的運動及萌發而起到明顯的抑菌作用；對香豆酸可以通過抑制革蘭氏陰性細菌病原體的主要毒力因子基因的表達起到顯著抑制歐文氏菌生長的作用。我們的研究表明，連作丹參鄰苯二甲酸與立枯絲核菌共培養體系通過調控環核苷酸門控離子通道（CNGCs）編碼基因啟動固有免疫（PTI）和效應觸發免疫（ETI），共同限制微生物進入，限制病原體繁殖或殺死植物組織內的病原體，但是對于鄰苯二甲酸導致丹參連作的貢獻率是多少需要進一步研究。

酚酸類化合物的另外一個作用即是可以作為信號分子在植物和微生物之間起到特異性的通訊作用：如苯甲酸參與宿主一病原體相互作用的信號轉導途徑，通過增加苯丙氨酸解氨酶活性誘導木質素的產生，進而增加植物細胞壁的抗性，減緩植物病害的發展；植物遭遇紫外線、臭氧、寒冷、干旱以及病原體侵襲等脅迫時，植物細胞快速響應不同刺激的關鍵信號分子，比如水楊酸防御性植物激素，做出防御反應使活性氧產量增加，從而調節細胞抗氧化代謝清除活性氧，起到保護植物自身的作用。

1.2酚酸類化合物在植物體內的代謝過程和影響因子

酚酸類次生代謝物在植物體內的合成過程是以莽草酸為起始物，通過莽草酸進入苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸這三種氨基酸中，其中苯丙氨酸和酪氨酸是苯丙烷類化合物生物合成的起始分子，隨后在苯丙烷類化合物合成代謝的過程中產生酚酸類化合物。

目前，對植物體內酚酸類化合物合成代謝的研究程度不一，其中迷迭香酸的代謝途徑較為清晰。Di等通過13C同位素示蹤法對丹參體內迷迭香酸的苯丙氨酸和酪氨酸兩條相互平行支路途徑進行研究，最終兩條平行途徑相結合，通過迷迭香酸合酶基因生成迷迭香酸。在酚酸類物質合成代謝過程中，酶的調控是不可忽視的重要因素，如苯丙烷代謝通路的關鍵酶中有一個共通的特點，即PAL、C4H、4CL、TAT基因家族都由多基因組成，并且在受到不同刺激時差異表達。目前，越來越多的研究傾向于對酚酸類生物合成過程中的調控因子酶基因的探索，例如裂解酶、轉移酶、連接酶、氧化酶以及還原酶的研究已經逐步深入。故而明確藥用植物在環境脅迫時體內合成途徑中相關酶基因表達量、酶活性與酚酸類化合物之間的因果關系尤為重要。

1.2.1環境脅迫促進植物酚酸類化合物的代謝 植物受到環境條件的脅迫后會產生抗逆反應，這種反應主要有生物和非生物脅迫兩個方面。一是土壤中的病原菌、微生物等生物脅迫：如微生物病原菌導致藥用體內信號通路的激活，這種活化促進了第二信使的產生和轉錄因子基因調控的活化，從而導致枸杞、擬南芥等藥用植物體內參與次生代謝物合成的酶的表達：Zhou等發現植物促生長真菌鏈格孢屬A13可以刺激丹參次生代謝，誘導C4H基因表達，提高C4H活性。這與我們的研究相一致，在連作丹參中鄰苯二甲酸和立枯絲核菌共培體系中PAL和4CL的基因表達上調，表明共培體系誘導了丹參根部中迷迭香酸合成過程中控制關鍵限速酶基因的表達量升高，進而使酚酸類次生代謝產物合成增加。

第二個是非生物脅迫，包括影響植物根系的土壤理化性質和環境中的溫度、濕度、光照以及植物自身的營養物質等。這種非生物脅迫會使植物體內的ROS水平提高，并產生氧化應激，SOD、POD等抗氧化酶活性升高，致使苯丙烷途徑中的關鍵酶活性升高，調控體內酚酸物質積累，應對氧化脅迫。而苯丙烷途徑的另一終產物是木質素，它可以增加植物體內細胞壁的堅固性，以此來應對脅迫。酚酸類化合物為木質素合成途徑中的中間產物，在紫外線、溫度或者光照輻射下，苯丙烷合成途徑上的關鍵酶活性均會增加，如C4H與NADPH和O2共同催化肉桂酸羥基化，繼而促進下游酚酸類物質以及木質素等產物合成。相較于4℃，山藥在25℃溫度下儲藏時的PAL、C4H和4CL的活性增加，基因表達被誘導，導致相應的肉桂酸和對香豆酸含量升高。小麥受到UV-B輻射時，C4H基因表達上調，使對香豆酸含量升高。茶樹在紫外輻射和機械損傷時，Cs4CL2基因和Cs4CLJ基因表達在不同時間段內出現升高，導致咖啡酸和阿魏酸含量升高。除此之外，植物自身細胞質pH值的變化是植物對外部刺激反應的重要信號之一，通常，植物細胞中的胞質pH值維持在相對恒定水平，以保持正常的生理功能。然而，細胞內pH值的變化會影響許多代謝過程，胞質酸化被認為是信號轉導的重要組成部分，不僅預示著防御反應也調節植物特定次生代謝物的生成，隨著胞質酸化的發生，PAL、TAT的表達增加，同時增加了酚酸的積累。綜上，與藥用植物根系密切接觸的土壤環境是影響植物酚酸類代謝物分泌的重要因素，不可忽視。

1.2.2酚酸類化合物的分子調控 在調控酶活性的多基因家族中，每一個基因家族中的不同基因在植物的不同部位表達均存在差異：如Hou等在丹參植株體內發現了3個PAL基因，且都參與迷迭香酸的合成，SmPAL1和SmPAL3在根和葉中的表達較高，而SmPAL2在莖和花中表達：Tonnessen等發現，在9個水稻PAL基因型中，OsPALA突變體比野生型更容易受到紋枯病和白葉枯病的侵染。然而基因家族中不同基因對于不同的酚酸類物質也呈現出不同的親和力，如目前在丹參中已經鑒定出7個4CL基因，分析揭示了Sm4CL2對4-香豆酸較強的底物親和力，而4-香豆酸是參與木質素、迷迭香酸等酚酸類化合物的前體物質，而Sm4CL1則更傾向于阿魏酸和咖啡酸。

植物在遇到各種脅迫刺激時會誘導基因家族中不同基因的差異表達，如水稻遭遇缺磷脅迫時，OsPAL基因在根和地上部的表達均顯著增加。MdTAT2和MdTAT3基因的表達響應蘋果的干旱脅迫，擬南芥中MdTAT2基因的表達則在干旱脅迫下得到促進，也就表明這些基因在耐旱中起的作用。在紫外線脅迫時，AtPAL1、AtPAL2以及AtPAIA的表達也顯著增加。綜上表明，苯丙烷途徑的特定產物由特定酶的代謝通路合成，并且不同的關鍵酶基因可以與特定產物的產生起到協同作用。

2酚酸類物質體外作用機制研究

對于藥用植物來說，其次生代謝產物既是其臨床療效的物質基礎，也是對逆境脅迫的一種響應。除了體內合成代謝研究，次生代謝物作為根系分泌物進入土壤之后的代謝及其作用研究也逐漸深入。近幾年的研究表明，植物根部在受到脅迫時進化出一種“Cry for help”機制，通過這種機制招募土壤中的有益微生物，而這些有益微生物可以幫助植物克服各種脅迫，或將這些脅迫的損害降到最低，最終起到促進植物生長的作用。

2.1根部免疫反應——脅迫誘導酚酸類根系分泌物變化

在所有植物組織中，根部的微生物多樣性最豐富，故而根部已進化出復雜的免疫系統來應對植物脅迫。在植物受到脅迫時，細胞表面的模式識別受體（PRR）可以通過微生物相關分子模式（MAMP）和病原菌相關分子模式（PAMP）來識別微生物以及病原菌，在防御的同時產生高濃度的活性氧以及離子瞬態爆發和絲裂原活化激酶（MAP激酶）的磷酸化，影響下游轉錄調節，繼而觸發固有免疫（PTI），使植物產生激素進行防御。水楊酸、茉莉酸就是植物免疫過程的中間調節因子，在協同和拮抗相互作用的復雜網絡中協調局部和全株的免疫應答，如水楊酸可以通過根際細菌進入鐵載體，其在根際積累可能會選擇產生鐵載體的根際細菌，達到防御的目的。Lebeis等通過16S rRNA基因測序證明，擬南芥受到脅迫時水楊酸和茉莉酸開啟防御信號增強根系分泌物的分泌，以影響根際微生物組。

有研究表明，感染病原體后，植物有50種以上的根系分泌物發生變化，比如，病原菌生物脅迫會導致秋葵體內莽草酸、沒食子酸、香草酸、阿魏酸等酚酸類物質分泌增加。在這一過程中，已有研究表明水稻根中的MATE轉運蛋白在遇到脅迫時促進酚酸類化合物向木質部的轉運，由此推測類似MATE的轉運蛋白可能參與酚類化合物釋放到土壤中。本課題組在前期研究中發現連作丹參中鄰苯二甲酸、苯甲酸和對羥基苯甲酸等12種酚酸類物質含量增加且增幅較大，除酚酸類物質外，酯類、醇類根系分泌物的含量也增加。

2.2酚酸類根系分泌物引起根際微生物變化

在“Cry for help”假說中，植物受到脅迫時分泌的特定根系分泌物“招募”有益微生物的增殖，抑制病原體的發展，這是呼救假說中重要的一步。同時根部作為微生物多樣性最為豐富的部位，根際的根系分泌物是吸引根際微生物的重要信號，調節根和微生物的相互作用。根系分泌物在起到營養物質作用的同時，誘導微生物應激反應，有益于植物生長：如與水楊酸和茉莉酸密切相關的根際促生菌（PGPR）可以激活抗細菌和抗真菌物質的產生和微生物應激反應等，而這是通過PGPR的假單胞菌中會發現的一種群體感應信號（Qs）來激活細菌中的轉錄應激反應，調節PGPR應答。植物防御時，迷迭香酸的積累通過植物來源的HSL類群體感應信號分子，提前刺激Qs響應基因表達來模擬降低致病性的模型，也就是通過HSL信號傳導誘導植物對細菌病原體的系統抗性。除此之外，人參根部分泌的沒食子酸、苯甲酸等酚酸類物質可以增加土壤中真菌的豐富度。而這正與本課題組前期研究一致，即丹參在連作條件下分泌增加的鄰苯二甲酸在低濃度時對立枯絲核菌表現出促進作用，而在高濃度下表現出抑制作用。

2.3酚酸類物質促進植物根際微生物組間交流

群體感應在植物根際微生物組間普遍存在，即微生物通過產生或者響應小分子的群體感應信號來檢測微生物種群密度，如現在已經從多種變形桿菌中分離出的N-酰基高絲氨酸內酯（AHL）QS信號。AHLs還進化為影響植物基因表達、誘導系統性植物抗性以及影響植物生長和發育的界間信號。多種藥用植物分泌的迷迭香酸作為一種高絲氨酸內酯模擬物，激活細菌群體感應信號，同時還對微生物生物膜的形成以及蛋白酶的合成有刺激作用。除此之外，細菌的擴散信號因子（DSF）不僅可以作為細菌之間的感應信號也被確定為界間信號在植物中觸發先天免疫。故而微生物之間的Qs信號在植物受到脅迫時招募和塑造根際微生物組中發揮根本作用，并且大多數微生物至少能對一類微生物信號作出響應，除了響應微生物之外，大多Qs信號也可以作為界間信號誘導植物基因的表達。

2.4酚酸類物質促進植物-根際微生物相互作用

植物和微生物之間的相互作用機制復雜，涉及不同生物體之間的信號傳導、基因的表達和沉默以及對各種信號反應的誘導和抑制。對于植物本身來說，首先是PRR識別與其相互作用的各種微生物的不同分子機制，植物可以通過與MAMP結合的PRR檢測微生物的存在。除此之外，一些根際微生物的代謝物也可以通過植物的MAMP被識別，常見于包括幾丁質和鞭毛蛋白在內的MAMP誘導系統防御，二者的結合激活植物的基礎防御應對植物脅迫。其次，當受到病原菌脅迫時，植物會在細胞崩解時產生內源性信號，激發損傷相關分子模式（DAMP），誘導植物誘發肽（Peps）的激活，而植物誘發肽是廣泛分布的植物信號分子，可激活多種防御途徑，對擬南芥的轉錄分析表明Peps激活水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）和乙烯信號傳導，以此來應對脅迫。

有益根際微生物通過競爭營養物質以及引發ISR間接抑制土壤病原菌。早期對于擬南芥的研究表明，ISR受SA非依賴性信號通路控制，該通路通過激活遠端的JA和ET依賴性防御基因和細胞壁的防御，以此來增加植物對病原體感染的反應時間，并且通過茉莉酸信號也確實影響了根際微生物的組成以及微生物的生長繁殖。

3總結與展望

藥用植物中發揮防病治病功能的有效成分是其區別于其他作物最主要的特征，有效成分主要是藥用植物自身生長過程中與環境共同作用積累的次生代謝產物，分為糖與苷類化合物、苯丙素類化合物、黃酮類化合物、萜類化合物等。正如所言“順境出產量，逆境出品質”，藥用植物品質的好壞與其受到的逆境脅迫密不可分。從中藥材利用的角度看，研究人員根據長期的臨床經驗已總結出優質中藥材的品質特征，主要為特定次生代謝產物的種類、含量和比例。研究指出，一方面藥用植物微生物AX+Z4M9kWcdk6n54e7GRJw==通過產生某些信號物質激活次生代謝產物產生的信號通路，以調節藥用植物次生代謝產物的合成和積累：另一方面，次生代謝物通過在植物體內合成后釋放到土壤中，繼而影響土壤中的根際微生物，使植物達到抗逆的作用。而在這一互作過程中，信號分子就是連接土壤、微生物和植物的橋梁，而酚酸類次生代謝物作為信號分子在植物和微生物之間發揮著關鍵性的通訊作用。在植物地上部，酚酸類次生代謝物的生物合成主要目的是，植物受到脅迫后調控苯丙烷代謝通路上關鍵酶的基因被激活，使酚酸類物質的積累增加，而這通常與增強藥用植物本身藥效以及抗逆耐受性成正比，進而起到保護植物的作用。而在植物地下部，酚酸類次生代謝物作為根系分泌物分泌到土壤中之后，其作為觸發植物與根際微生物之間的信號分子，激發自身免疫系統，招募有益于植物的微生物生長繁殖，起到抵抗外界脅迫的作用。因此，探究藥用植物通過機體地上部次生代謝物的生成以及地下部有益微生物的募集，這兩部分的整體抗逆性來阻止、降低或修復由環境改變或逆境造成的損傷，以使植物仍保持正常的生長生理活動等內容逐漸成為研究的核心，以期能夠充分利用創新的研究方法和技術手段來保護和開發珍貴而豐富的藥用植物資源。