黃柏堿調節MCP-1/CCR2信號通路對特應性皮炎大鼠炎癥反應的影響

[摘要]目的：探討黃柏堿對特應性皮炎（Atopic dermatitis，AD）大鼠炎癥反應的影響及其作用機制。方法：構建AD大鼠模型，大鼠分為正常組、模型組、黃柏堿低劑量組、黃柏堿高劑量組、黃柏堿+巨噬細胞趨化蛋白-1（Monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）組；給藥結束后，各組大鼠做皮損評分，記錄搔抓次數，HE染色觀察皮膚組織病理變化，甲苯胺藍染色測定肥大細胞數，ELISA試劑盒測定皮膚組織活性氧（Reactiveoxygenspecies，ROS）和血清免疫球蛋白（Immunoglobulins，IgE）、白介素-17（Interleukin，IL-17）、IL-6的含量，Western blot檢測皮膚組織MCP-1、CC類趨化因子受體2（CC chemokinereceptor 2，CCR2）蛋白表達。結果：與正常組相比，模型組大鼠脫毛處皮膚發生潰瘍、紅斑，表皮和棘層增厚且有大量炎性細胞浸潤，搔抓次數、肥大細胞數、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表達水平增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組皮膚組織紅斑、潰瘍情況、炎性細胞浸潤減少，未見脫屑，搔抓次數、肥大細胞數、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表達水平依次降低（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組皮膚紅斑、潰瘍和炎性細胞浸潤加重，搔抓次數、肥大細胞數、ROS、IgE、IL-17、IL-6及MCP-1、CCR2蛋白表達水平增加（P＜0.05）。結論：黃柏堿可能通過抑制MCP-1/CCR2信號通路降低AD大鼠炎癥反應。

[關鍵詞]特應性皮炎；炎癥反應；黃柏堿；MCP-1/CCR2信號通路；巨噬細胞趨化蛋白-1

[中圖分類號]R285.5 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2024）10-0013-05

Effect of Phellodendrine on Inflammatory Response in Rats with Atopic Dermatitis by Regulating MCP-1/CCR2 Signaling Pathway

YU Xianchao1， KOU Wang2， YANG Yang3

（ 1.Department of Beiyuan Outpatient， People's Liberation Army General Hospital， Jingbei Medical District， Beijing 100012， China; 2.Department of Pharmacy， the Sixth Medical Center of the General Hospital， Beijing 100037， China; 3.Department of Dermatology， the Sixth Medical Center of the General Hospital， Beijing 100037， China ）

Abstract： Objective To investigate the effect of Phellodendrine on inflammatory response in rats with atopic dermatitis （AD） and its mechanism. Methods AD rat model was established. The rats were separated into normal group， model group， low-dose Phellodendrine group， high-dose Phellodendrine group， Phellodendrine+macrophage chemoattractant protein-1 （MCP-1） group. After the end of administration， the rats in each group were scored for skin lesions， and the number of scratches was recorded， HE staining was applied to observe pathological changes in skin tissue， Toluidine blue staining was applied to determine the number of Mast cells， ELISA kits were applied to measure the content of reactive oxygen species （ROS） in skin tissue and serum immunoglobulin （IgE）， interleukin-17 （IL-17） and IL-6， and Western blot was applied to detect the expression of MCP-1 and CC Chemokine receptor 2 （CCR2） proteins in skin tissue. Results Compared with the normal group， the depilated skin of the model group developed ulcers， erythema， thickening of the epidermis and spinous layer， and a large number of inflammatory cell infiltration， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were increased （P＜0.05）. Compared with the model group， the erythema， ulcer and inflammatory cell infiltration of skin tissue in the low and high dose Phellodendrine groups were reduced， and no desquamation was found， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were decreased in turn （P＜0.05）. Compared with the high dose Phellodendrine group， the skin erythema， ulcer and inflammatory cell infiltration in the Phellodendrine+MCP-1 group were aggravated， the scratching times， the number of Mast cells， ROS， IgE， IL-17， IL-6， the protein expression levels of MCP-1 and CCR2 were increased （P＜0.05）. Conclusion Phellodendrine may reduce the inflammatory response in AD rats by inhibiting MCP-1/CCR2 signaling pathway.

Key words： atopic dermatitis; inflammatory response; phellodendrine; MCP-1/CCR2 signaling pathway; macrophage chemoattractant protein-1

特應性皮炎（AD）是一種慢性非傳染性炎癥性皮膚病，特點是持續的皮膚瘙癢，且長期復發，極大地降低了患者及其家人的生活質量。AD的病理生理學是復雜的、多因素的，它包括遺傳疾病、表皮屏障缺陷、免疫反應改變以及皮膚微生物平衡破壞等[1]。治療AD除了日常清潔外，局部使用皮質類固醇是其一線治療方法，也可聯合吡美莫司和他克莫司使用，中重度AD使用紫外線光療，抗葡萄球菌抗生素是治療繼發性皮膚感染的有效藥物，但對炎癥的改善作用不一，且成本過高[2]。黃柏堿來源于蕓香科植物黃柏的樹皮和莖皮，網絡藥理學和實驗已經證實，黃柏堿具有多靶點和多途徑抑制炎癥的作用，可能是一種潛在的治療炎癥相關疾病的有效藥物[3]。研究發現，人巨噬細胞趨化蛋白-1（MCP-1）及其受體CC類趨化因子受體2（CCR2）在過敏性皮炎中高表達，缺乏CCR2的皮膚病小鼠的炎癥因子顯著降低[4]。黃柏堿能否通過調節MCP-1/CCR2信號改善AD炎癥反應尚不清楚。本研究將探索黃柏堿對AD大鼠及MCP-1/CCR2信號的影響，為AD的臨床治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和材料

1.1.1 實驗動物：8周齡SD雄性大鼠，購自上海泰楚生物技術有限公司[SCXK（滬）-2023-0001]，動物飼養環境為清潔安靜、通風良好的SPF級動物房。

1.1.2 試劑、儀器：黃柏堿（純度≥98%，DH0031），購自德思特生物；二硝基氯苯（DNCB，97-00-7），購自西亞試劑；活性氧（ROS）檢測試劑盒（S0033S），購自碧云天生物；免疫球蛋白（IgE，ml003022）、白介素-17（IL-17，ml003003）、IL-6（ml064292）ELISA試劑盒，購自上海酶聯生物；一抗MCP-1（ab7202）、CCR2（ab223366），購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組：造模前1 d剪去大鼠背部毛發，使用脫毛膏在此區域（2 cm×2 cm）脫毛；造模當天，將2% DNCB溶液（丙酮∶橄欖油=1∶4）涂抹于背部皮膚（300μl）進行首次致敏；造模第3、5、7、9、11天，于背部脫毛處涂抹DNCB進行激發，每天1次。大鼠皮膚出現紅斑、水腫、出血，表皮脫落、結痂、鱗屑等癥狀時，表示AD大鼠模型構建成功[5]。

大鼠隨機分為正常組、模型組、黃柏堿低劑量組、黃柏堿高劑量組、黃柏堿+MCP-1組，每組12只。除正常組外，所有大鼠構建AD模型；正常組僅作脫毛處理，使用溶劑（丙酮：橄欖油=1∶4）進行涂抹，操作同造模組。確認建模成功后，將黃柏堿溶于生理鹽水，黃柏堿低、高劑量組大鼠分別皮下注射2.1 mg/kg/d、10 mg/kg/d黃柏堿-生理鹽水溶液[6]；黃柏堿+MCP-1組大鼠皮下注射10 mg/kg/d黃柏堿-生理鹽水溶液+2μg MCP-1重組蛋白；正常組和模型組皮下注射等量生理鹽水。給藥持續14 d。

1.2.2 皮損評分：給藥期結束后，參照SCORAD評分標準[7]，對各組大鼠皮膚脫屑/干燥、水腫/肥厚/苔蘚樣變、紅斑/出血、抓痕/潰瘍方面做分值評價：0分，無；1分，輕度；2分，中度；3分，重度；4分，極重度。

1.2.3 記錄搔抓次數：使用DNCB激發大鼠后，將大鼠單獨放置于安靜環境，統計5 min內大鼠搔抓/舔舐身體的次數。

1.2.4 觀察脫毛處皮膚病理變化：每組取6只大鼠，吸入乙醚麻醉后，腹主動脈取血5 ml，離心后取上層血清，分裝儲存待測；采集背部及右耳脫毛處皮膚，放入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片；切片經二甲苯梯度脫蠟，乙醇梯度脫水，HE染液染色，再次脫水，二甲苯透明，封片。光鏡下觀察皮膚病理形態變化。

1.2.5 測定肥大細胞數量：將1.2.4石蠟切片脫蠟至水，進行甲苯胺藍染色，光鏡下肥大細胞顆粒為深藍紫色，隨機選擇5個視野，計數視野下肥大細胞的數目，取平均值。

1.2.6 測定皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量：將每組剩余6只大鼠麻醉后處死，采集背部脫毛處皮膚組織，剪碎，加入組織裂解液，勻漿后分裝儲存；取一份皮膚組織勻漿液，離心后取上清，使用試劑盒檢測上清中ROS的含量；取1.2.4血清樣本，使用ELISA試劑盒按操作要求檢測IgE、IL-17、IL-6的含量

1.2.7 檢測MCP-1、CCR2蛋白表達水平：取1.2.6皮膚組織勻漿液，使用Western blot法檢測MCP-1、CCR2蛋白表達水平。定量勻漿液蛋白濃度，在SDS-PAGE凝膠中點樣，電泳，轉膜，封閉PVDF膜，剪切目的蛋白條帶并置于MCP-1、CCR2抗體稀釋液中過夜，常溫下使用二抗孵育目的條帶1 h，滴加200μl發光液，分析蛋白表達水平。

1.3 統計學分析：所有數據符合正態分布并以平均值±標準誤（xˉ±s）表示，使用GraphPad Prism 8.0.2分析，多組間差異采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05認為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠皮損評分比較：正常組大鼠皮膚粉嫩，色澤均一；模型組大鼠背部發生明顯紅斑，抓痕較多，表皮潰瘍、剝脫；黃柏堿低、高劑量組較模型組紅斑、皮膚潰瘍情況減少，未見脫屑；黃柏堿+MCP-1組皮損情況嚴重，與模型組類似。見圖1。與正常組相比，模型組大鼠皮損評分升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組皮損評分呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組皮損評分升高（P＜0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠搔抓次數比較：與正常組相比，模型組大鼠搔抓次數增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組搔抓次數呈劑量依賴性減少（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組搔抓次數增加（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠皮膚病理形態變化：正常組皮膚組織結構正常，無明顯病理異常改變；模型組表皮和棘層增厚、過度角化，皮膚潰瘍且有大量炎性細胞浸潤；黃柏堿低、高劑量組較模型組表皮和棘層增厚逐漸減輕，潰瘍和炎性細胞浸潤逐漸減少；黃柏堿+MCP-1組表皮角化，皮膚潰瘍，大量炎性細胞浸潤。見圖2。

2.4 各組大鼠皮膚組織肥大細胞數量比較：與正常組相比，模型組肥大細胞數量增加（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組肥大細胞數量呈劑量依賴性減少（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組肥大細胞數量增加（P＜0.05）。見圖3、表3。

2.5 各組大鼠皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量比較：與正常組相比，模型組皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量呈劑量依賴性下降（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組皮膚組織ROS和血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高（P＜0.05）。見表4。

2.6 各組大鼠皮膚組織MCP-1、CCR2蛋白表達水平比較：與正常組相比，模型組MCP-1、CCR2蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，黃柏堿低、高劑量組MCP-1、CCR2蛋白表達水平呈劑量依賴性降低（P＜0.05）；與黃柏堿高劑量組相比，黃柏堿+MCP-1組MCP-1、CCR2蛋白表達水平升高（P＜0.05）。

3 討論

AD是常見的慢性炎癥性皮膚病，受損的皮膚屏障可能是AD發展的第一步，這將導致進一步的皮膚炎癥和過敏敏感性，免疫系統失調是AD的重要發病基礎[8]。雖然關于AD確切的發病機制尚不清楚，但是學者一致認為，改善皮膚屏障功能障礙和免疫失調是治療AD可行的方法[9]。為了進一步了解AD，本研究通過在脫毛處涂抹DNCB構建AD大鼠模型。結果顯示，與正常組比較，模型組大鼠背部和耳部脫毛處皮膚潰瘍、紅斑、脫屑，且抓痕較多，搔抓次數增多，HE染色顯示患處表皮和棘層增厚、過度角化，皮膚潰瘍且有大量炎性細胞浸潤，提示該模型較好地還原了AD的病理狀態，模型建立成功，可以在此基礎上做深一層探索。黃柏堿是一種異喹啉生物堿，以黃柏堿為主要有效成分的中藥制劑已經在我國被廣泛用于治療AD[10]。黃柏堿本身具有抑制炎癥的作用，本研究使用不同劑量的黃柏堿處理AD大鼠，顯著緩解背部和耳部脫毛處皮膚潰瘍、紅斑和脫屑，病理損傷改善，抓痕和搔抓次數減少，且治療作用隨劑量升高而增強，說明黃柏堿對AD的進展具有抑制作用，研究其作用機制意義重大。

肥大細胞為一種粒細胞，積累在與過敏、傷口愈合和惡性腫瘤相關的炎癥部位，通過誘導血管擴張、促進血管通透性、吸收炎癥細胞促進適應性免疫反應，并調節血管的生成和纖維化，是過敏和其他炎癥反應的關鍵引發劑和調節劑[11]。包括肥大細胞在內的幾種免疫細胞以及它們產生的炎癥細胞因子廣泛影響與屏障功能相關的基因表達，采用全身抗炎療法可以改善AD中功能失調的皮膚屏障[12]。IL-17主要存在于活化的CD4+ T細胞，IL-17的激活直接造成細胞間脂質的異常，這關系到AD表皮屏障的損害[13]。抑制促炎因子IL-6可顯著緩解AD小鼠耳部組織腫脹及瘙癢感，改善嗜酸性粒細胞介導的過敏性炎癥[14]。過高的IgE與免疫缺陷疾病有關，包括AD、復發性皮膚和肺部感染等[15]。臨床研究發現，AD成年患者往往有嚴重的皮膚癥狀，并表現出高的IgE水平[16]。本研究也發現，AD大鼠血清IgE、IL-17、IL-6的含量升高，且皮膚潰瘍，說明過激的免疫炎癥反應可能是皮膚屏障受損的直接因素；黃柏堿處理AD大鼠顯著降低IgE、IL-17、IL-6的含量，表現出了明顯的抗炎作用。此外，氧化應激與AD的發展密切相關，且過敏性炎癥條件和氧化應激參與特應性疾病的進展[17]。已有研究報道，肥大細胞與過敏原誘導的皮膚炎癥有關，肥大細胞缺陷小鼠皮膚炎癥減輕，而抑制ROS的表達可以阻止過敏原誘導的肥大細胞活化和炎癥介質釋放[18]。本研究亦檢測到AD大鼠創傷皮膚組織ROS含量升高，這與前述肥大細胞數量增加一致；黃柏堿處理AD大鼠顯著降低其ROS含量，但作用機制有待深究。

MCP-1是由單核吞噬細胞分泌的趨化因子，也是一種多克隆性炎癥介質，能夠吸引或增強炎癥因子/細胞的表達，在炎癥部位的遷移和浸潤中發揮重要作用[19]。CCR2是MCP-1的受體，在慢性皮膚病中，單核細胞及其分泌蛋白MCP-1和CCR2的異常激活，單核細胞分化為巨噬細胞，并從血液轉移到炎癥部位，這個過程會導致病變的形成[20]。本研究中，AD大鼠病變皮膚組織MCP-1和CCR2蛋白表達水平升高，說明MCP-1/CCR2軸激活；黃柏堿可以降低AD大鼠MCP-1、CCR2蛋白表達，黃柏堿對AD大鼠癥狀的緩解作用可能與抑制MCP-1/CCR2信號通路激活有關；使用MCP-1與黃柏堿共同處理AD大鼠，對炎癥反應及MCP-1/CCR2軸沒有影響，提示黃柏堿對AD大鼠炎癥反應的抑制作用與抑制MCP-1/CCR2軸激活有關。

綜上，黃柏堿可能通過抑制MCP-1/CCR2信號通路降低AD大鼠炎癥反應。由于AD是典型的皮膚屏障功能異常皮膚疾病，黃柏堿能否在緩解癥狀的同時，通過修復皮膚屏障功能降低炎癥反應，也是后續研究的方向。

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[收稿日期]2023-07-20

本文引用格式：于現朝，寇旺，楊洋.黃柏堿調節MCP-1/CCR2信號通路對特應性皮炎大鼠炎癥反應的影響[J].中國美容醫學，2024，33（10）：13-17.