食用菌菌種分子生物學檢測研究進展

摘 要：近年來，我國食用菌產業發展迅速，食用菌菌種混亂、來源不清等問題已成為制約產業發展的重要因素。傳統的食用菌菌種鑒定方法，如形態學特征觀察、品種拮抗試驗等，雖然在一定程度上能夠滿足需求，但存在鑒定周期長、準確性不高等問題。分子生物學技術的不斷進步，為食用菌產業發展提供了強大的技術支撐，也提升了食用菌菌種檢測、品種鑒定與種質資源保護水平。常見的食用菌菌種分子生物學檢測方法有DNA分子標記、DNA序列分析與DNA條形碼技術等。DNA分子標記技術包括以分子雜交為基礎的DNA標記，如RFLP；以PCR為基礎的各種DNA指紋技術，如RAPD；以及以測序為基礎的新型分子標記，如SNP與MNP等。DNA序列分析技術主要指ITS、IGS以及基于基因組測序技術的序列分析。DNA條形碼技術包括ITS條形碼和蛋白編碼基因條形碼，如EF-1α、β-tubulin等。概述了近年來食用菌菌種分子生物學檢測領域的研究進展，提出了食用菌菌種分子檢測技術的發展建議，為食用菌菌種的快速準確鑒定及品種選育等提供參考。

關鍵詞：菌種真實性檢測；分子標記；品種鑒定；機器學習；CRISPR/Cas系統

中圖分類號：S646 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）10-009-09

收稿日期：2024-07-18；修回日期：2024-08-08

作者簡介：宋浩源，男，在讀本科生，專業方向為食用菌學。E-mail：shy200404060035@163.com

通信作者：趙   鵬，男，副教授，主要從事食用菌分子分類研究。E-mail：zhaop529@hotmail.com

Research progress on molecular biological detection of edible mushroom strains

SONG Haoyuan， ZHAO Peng

（School of Horticulture， Ludong University， Yantai 264025， Shandong， China）

Abstract： In recent years， edible mushroom industry of China has developed rapidly. But the problems such as confusion and unclear source of edible mushroom strains have become important issues restricting the development of the industry. Classic identification methods of edible mushroom strains such as morphologic characteristic observation， analysis of variety antagonistic reaction are time-consuming and inaccurate sometimes. The continuous progress of molecular biology technology has provided strong technical support for the development of edible mushroom industry and facilitates the detection of edible mushroom strains， variety identification and genetic resource conservation. The molecular methods of edible mushroom strains are DNA marker method， DNA sequence analysis and DNA barcoding. DNA marker techniques include the methods based on molecular hybridization such as RFLP， DNA fingerprinting methods based on PCR technique such as RAPD and novel markers based on the genome sequencing such as SNP and MNP. DNA sequence analysis technique is the analysis of ITS， IGS and the analysis based on genome sequencing. DNA barcoding technique includes the ITS barcoding and house-keeping gene barcoding such as EF-1α， β-tubulin. In this paper， the research progress on the molecular biological detection of edible mushroom strains in recent years was reviewed， and prospects for future molecular detection of edible mushroom strains was addressed， which provided reference for rapid and accurate identification of mushroom strains and variety breeding.

Key words： Mushroom strains authenticity detection; Molecular marker; Variety identification; Machine learning; CRISPR/Cas system

中國食用菌產業歷經40多年的迅速發展，已然躍升為全球最大的食用菌生產、消費和出口國。2022年全國食用菌總產量4 543.86萬t[1]。種業是農業的“芯片”，菌種是食用菌產業的命脈和核心競爭力。隨著食用菌產業的快速發展，食用菌菌種混亂、來源不清等問題已成為制約產業發展的重要因素。通過對食用菌菌種的檢測可鑒定菌種真實性，同時也可篩選具有優良性狀的菌種為選育新品種提供支持[2]。對食用菌育種人員來說，準確鑒定菌種，是培育新品種的基礎。此外，鑒定食用菌品種，對保障品種權利具有重要意義。通過對新品種的認定，保證了新品種的質量，防止了侵權、不正當競爭，保護了新品種發明者的合法權利[3]。

傳統的食用菌菌種鑒定方法，如形態學特征觀察、品種拮抗試驗及同工酶電泳等，雖然在一定程度上能夠滿足需求，但存在鑒定周期長、準確度不高等問題[4]。隨著生物技術的不斷發展，與食用菌有關的遺傳學與分類學研究大量開展，使分子生物學手段在食用菌菌種鑒定方面的應用范圍得到了進一步的擴展，為食用菌品種鑒定與種質資源保護等提供有力的技術支撐。分子鑒定技術作為一種新興的技術手段，在食用菌菌種鑒定中發揮著越來越重要的作用。常用的分子生物學檢測技術有DNA分子標記技術、DNA序列分析[5]與DNA條形碼技術等。

1 DNA分子標記技術

廣義的分子標記指在分子水平上可標識的基因組中任何點位上的相互差異（遺傳多樣性）。狹義的分子標記是指可標識的核苷酸序列多態性[6]。分子標記與遺傳標記相比具有以下優點：（1）在生物體發育的不同階段，不同組織的DNA都可用于標記分析；（2）大多數分子標記是共顯性遺傳；（3）基因組變異極其豐富，分子標記的數量幾乎是無限的[7]。基于對DNA多態性的檢測手段，可將其分為三類[8]：一是以分子雜交為基礎的DNA標記技術，如RFLP（restriction fragment length polymorphism，限制性片段長度多態性），二是以PCR為基礎的各種DNA指紋技術，如RAPD（random amplified polymorphismic DNA，隨機擴增多態性）、AFLP（amplified fragment length polymorphism，擴增片段長度多態性）、SSR（simple sequence repeat，簡單重復序列）、ISSR（inter-simple sequence repeat，簡單序列重復區間擴增多態性）等，三是以測序為基礎的新型分子標記，如SNP（single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性）、MNP（multiple nucleotide polymorphism，多核苷酸多態性）等。根據需要選擇適合的分子標記技術，或聯合不同的標記技術為食用菌產業的發展提供保障。

1.1 RFLP（限制性片段長度多態性）技術

RFLP是最早期的分子標記技術之一。RFLP是指基因型之間限制性片段長度的差異，這種差異是由限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的[9]。1995年，RFLP成功應用在食用菌菌株鑒定中[10]，后來廣泛應用到食用菌的遺傳研究和種群結構分析中。使用3種不同的RFLP標記和3種不同的AP-PCR（arbitrarily primed PCR，隨機引物PCR）引物，成功地區分了2種草菇Volvariella volvacea和V. bombycina[11]。使用限制性內切酶Hae III和Bst F51消化ITS（internal transcribed spacer，內轉錄間隔區片段）成功鑒定出大多數北半球的冬菇屬Flammulina物種，使用另外兩種酶Bgl Ⅰ和Bst UI消化金針菇F. velutipes得到了更多的限制性片段，并且這些片段與特定的地理分布相關聯[12]。目前，基于指紋圖譜技術發展起來的PCR-RFLP技術因具有操作簡單、成本低、重復性好等優點，被廣泛應用于物種鑒定[13]。通過對58個白靈側耳Pleurotus nebrodensis菌株ITS特異性擴增和克隆測序，建立ITS-RFLP技術，成功實現了對白靈側耳菌種的分子檢測[14]。不過，由于成本較高，檢測技術繁雜，RFLP標記難以用于大規模生產實踐中[15]。

1.2 RAPD（隨機擴增多態性）技術

RAPD標記由Williams等[16]和Welsh等[17]于1990年創立。該技術使用1～2個隨機引物（一般8～10個堿基）非定點地擴增基因組DNA，然后經凝膠電泳分離后，檢測其擴增片段多態性[18]。待測菌株基因組DNA如果在特定引物結合區域發生片段插入、缺失或堿基突變，有可能導致引物結合位點的分布發生相應的變化，導致PCR產物增加、缺少或發生分子質量變化。若PCR產物增加或缺少，則產生RAPD標記。RAPD技術是一種簡單、快速、準確的食用菌菌種鑒定方法[19]。目前，已被廣泛應用于食用菌菌種鑒定與遺傳多樣性研究中。利用RAPD技術和聚類分析對木耳屬Auricularia不同種和種內不同菌株進行分子鑒定，結果表明，RAPD技術能夠有效地用于木耳屬物種或菌株的快速準確鑒定[20]。使用RAPD技術分析了野生紅菇Russula sp.子實體和從中分離的3種菌株的DNA多樣性，對分離得到的3個菌株進行鑒定，結果表明這3個菌株為同一個種[21]。對46個側耳屬Pleurotus菌株進行RAPD分析和酶譜分析，結合生態和形態學數據，探討了這些菌株的遺傳多樣性和系統發育的關系[22]。利用RAPD分子標記技術對8個黑木耳Auricularia auricula生產菌株進行分子鑒定，通過NTSYS軟件進行聚類分析，結果顯示這些菌株之間的遺傳相似性在0.53～0.97之間，遺傳差異較大，為黑木耳種質資源的研究提供了科學依據[23]。RAPD標記的試驗條件摸索和引物選擇是十分關鍵而艱巨的任務，通過對試驗條件的標準化，可以提高RAPD標記的再現性[24]。

1.3 AFLP（擴增片段長度多態性）技術

AFLP標記技術是對限制性酶切片段的選擇性擴增。其原理是通過限制性內切酶水解基因組DNA 產生不同大小的DNA片段，再利用PCR技術將這些片段進行選擇性擴增，最后在高分辨率凝膠上通過電泳檢測擴增片段的長度多態性[25]。鑒于AFLP標記的多態性強，一次可檢測到100～150個擴增產物，因而非常適合繪制品種指紋圖譜及進行分類研究[26]。應用AFLP分析建立了糙皮側耳Pleurotus ostreatus的DNA指紋圖譜，計算了菌株間的遺傳相似系數和遺傳距離，并通過UPGMA法進行了聚類分析。研究結果顯示，14個菌株被分為6個組，其中P17和雜3、閩31和義平分別表現出密切的遺傳關系，這與它們的地理分布和最佳生長溫度相一致，為糙皮側耳的分子鑒定和遺傳研究提供了重要數據[27]。對31個香菇Lentinula edodes主要栽培菌株的DNA多態性進行分析研究，得到443條擴增條帶，其中189條為共有帶，多態性比率為57.34%，表明香菇菌種間存在一定程度的遺傳多樣性，為香菇種質資源的鑒定提供了可靠的分子生物學依據[28]。應用4個香菇品種（LB-21、L808、215和B15-1）的AFLP分子標記，分析其遺傳多樣性，為香菇品種的遺傳多樣性和親緣關系研究提供了重要數據[29]。AFLP結合了RFLP和RAPD兩種技術的優點，但分析成本較高，對DNA的純度和內切酶的質量要求也較高[30]。

1.4 SSR（簡單重復序列）技術

SSR標記是由一類1～6個堿基組成的基序串聯重復而成的DNA序列，長度一般較短，并廣泛分布于基因組的不同位置，具有較高的多態性。其原理是根據微衛星DNA兩端的單拷貝序列設計1對特殊引物，利用PCR技術擴增每個位點的微衛星DNA序列，通過電泳分析核心序列的長度多態性[31]。利用200對SSR標記分析了25份常用香菇栽培菌種的遺傳多樣性，結果顯示供試材料的遺傳相似性較高，平均遺傳相似系數為0.776，成功構建了11份香菇商業菌種的多位點SSR指紋圖譜，為香菇菌種的真實性鑒定提供了新的方法，具有重要的應用價值[32]。從雙孢蘑菇Agaricus bisporus的基因組中鑒定了3134個SSR位點，并開發了17個多態性引物對。研究結果顯示，這些SSR標記能夠準確地識別所測試的11個商業栽培品種，其中AB_SSR_2341和AB_SSR_2590兩個標記組合可以區分所有品種。該研究為雙孢蘑菇品種保護和分子輔助育種提供了有效的技術手段[33]。利用MISA軟件在靈芝Ganoderma lucidum全基因組中掃描到4038個SSR位點，設計出1442對引物，并通過試驗驗證篩選出44對有效SSR引物。利用這些引物對11份靈芝種質資源進行了遺傳多樣性評估，結果表明，供試材料的遺傳距離在0.120～0.962，可以分為3大類。表明靈芝全基因組SSR分子標記技術可用于種質資源鑒定和遺傳多樣性分析，這對推動靈芝產業的良性發展具有重要意義[34]。使用SSR-PCR對白肉靈芝Ganoderma leucocontextum進行遺傳多樣性分析，結果表明SSR標記技術在遺傳多樣性分析中表現出較高的多態性，可用于白肉靈芝菌種鑒定[35]。利用13個大球蓋菇Stropharia rugosoannulata菌株和已公布的基因組數據，設計了100對SSR引物進行試驗驗證。發現了6種SSR類型，其中三核苷酸類型最為常見。通過驗證試驗獲得了16對引物，其中3對引物（DQGSSR020、DQGSSR031、DQGSSR077）表現出高多態性、特異性和無雜峰。這些引物被用于構建大球蓋菇DNA指紋編碼，建立了13個大球蓋菇菌株的32位數分子指紋數據庫編碼[36]。但應用SSR標記建立新的標記時，需要了解重復序列兩端的序列信息，所以開發起來具有一定難度，成本也比較高[37]。

1.5 ISSR（簡單重復序列區間）技術

ISSR是基于微衛星DNA的分子標記方法。通過設計特定的引物，這些引物能夠與基因組中的SSR序列結合，并在PCR反應中擴增這些位點。擴增產物通過電泳或毛細管電泳技術進行分析，不同的SSR重復模式會導致產物大小不同，從而可以識別個體之間的遺傳差異[38]。ISSR標記具有多態性高、簡便快速、分辨率高等優點，廣泛應用于植物和微生物的種質資源鑒定及遺傳多樣性分析等領域。食用菌ISSR相關行業標準適用于若干側耳屬食用菌、香菇、黑木耳、灰樹花、金針菇、滑菇、茶樹菇、雞腿菇等菌種的真實性鑒定[39]。利用ISSR分子標記技術對6種不同來源的金針菇菌株進行了分子鑒定。從20條ISSR引物中篩選出8條可用引物，共獲得136條DNA片段，其中多態性條帶占比81.6%。通過UPGMA軟件進行聚類分析，將供試金針菇菌株分為3個組群。結果顯示，ISSR分子標記技術可有效用于金針菇生產菌株的快速準確鑒定，是金針菇指紋圖譜分析的有效工具[40]。通過對24個黑木耳菌株的分析，發現酯酶同工酶酶譜可擴增出11條不同遷移率的酶帶，ISSR分子標記技術則擴增出67條清晰的DNA多態性片段；聚類分析顯示，當遺傳系數為0.74時，菌株分為兩大類。研究結果與拮抗試驗結果基本一致，為黑木耳菌株的選擇及遺傳育種提供了參考依據[41]。采用ITS序列分析和ISSR分子標記技術，結合拮抗試驗，對18個靈芝菌株進行鑒定和遺傳多樣性分析。研究結果表明，所有菌株均屬于赤芝Ganoderma sichuanense，并可細分為4個類群，拮抗試驗結果顯示，79.7%的菌株之間存在拮抗現象，可分成7個類群；ISSR分析顯示，菌株的遺傳相似系數平均為0.652 9，當相似系數約為0.679時，也可以分為7個類群。綜合分析表明，靈芝菌株表現出明顯的遺傳多樣性，且基于ISSR的分類結果與基于ITS序列分析和拮抗試驗結果的分類一致[42]。ISSR技術的缺點是在PCR擴增過程中需要一定時間摸索最適反應條件[43]。

ISSR標記具有重復性高、穩定性好的特點，用其轉化的SCAR（sequence characterized amplified regions，特定序列擴增）標記則更加可靠。采用ISSR標記技術對34個黑木耳栽培菌株進行DNA指紋分析，構建DNA指紋圖譜，成功將2個黑木耳栽培菌株中的ISSR特異性DNA帶轉化為SCAR標記，用于快速準確鑒定黑木耳栽培菌株[44]。通過拮抗試驗、現蕾出菇試驗和ISSR圖譜分析，獲得秀珍菇Pleurotus geesteranus菌株的ISSR特異性標記，并將其克隆和測序。利用Primer 6.0軟件設計了SCAR引物，并通過PCR擴增驗證了該標記的穩定性，結果顯示，該ISSR-SCAR標記能夠以100%的準確率鑒定低溫刺激型秀珍菇菌株，為秀珍菇種質資源的鑒定和分類提供了技術支持[45]。

1.6 SNP（單核苷酸多態性）技術

SNP是指基因組水平上單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態性。通過設計特異性引物或探針，結合PCR擴增和先進的檢測技術，可以實現對SNP位點的精確檢測，具有自動化程度高、通量大、速度快等優點[46]。隨著第三代基于測序技術的分子標記技術的進展，使得密集標記圖譜和基因分型成為可能[47]。

利用重測序數據分析了8個金針菇菌株的基因組，發掘金針菇特異性標記，共鑒定出1 840 620個SNP、95 035個InDel （insertion deletion，插入或缺失）和63個豐度SNP標記區域。這些標記將有助于金針菇的遺傳分析，為分子輔助育種、功能基因發掘和機制探索提供支持[48]。對河南香菇主產區23份香菇種質資源進行了全基因組重測序，分析了SNP和InDel數據，并進行了遺傳結構分析、進化樹構建和主成分分析。結果顯示，這些香菇樣本的遺傳多樣性較低，可分為3個譜系，推測至少有3個祖先遺傳成分。主成分分析進一步驗證了菌株間的親緣關系，并證明了菌種分支的地域性[49]。傳統方法檢測SNP位點耗時且成本高昂，且只能發現有限的SNP位點。為了提高效率，可利用限制性內切酶切割基因組DNA，并結合高通量測序技術來篩選食用菌SNP位點[50]。

1.7 MNP（多核苷酸多態性）技術

MNP分子標記是建立在SNP分子標記基礎上，通過識別、篩選和設計目標基因組中的多個分散SNP位點，構建出具有高精度和高通量的品種鑒定體系[51]。MNP已成功應用于水稻、大豆、油菜、茄子、玉米、番茄等作物的品種鑒定[52]。研究人員已在一些常見食用菌如香菇、金針菇、刺芹側耳等應用MNP技術進行菌種分子生物學鑒定[53-55]。MNP分子標記技術以高度多態性、高通量特性、準確性和可靠性以及廣泛適用性等優點在食用菌菌種分子生物學檢測領域展現出巨大的應用潛力[56]。隨著技術的不斷發展和完善，相信MNP分子標記技術將在食用菌菌種的精準鑒定中發揮重要作用[57]。

2 DNA序列分析技術

核酸是生命活動中最基本的遺傳信息單位，同時也是重要的遺傳信息載體，為研究物種的遺傳多樣性提供了大量可靠的資料。通過核酸序列分析，可以直觀地觀察到堿基的轉變、顛換、變異趨勢等。對食用菌菌種進行序列分析，主要是通過對核糖體DNA及其他基因進行序列分析[58]。

2.1 ITS（內轉錄間隔區）

ITS片段是核糖體RNA基因簇的一個高變區，位于18S和28S rRNA基因之間，包括ITS1、5.8S rRNA基因和ITS2區域。真菌的ITS在物種間頻繁地發生變化，具有豐富的序列多態性。所以，在所有的核糖體DNA片段序列中，ITS片段具有更高的效率，可以應用于物種的分類鑒定[59]。

對15種常見栽培食用菌的30個菌株進行了18S rDNA（核糖體DNA）和ITS序列的測序分析，并使用neighbor-joining（NJ）法構建了系統發育樹。結果顯示，18S rDNA序列在較高分類水平上表現出極高的相似性，而ITS序列則在較低分類水平上提供了更高的可信度和區分能力。研究認為，結合18S rDNA和ITS序列分析是一種快速有效的食用菌菌種鑒定方法[60]。采用ITS分子標記技術，對內蒙古市場上的11種常見野生食用菌進行了分子鑒定。結果顯示，ITS分析方法能夠辨別外形相似的野生食用菌，為蘑菇市場混偽品種鑒定提供了快速有效的手段[61]。對采集的6種野生蘑菇樣本，利用引物ITS1和ITS4進行擴增，然后進行序列分析。結果顯示，Volvariella volvacea、Trametes elegans、Schizophyllum commune、Pleurotus ostreatus、Ganoderma lucidum和Trametes gibbosa的序列分別與數據庫中的相應物種序列匹配，相似性為97%～100%[62]。

ITS序列在進化過程中存在著高度保守、進化緩慢、分化程度低等缺陷[63]。對側耳屬Pleurotus 16個種38個菌株的ITS序列進行分析。結果顯示，側耳屬各物種的ITS序列種內趨異度極小，但種間趨異度較大，其中P. rattenburyi和P. djamor之間的趨異度最大，為0.282。研究認為，ITS序列差異2%～3%作為傘菌中種的鑒定臨界值在側耳屬中并不合適，且對P. ostreatus和P. cornucopiae的準確鑒定需要開發新的分類鑒定標記[64]。

2.2 IGS（intergenic spacer，基因間隔區）

IGS作為核糖體DNA序列中進化最迅速的區段已經被廣泛用于真菌的遺傳學研究[65]。IGS區域為高變區，經常被用來進行種內的比較[66]。使用RAPD和IGS標記對白靈側耳菌株進行分析，結果顯示供試菌株間存在多態性，IGS1區域較為保守，而IGS2區域進化較快，具有豐富的多態性。IGS2-RFLP被認為比RAPD更穩定且具有更好的操作性，適用于白靈側耳菌株的鑒定[67]。對8個刺芹側耳Pleurotus eryngii菌株進行了IGS2序列的分析，結果顯示不同菌株在IGS2區域存在長度異質性和數量多態性，結合RFLP可實現對刺芹側耳菌種的有效鑒定[68]。利用IGS2和RAPD技術，分析20個不同斑玉蕈Hypsizygus marmoreus菌株的遺傳差異，結果顯示IGS2分析與RPAD技術相結合的方法準確可靠，為斑玉蕈菌株的快速準確鑒定提供了技術支撐，為斑玉蕈種質資源的知識產權保護奠定了基礎[66]。

2.3 基于基因組測序技術的DNA序列分析

目前，隨著高通量測序技術的發展，完成了越來越多的食用菌全基因組測序。采用二代和三代測序技術，獲得了金針菇單核菌株6-3的基因組序列，并對其rDNA序列進行了深入分析。結果表明IGS區域存在豐富的多態性，包括SNP、InDel和TRS（tandem repetitive sequence，串聯重復序列），其中IGS2的多態性高于IGS1。金針菇rDNA序列的5S、5.8S、18S和28S rDNA序列高度保守，不同拷貝的序列完全一致，而IGS1和IGS2在不同拷貝間存在廣泛的多態性。說明金針菇rDNA序列中的IGS區域在種內不同菌株間的鑒定中具有應用潛力[69]。利用三代測序技術對毛木耳Auricularia cornea單核菌株B02的基因組進行了測序和組裝，并通過二代測序數據進行了校正，得到了一個高質量的基因組序列。分析發現，毛木耳的IGS1和IGS2序列高度保守，特別是在IGS1的1400～2200 bp區域，不同拷貝之間沒有多態性，但在不同品種之間存在較高的SNP頻率，這一片段有望用于毛木耳品種的鑒定研究[70]。

3 DNA條形碼技術

DNA條形碼是一種被廣泛認可和接受的標準DNA片段，這種片段擁有豐富的多樣性，能夠在不同物種之間展現出明顯的特異性差異。更為關鍵的是，這些DNA片段相對較短，便于進行擴增并能迅速識別。通過對這些特定片段的研究，科學家們建立了一個先進的生物身份識別系統，這個系統能夠對物種進行自動化、快速且準確地鑒定[71]。其原理是DNA序列由4種不同的堿基構成，即A、T、G、C，若一段序列有n個堿基，則LfAXJXcSrdXBCUaXuLu+qQ==有4n種編碼模式。如果計算15個堿基，就可以得到將近10億個片段，比現有的物種多100倍。從這個角度來看，DNA條形碼的編碼工作是基于數百個堿基的基因序列，基本上包含了全部的物種[72]。通過分析大量動物物種的COI（cytochrome C oxidase subunit I）序列，發現不同物種之間的COI序列差異足以用來區分大多數動物物種，尤其是在昆蟲和其他一些動物群體中，并明確提出使用短的DNA片段來快速準確地識別物種的概念[71]。2003年首次提出了國際生命條形碼計劃（iBOL，International Barcode of Life Project）[73]。成為DNA條形碼需滿足以下條件：（1）DNA片段必須是一個標準片段，以確定可能的不同類群；（2）目的DNA區域應含有足以確定該物種在該分類系統（科、屬等）中的系統發育信息；（3）應有保守的引物設計區域，方便設計一般引物；（4）有足以區別不同種類的變異；（5）目的 DNA片段應足夠短，以促進DNA片段的擴增。目前，用于菌物研究的備選片段有COI、nrDNA-LSU、 nrDNA-SSU、ITS和trnL[74-78]。

3.1 COI

COI基因是第一個生物 DNA條碼，它已應用于動物的物種鑒定，其在真菌中也得到了應用[79]。但COI是線粒體內含子數量最多的一種，其內含子長度可在20 kb以上，限制了其擴增效率。因此，COI基因不宜用作食用菌的條形碼[80-81]

3.2 ITS

ITS序列在食用菌的快速鑒定中有著廣泛應用，并且已成為食用菌物種鑒定的通用條形碼[82]。ITS序列在食用菌物種間的差異明顯，而在同一物種不同個體之間的差異很小，是真菌分類的可靠分子標記，能夠有效區分不同物種[83]。有研究顯示，ITS序列可作為木耳屬22個菌株的DNA條形碼[84]。ITS序列作為DNA條形碼，能夠快速準確地鑒定傘菌類真菌[85]。利用DNA條碼技術對來自不同產地的24份黑木耳樣品進行了產地溯源研究。結果顯示，ITS條碼能夠清晰溯源東北和未知地的樣品[86]。使用紫芝Ganoderma sinense S2基因組rDNA的ITS2生成的 DNA條形碼與二維碼，可以作為該栽培品種鑒定與同源物種其他菌株鑒定的分子標記[87]。

3.3 其他蛋白編碼DNA條形碼片段

ITS條形碼有時會出現種間變異較小的問題，其他一些蛋白編碼基因也常用來作為食用菌菌種的DNA條形碼。ITS、28S rDNA和EF-1α（elongation factor-1α，翻譯延伸因子）基因作為候選DNA條形碼標記，測試側耳屬13個物種的菌種鑒定效果。研究結果顯示，EF-1α基因在食用菌物種鑒定中表現最佳，它能夠區分84.6%的測試物種，并且在PCR擴增和序列獲取方面具有較高的成功率[88]。使用ITS、β-tubulin（β-微管蛋白）片段、LSU（large subunit，核糖體RNA大亞基基因）片段和RPB2（RNA polymerase second largest subunit， RNA聚合酶Ⅱ第二大亞基基因）4個DNA條形碼，對44份靈芝屬Ganoderma菌株進行PCR擴增和測序。結果表明β-tubulin和RPB2片段的種內最大遺傳距離分別小于各自的種間最小遺傳距離，存在明顯的DNA條形碼間隔（DNA barcoding gap，DBG），有利于準確進行種間鑒定。綜合評估認為，β-tubulin片段更適用于靈芝屬種間鑒定，為靈芝快速分子鑒定和系統發育分析提供了有效工具[89]。利用DNA條形碼技術對常見食用真菌及易混淆的野生有毒真菌進行分子鑒定，發現ITS2、nr LSU和EF1-α可以作為DNA條形碼，有效區分食用真菌與有毒真菌[90]。

4 展 望

近年來，隨著高通量測序技術的不斷發展和成本的持續下降，在全基因組分析的基礎上結合測序或非測序技術如基因編輯技術能夠實現食用菌菌種的快速、準確鑒定。CRISPR-Cas12a系統可提供一種高特異性和高靈敏度的食用菌菌種鑒定方法，在推動下一代基于全基因組的物種鑒定技術發展中具有巨大潛力，該方法結合可視化熒光技術，甚至可以實現30 min內現場快速精準鑒定食用菌[91]。今后，應不斷優化、開發應用更多的基因編輯技術用于食用菌菌種的快速精確檢測。全基因組選擇（genomic selection，GS）即利用覆蓋全基因組的高密度分子遺傳標記進行的標記輔助選擇。基于全基因組測序數據篩選多態性分子標記，構建序列庫，進一步篩選出核心標記，結合生物信息學工具分析，能夠對食用菌菌種進行高效檢測[33-34，36，92]。面對海量的測序數據，人工智能 （artificial intelligence，AI），特別是機器學習（machine learning，ML）逐漸被引入到生命科學領域[93]。機器學習作為人工智能的一個重要分支，具有強大的數據處理和分析能力，在全基因選擇中表現出色，能夠處理大量的遺傳標記并有效減少擬合。機器學習已被成功應用在植物SNP標記篩選中[94]，為食用菌菌種分子生物學檢測提供了寶貴經驗。同時，食用菌菌種的分子生物學檢測方法可與基于機器學習的食用菌表型組學分類與識別技術相結合，更全面、更快速有效地識別食用菌品種，相較于傳統的形態學鑒定，在準確度、無損檢測、自動化、適應性和可擴展性方面都具有顯著優勢。機器學習方法也被引入植物DNA條形碼分析中[95-97]，這為基于機器學習的食用菌菌種DNA條形碼檢測提供了方法學參考和有益借鑒。

此外，DNA條形碼信息可以跨平臺轉換，即利用開源代碼將這些DNA條形碼序列轉換成二維碼圖片[98]。這些二維碼可以被掃描并提交到食用菌菌種DNA條形碼數據庫進行鑒定，從而確保食用菌菌種的真實性和質量。該體系有助于提高食用菌菌種流通監管的效率和準確性，推動菌種流通監管的現代化和國際化。

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