蛋白氧化對豬皮明膠乳化性能的影響

摘 要：為研究氧化對豬皮明膠乳化性能的影響，將豬皮明膠與不同濃度（0、10、20、30 mmol/L）過氧化氫溶液孵育進行模擬氧化，并利用氧化處理后的明膠制備乳液。結果表明：隨著過氧化氫濃度的增加，明膠乳化活性指數從未氧化組的21.1 m2/g增加到30 mmol/L過氧化氫組的34.3 m2/g，乳化穩定性指數隨著過氧化氫濃度的增加而下降；此外，氧化程度的增加還導致明膠水接觸角的增大，促進明膠在油-水界面的吸附，降低油-水界面的界面張力；氧化后乳液的Zeta電位值從未氧化組的9.61 mV下降到30 mmol/L過氧化氫組的5.94 mV，表明乳液液滴間靜電斥力減小；激光掃描共聚焦顯微鏡觀察表明，氧化明膠穩定的乳液液滴表現出較小的尺寸。綜上，氧化處理增加了明膠的疏水性，促進了明膠在油-水界面的吸附，降低了油-水界面的界面張力，從而有利于形成較小的液滴尺寸，增強明膠的乳化活性。然而，乳液液滴間靜電斥力的降低增加了油滴的絮凝和聚集，降低了乳化穩定性。

關鍵詞：明膠；氧化；乳液；界面張力；乳化性能

Effect of Protein Oxidation on Emulsifying Properties of Porcine Skin Gelatin

XU Wanjun， GOU Hao， ZHAN Shuai， ZHANG Yaqi， BAO Yulong*

（School of Food and Biological Engineering， Jiangsu University， Zhenjiang 212013， China）

Abstract： In order to investigate the effect of oxidation on the emulsifying properties of porcine skin gelatin， porcine skin gelatin was incubated with different concentrations of hydrogen peroxide （0， 10， 20 and 30 mmol/L） for simulated oxidation， and an emulsion was prepared by using the oxidized gelatin. The results showed that with increasing hydrogen peroxide concentration up to 30 mmol/L， the emulsifying activity index （EAI） increased from an initial level of 21.1 m2/g （unoxidized） to 34.3 m2/g. The emulsion stability index （ESI） decreased with the increase in hydrogen peroxide concentration. In addition， increasing oxidation degree led to an increase in the water contact angle of gelatin， which promoted the adsorption of gelatin at the oil-water interface and reduced the interfacial tension at the oil-water interface. Compared with the unoxidized group， the zeta potential value decreased from 9.61 to 5.94 mV after oxidation with 30 mmol/L hydrogen peroxide， indicating that the electrostatic repulsion between emulsion droplets decreased. Confocal laser scanning microscope （CLSM） showed that the emulsion droplets stabilized by oxidized gelatin was smaller in size. In summary， the oxidation treatment increased the hydrophobicity of gelatin， promoted its adsorption at the oil-water interface， and reduced the interfacial tension at the oil-water interface， which was conducive to the formation of smaller droplet size and enhanced the emulsifying activity of gelatin. However， the decrease in electrostatic repulsion between emulsion droplets increased the flocculation and aggregation of oil droplets and weakened the emulsion stability.

Keywords： gelatin; oxidation; emulsion; interfacial tension; emulsifying properties

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240713-182

中圖分類號：TS251.5 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2024）11-0012-06

引文格式：

徐萬軍， 茍浩， 詹帥， 等. 蛋白氧化對豬皮明膠乳化性能的影響[J]. 肉類研究， 2024， 38（11）： 12-17. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240713-182. http：//www.rlyj.net.cn

XU Wanjun， GOU Hao， ZHAN Shuai， et al. Effect of protein oxidation on emulsifying properties of porcine skin gelatin[J]. Meat Research， 2024， 38（11）： 12-17. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20240713-182. http：//www.rlyj.net.cn

明膠因其出色的凝膠特性、乳化特性、發泡特性等在食品、醫藥等領域得到廣泛應用[1-2]。眾所周知，蛋白質的結構決定了其功能特性[3]。研究人員已經探索了各種方法來改善蛋白質的乳化性能，包括物理、化學和酶修飾等方法[4-6]。通過對明膠分子的修飾可以提高其乳化性能，并擴大其作為天然乳化劑的使用范圍。據報道，蛋白質的乳化性能與其表面疏水性有很大的關系[7]。有研究用氧化亞油酸對墨魚皮明膠進行改性，發現改性明膠表面疏水性的增加降低了油-水界面的界面張力，增強了改性明膠的乳化性能[8]。Feng Xin等[9]也利用微波技術提取明膠，發現隨著微波提取溫度的提高會導致其α亞基的降解和明膠三螺旋結構的減少，暴露出更多疏水基團，從而增加蛋白質向油-水界面的遷移并降低油-水界面的界面張力，提高其乳化性能。Yan Huimin等[10]將明膠分別與帶正電荷的精氨酸和帶負電荷的天冬氨酸混合形成絡合物，以期與大豆油混合并產生穩定的水包油乳液。研究發現，精氨酸和天冬氨酸在明膠分子中可以充當氫鍵的供體和受體，增加其三螺旋結構的比例，從而在連續相中形成更加緊湊的網絡結構，提高明膠乳液的穩定性。此外，明膠的乳化性能與乳液液滴的表面電荷也有關聯。當界面蛋白分子帶高電荷時，由于液滴之間的靜電排斥，乳液的穩定性得到提高。相反，液滴之間靜電斥力的下降容易發生絮凝[7]。Liu Huihua等[TASxQlHDlA0ih16LtT5uhw==11]通過調節溶液的pH值觀察對明膠性能的影響。結果發現，適當的靜電排斥可以促進蛋白質分子的去折疊，促進其向界面的遷移，從而提高乳化活性，然而乳液液滴間較弱的靜電斥力也引起乳液穩定性的下降。

蛋白質在加工和貯藏過程中可能會發生氧化修飾，引起結構發生改變，從而影響蛋白質的功能特性[12]。Li Helin等[13]從米糠中提取不同酸敗程度的米糠蛋白制備乳液。該研究發現，過度氧化降低了米糠蛋白的界面壓力、擴散速率和界面膨脹模量，從而增加了米糠蛋白乳液的不穩定性。Chen Nannan等[14]研究氧化對大豆分離蛋白乳化性能的影響，認為氧化引起大豆分離蛋白結構的展開，暴露出更多的疏水基團并形成結構更加靈活的可溶性聚集體，這些可溶性聚集體很容易附著在界面上并形成更厚的吸附層，從而產生更好的乳化性能。目前，有關明膠氧化對其功能特性影響的研究較少。在之前的一項研究中，發現氧化導致明膠凝膠機械強度和持水能力下降。氧化誘導蛋白疏水性增加和凈電荷減少，從而促進明膠分子之間的聚集，進一步限制了三螺旋結構的形成，導致松散的網絡結構，最終削弱了凝膠強度和持水能力[15]。然而，乳化特性等其他功能特性也受到蛋白質氧化的影響。因此，本研究的目的是探究氧化對豬皮明膠乳化性能的影響，以期為明膠在乳液制備方面的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

A型豬皮明膠（貨號V900863）購自Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司。所有其他化學品均為分析級，購自國藥集團化學試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

UW220D電子天平 島津儀器（蘇州）有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市金分儀器有限責任公司；

H1850R臺式高速冷凍離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；TGL-16gR高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠；Marvin激光粒度分析儀 英國Malvern集團；Unique-R10超純水凈化系統 廈門銳思捷水純化技術有限公司；T10均質器 德國IKA集團；DSA100E液滴形狀分析儀 德國Krüss公司；TCS SP6激光掃描共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM） 德國Cambridge集團。

1.3 方法

1.3.1 明膠樣品的制備

將明膠粉與去離子水混合后，在室溫下靜置30 min，然后放入60 ℃水浴鍋中30 min并用玻璃棒攪拌以完全溶解明膠，制得100 mg/mL明膠溶液，室溫冷卻后用0.1 mol/L NaOH溶液調節pH值至7.0。將明膠溶液（100 mg/mL）與不同濃度的過氧化氫溶液（10、20、30 mmol/L）混合，使明膠最終質量濃度為70 mg/mL，對照組用蒸餾水替代過氧化氫溶液。為了充分氧化，將樣品60 ℃水浴90 min，冷卻至室溫，并在4 ℃下保存24 h，然后測定相關指標。

1.3.2 乳化性能測定

參考Pan Jinfeng等[16]的方法。將1.3.1節制備的明膠溶液稀釋至5 mg/mL，然后將8 mL明膠溶液與2 mL玉米油混合，使用均質器在14 000 r/min條件下將混合物均質化，在均質0 min和10 min后分別從試管底部取新鮮制備的乳液（30 μL），并與0.1 g/100 mL十二烷基硫酸鈉溶液（3 mL）混合。隨后，在500 nm波長處測定混合溶液的吸光度。乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）分別按式（1）、（2）計算：

（1）

（2）

式中：A0為均質0 min乳液制得混合溶液在500 nm處的吸光度；n為乳液稀釋倍數；ρ為明膠質量濃度/（mg/mL）；

φ為乳液中玉米油的體積分數（0.2）；I為比色皿厚度（0.01 m）；A10為均質10 min乳液制得混合溶液在500 nm處的吸光度；Δt為時間間隔（10 min）。

1.3.3 水接觸角測定

在室溫下，將1.3.1節制備的明膠溶液150 μL均勻涂抹在顯微鏡載玻片上，放置1 h后形成明膠膜。隨后，用內徑為1.823 mm的注射器針吸附一定體積的去離子水，然后將注射器固定，在明膠膜表面加入1 滴去離子水。明膠膜表面的水接觸角采用液滴形狀分析儀的無柄液滴法測量。用微量注射器將超純167694b3d64aec5bc3b00e71a11788fc水（5 μL）滴入明膠膜表面，立即記錄側視圖并計算水接觸角。

1.3.4 明膠吸附率測定

參考Tian Yan等[17]的方法，并稍作改動。將1.3.2節新鮮制備的乳液在20 ℃下以12 000 r/min離心30 min后，將油滴和吸附在油滴上的蛋白質從水相中分離出來。隨后，用注射器抽取離心管底部的溶液，并用0.22 μm濾膜過濾。明膠吸附率按式（3）計算：

（3）

式中：ρi為乳液中明膠初始質量濃度/（mg/mL）；

ρf為乳液濾液中明膠質量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 界面張力測定

使用液滴形狀分析儀通過懸滴法測定明膠樣品的界面張力[18]。使用內徑為1.823 mm的注射器針頭吸附一定體積的明膠溶液，然后將注射器針頭插入含有玉米油的透明石英比色皿中，通過電動注射裝置注入明膠溶液，在針尖形成液滴。通過液滴形狀分析確定界面張力。

1.3.6 Zeta電位測定

從試管底部取新鮮制備的乳液30 μL，并與3 mL去離子水混合。乳液的Zeta電位由激光粒度分析儀測定。每個樣品重復測定6 次。

1.3.7 乳液微觀結構觀察

將1 mL新鮮制備的乳液與40 μL熒光染料（0.11 g/L尼羅紅和10 g/L尼羅藍）混合，玉米油和明膠分別用尼羅紅和尼羅藍來標記。將混合物渦旋約30 s，并在黑暗條件下孵育5 min。熒光染料的溶劑為98% 1，2-丙二醇溶液。使用帶有63×油物鏡的CLSM觀察樣品。乳液樣品分別在480 nm和633 nm處被激發，在600～660 nm（尼羅紅）和660～700 nm（尼羅藍）處被檢測到。CLSM的掃描頻率為100 Hz，掃描密度為1 024×1 024。玉米油和明膠的CLSM圖像分別以綠色和紅色呈現。

1.4 數據處理與分析

所有實驗數據的統計分析均使用SPSS Statistics 17.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行，并且結果均以平均值±標準差表示。對數據進行單因素方差分析，采用最小顯著性差異檢驗分析數據間的差異性，顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 氧化對明膠乳化性能的影響

明膠的EAI反映蛋白質快速遷移到油-水界面并形成小液滴的能力[14]。如圖1A所示，隨著過氧化氫濃度的增加，明膠的EAI增加，從未氧化組的21.1 m2/g增加到30 mmol/L過氧化氫組的34.3 m2/g，增加50%左右。有研究[19]表明，肌原纖維蛋白被氧化后，其EAI也會提高。這與本研究中氧化明膠EAI的結果一致。氧化肌原纖維蛋白EAI的提高與氧化誘導蛋白質中更多的疏水基團暴露有關，蛋白質中疏水基團的暴露增強了蛋白質與油滴的相互作用，從而表現出更好的EAI。據報道，米糠酸敗誘導米糠蛋白質發生適當氧化后，氧化修飾促進了蛋白質的部分展開，也增加了蛋白質中疏水基團的暴露，從而提高米糠蛋白的EAI[13]。一些研究還發現轉谷氨酰胺酶修飾明膠后，轉谷氨酰胺酶中ε-（γ-谷氨酰基）-賴氨酸異肽鍵的插入和ε-氨基的缺失可能會增加明膠的表面疏水性，從而提高明膠的乳化性能[20]。

小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

明膠的ESI可以反映蛋白質吸附到油-水界面后穩定油滴的能力。如圖1B所示，隨著過氧化氫濃度的增加，明膠的ESI下降，未氧化組的ESI為18.7 min，30 mmol/L過氧化氫組為14.1 min，下降4.6 min。Tian Yang等[21]探究丙二醛的氧化修飾對蛋黃高密度脂蛋白的結構和乳化性能的影響，發現丙二醛會與蛋白質發生席夫堿反應后聚集并形成氧化聚集體，降低蛋白質分子的柔韌性和乳液界面的穩定性，最終導致蛋白質乳化能力下降。這與本研究中氧化明膠乳化穩定性的結果一致。Liu Huihua等[11]

研究不同pH值條件對明膠乳化性能的影響，認為油-水界面層明膠分子之間相互排斥作用隨著pH值的增加而降低，油滴之間相互排斥作用的減少有利于它們的聚集，從而表現出較弱的乳化穩定性。

2.2 氧化對明膠水接觸角的影響

水接觸角可以反映明膠的表面兩親性[21]。如圖2所示，隨著過氧化氫濃度的增加，明膠水接觸角增加，從未氧化組的117°增加到30 mmol/L過氧化氫組的121°。水接觸角的增加可能歸因于蛋白質疏水性的增強。Feng Xin等[22]支持這一觀點，并表示利用噴霧干燥技術提取明膠后，明膠疏水性的增加提高了水接觸角。這可能歸因于噴霧干燥技術可以暴露出明膠中更多的疏水基團，從而表現出更好的疏水性能并改善明膠的兩親性，并且更有利于改善明膠的界面性能和乳化性能。Wang Jin等[23]將明膠和兒茶素混合制備納米顆粒，發現蛋白質-多酚納米顆粒的自組裝過程中，明膠的疏水基團暴露于水相，因此蛋白質-多酚納米顆粒表現出更高的疏水性能，從而牢固吸附在油-水界面上，提高乳液的穩定性。

A～D.過氧化氫濃度分別為0、10、20、30 mmol/L。

2.3 氧化對明膠在油-水界面處吸附率的影響

如圖3所示，乳液中油-水界面的明膠吸附率隨著過氧化氫濃度的增加而增加，從對照組的19.8%增加到30 mmol/L過氧化氫組的30.9%，增加1 倍左右，這表明更多氧化明膠分子吸附到油-水界面。Chen Jiahui等[24]對肌原纖維蛋白進行超聲處理，發現超聲處理改變了肌原纖維蛋白的結構，從而有利于形成尺寸更小、更靈活的聚集體，促進蛋白質在油-水界面的吸附，減少油-水界面的界面張力。在米糠蛋白的氧化中也觀察到類似的現象[13]。氧化導致米糠蛋白中暴露出更多的疏水基團，促進了蛋白質在油-水界面的吸附，形成黏彈性膜，降低界面張力，使液滴分裂成更小的尺寸。相似地，Zou Heinan等[25]利用高強度超聲處理減小了貽貝肌漿蛋白的尺寸并增強了其表面疏水性，從而增加了蛋白質在油-水界面的吸附。

2.4 氧化對明膠乳液油-水界面處張力的影響

兩親性蛋白質促進蛋白質吸附到油-水界面并降低油相和水相之間的界面張力，從而形成穩定的界面層[26]。如圖4所示，氧化組的明膠界面張力均低于對照組，這表明所有明膠樣品均具有表面活性。明膠在油-水界面處的界面張力隨著過氧化氫濃度的增加而降低。不同過氧化氫濃度下明膠的界面張力隨時間的延長逐漸降低，從未氧化組的53.8 mN/m下降到30 mmol/L組的50.7 mN/m。界面張力隨著吸附時間的延長而降低，下降速率逐漸減小，這反映了蛋白質在界面上的吸附和覆蓋[17]。明膠界面張力的下降與其更好的兩親性有關[9]。因此，在本研究中氧化導致明膠水接觸角的增加，提高了明膠的疏水性并改善了明膠的兩親性，增加了蛋白質向油-水界面的吸附，這可能引起油-水界面張力的下降。Feng Xin等[27]支持這一觀點并報道，在豬皮明膠的提取過程中提高提取溫度也會引起界面張力的降低，并認為隨著提取溫度的升高會破壞明膠原有的三螺旋結構，從而暴露出更多的疏水基團，這促使明膠分子能夠更快地吸附到油-水界面上，從而更大程度地降低界面張力。

2.5 氧化對明膠乳液Zeta電位的影響

如圖5所示，明膠乳液的Zeta電位隨過氧化氫濃度的增加而降低，對照組為9.61 mV，隨著過氧化氫濃度增加至30 mmol/L，Zeta電位降低至5.94 mV，降低40%。乳液液滴Zeta電位的降低也表現出液滴間較小的靜電斥力。據報道，靜電和空間穩定是蛋白質乳液液滴穩定的重要機制[28-29]。在本研究中，氧化明膠乳液ESI下降可能也與乳液液滴間靜電斥力的下降有關。Yang Yaqin等[30]通過探究pH值對蛋黃、蛋白乳化能力的影響支持這一觀點，發現當溶液的pH值接近蛋白質的等電點時，乳液液滴之間的靜電斥力會降低，從而加劇油滴的聚集。然而，也有研究[31]表明，虎河豚皮明膠的乳化性能也容易受到pH值的影響。該研究發現，對于pH 6的虎河豚皮明膠，明膠分子之間強靜電斥力可能會抑制蛋白質去折疊并阻礙蛋白質分子轉移到界面上，從而導致虎河豚皮明膠的EAI較低。而當虎河豚皮明膠pH值為8時，明膠分子之間較弱的靜電斥力可以促進蛋白質分子的去折疊并促進其向界面的遷移，從而提高EAI。此外，該研究表明，蛋白質分子間較強的靜電斥力還會破壞界面膜的穩定性，導致ESI降低。

2.6 氧化對明膠乳液微觀結構的影響

乳液通常是指將一相作為液滴分散在另一相中[32-33]。

如圖6所示，隨著過氧化氫濃度的增加，乳液的液滴尺寸減小，這可能與較少的蛋白質吸附到油-水界面層有關。據報道，EAI較高的蛋白質有利于吸附到油-水界面，減少油-水界面的界面張力并表現出更加小而密集的乳液液滴[34]。本研究中明膠吸附率及界面張力的測定結果可以支持氧化明膠更容易吸附到油-水界面這一觀點。

綠色和紅色分別表示油相和明膠。

3 結 論

探究不同濃度的過氧化氫（0、10、20、30 mmol/L）

模擬氧化對明膠乳化性能的影響。結果表明，豬皮明膠與不同濃度的過氧化氫混合后，隨著過氧化氫濃度的增加，豬皮明膠的EAI增加，而ESI降低，從未氧化組的18.1 min下降到30 mmol/L過氧化氫組的14.1 min。氧化導致明膠的水接觸角增加并且由氧化明膠穩定的乳液液滴間表現出更小的靜電斥力。綜上，氧化促進蛋白質在油-水

界面的吸附，降低油-水界面的界面張力，乳液的微觀結構也表現出較小的液滴尺寸，從而反映出更好的乳化活性。然而，乳液液滴間靜電斥力的降低增加了油滴的絮凝和聚集，也表現為明膠乳化穩定性的下降。因此，通過對上述研究結果的深入了解，可為明膠在食品加工中的改性應用及功能劣化的防控措施提供一定理論依據。

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收稿日期：2024-07-13

基金項目：江蘇省研究生科研與實踐創新計劃項目（SJCX23_2052）

第一作者簡介：徐萬軍（1999—）（ORCID： 0000-0003-1619-9635），男，碩士研究生，研究方向為肉制品加工。

E-mail： xuwanjun1022@163.com

*通信作者簡介：包玉龍（1988—）（ORCID： 0000-0003-2911-7483），男，教授，博士，研究方向為肉制品加工。

E-mail： yulong.bao@ujs.edu.cn