臭氧脅迫下白蠟與銀杏幼苗的響應差異

摘要：為了明確大氣臭氧（03）濃度升高對木本植物的生長、生理生化特征的脅迫效應，本研究利用開頂式氣室（OTC），以典型綠化植物白蠟（Fraxinus chinensis）和銀杏（Ginkgo biloba）幼苗為研究對象，研究了3個臭氧濃度水平（環境濃度，AA；環境濃度+40nmol·mol-1，AA+40；環境濃度+80 nmol·mol-1，AA+80）下白蠟和銀杏的葉片數量、葉片面積、生物量、光合速率、碳水化合物和非結構性碳水化合物的變化差異。結果表明，累積熏蒸35、51d和71d后，對比AA試驗組，AA+40和AA+80濃度O3抑制了白蠟幼苗的葉片數量和葉面積生長，而促進了銀杏幼苗的葉片數量和葉面積生長，并促進了白蠟的光合速率；AA+40和AA+80濃度臭氧均抑制了白蠟和銀杏幼苗的葉片非結構性碳水化合物的含量和生物量。O3濃度升高和臭氧熏蒸時間延長，對白蠟和銀杏幼苗的葉片生長、光合速率和非結構性化合物累積整體呈抑制，但存在銀杏葉片生長和白蠟光合速率受到不同程度促進的情況。O3濃度升高會對白蠟、銀杏幼苗的生長和光合作用產生脅迫，其中白蠟的葉片生長狀態對O3脅迫更敏感，銀杏的光合速率對O3脅迫更敏感。

關鍵詞：白蠟；銀杏；臭氧脅迫；響應差異；開頂式氣室

中圖分類號：S792.95；S792.99 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）08-1710-10 doi：10.11654／jaes.2024-0206

隨著城市化發展進程加快，由工業廢氣和汽車尾氣排放出的揮發性有機物濃度升高，在高溫、光照條件下易形成臭氧（O3）。近年大氣監測數據表明，O3逐漸成為我國五大空氣污染物中唯一上升的氣體，目前03污染集中發生在我國發達地區，如京津冀、珠三角等地區，因其強氧化性O3會抑制植物生長，影響昆蟲授粉，造成糧食減產問等危機，還會損害人體健康，對環境、經濟和社會均造成不同程度的負面影響。

O3對植物的影響，首先會破壞植物的光合生理過程，其中包括對葉片色素、氣孔、光合速率等正常生理活動的抑制，嚴重脅迫葉片對光能的利用，影響光合產物的合成。關于O3污染的研究除了集中在糧食作物領域之外，研究人員對常規綠化樹木也開展了一系列研究試驗，我國已有許多研究表明O3脅迫會造成樹木不同程度的損傷，導致葉片發黃枯萎、葉片數量和葉片面積減少等可見傷害，還會破壞樹木的光合系統，造成生物量累積減少和根系傷害。碳水化合物是植物光合作用的主要產物，其在植物體內的存在形式分為結構性碳水化合物和非結構性碳水化合物兩類，非結構性碳水化合物包括可溶性糖和淀粉，其主要參與植物的生化反應過程。黃玉源等對三種南方樹木進行O3脅迫研究，發現O3污染造成植物葉片的葉綠素含量下降，從而導致光合速率下降；其次，酶活性也會受到O3的強氧化性破壞，導致細胞失活，從而影響植物的呼吸代謝、有機物質積累等功能。我國生態環境部發布的《環境空氣質量報告》表明，2022年我國平均大氣O3濃度均值約為80nmol·mol-1。相關學者的研究表明，O3可以引起白蠟、銀杏等木本植物傷害閾值在150 nmol·mol-1至環境O3濃度的2倍之間。在日常生活中，白蠟、銀杏等綠化樹木在應對氣候風險中扮演著重要角色，綠化樹木不僅可以吸碳造氧，還能吸附空氣中的污染物，尤其在O3濃度不斷升高的情況下，綠化植物可以作為一道綠色屏障。

本試驗采取開頂式氣室熏蒸，選取白蠟（Fraxi-nus chinensis）、銀杏（Ginkgo biloba）兩種典型綠化植物作為試驗材料，研究不同樹木類別對O3脅迫響應的表現，研究結果有望在未來不確定的氣候情況下，為綠化生態系統制定適應與抵御風險的應對策略，提供科學的理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗地點與試驗設計

本試驗于2022年6月在北京市延慶區唐家堡村野外試驗與示范基地（40.47°N，116.34°E）進行，該地區屬于大陸性季風氣候，年平均氣溫10℃，夏季平均氣溫22-25℃，年降水量443-550 mm，年日照時間2 700-2 800 h。開頂式氣室（OTC）為高3.0 m，邊長1.0 m的玻璃箱，正八面柱體，頂端不密封，氣體由鼓風機自下方管道進入，從位于氣室正中央的管道口勻速旋轉溢出，在氣室接觸植物后再由連通大氣的頂端開口溢出。高濃度O3由220 V小型O3發生器（HY003，濟南創成科技有限公司）電離純O2產生，通過高壓風機（1.1 kW，1 080 Pa，19 m3·min-1，CZR，豐達，上海），將高濃度O3與環境空氣混合后通入OTC內，使O3濃度增加。試驗期間各OTC的O3濃度由臭氧分析儀（Model 49i，Thermo Scientific，Waltham，美國）監測。玻璃箱內的物理環境包括光線、溫度、濕度、降雨等均接近于自然條件，便于模擬不同氣候因素的變化對植物生長的影響。

O3熏蒸實驗共設3組處理，其中一組開頂式氣室內不做任何O3輸入處理，為環境O3（AA），其余兩組開頂式氣室為環境O3的基礎上添加40 nmol·mol-103（AA+40）和80 nmol·mol-1 O3（AA+80），濃度設置參考了IPCC報告中模型預測未來五十年我國城市可將會達到的O3濃度閾值，每個處理隨機選擇3個開頂式氣室進行重復，氣室內均放置4盆受試植株。圖1為試驗期間3個處理下OTC內平均臭氧熏蒸濃度變化散點圖，處理時間為2022年6月27日至9月19日，共分為3個時期，試驗取樣及數據測量依次在03熏蒸第35天、第51天和第71天后進行，根據常規熏蒸試驗經驗，設置每日熏蒸03時長為10 h（08：00-18：00），雨天等特殊情況關閉熏氣設備。熏蒸結束后將植株置于熏氣裝置的自然O3濃度中，進行緩沖恢復。

1.2 供試材料

O3試驗選取的是兩種木本植物白蠟（Fraxinus chinensis、銀杏（Ginkgo biloba）的一年苗，2022年6月統一進行栽種，試驗土壤均來自延慶野外試驗基地內，土壤經過網篩，質地均一。試驗期間對苗木進行日常管理，澆水時間為每日停止熏蒸后，將開頂式氣室的門打開，保持通風狀態，第二日熏蒸開始之前關閉氣室門。于2022年4月19日和6月30日兩日，在當日停止熏蒸后進行施肥，每盆樹苗均勻施入10粒氮、磷、鉀復合肥顆粒。試驗熏氣期間進行除草和病蟲害管理，在各氣室內，除03濃度外其他環境因子保持一致。

1.3 指標測量

1.3.1 葉片生長參數

（1）葉面積

在測量前，使用Li3000c（LI-COR，Lincoln，美國）進行植物離體葉片的面積掃描，同時用直尺測量同一葉片的長度和寬度，可以計算出儀器掃描的實際葉片面積與直尺測量葉片長度和寬度之間的比例系數。開始熏蒸前，在每個氣室內，在白蠟和銀杏樣本植株中各選擇一株，挑選植株一片生長狀態良好的幼葉進行標簽固定，用以后期持續追蹤觀測，其間使用直尺進行葉片長度和寬度的測量。

（2）葉片數量

與葉面積觀測同時進行，開始熏蒸前，每個氣室內固定一株植物進行標記，對植株上的所有葉片進行計數。

1.3.2 葉片光合速率

在每一試驗植株頂部數出第五片長勢良好的葉片，無病蟲害，使用Li-6400便攜式光合作用測定系統（LI-COR，Lincoln，美國），在晴朗的天氣、光照均勻的條件下，測定不同臭氧濃度熏蒸下光合作用的光響應過程。選取葉面積追蹤測量的葉片，測量時間分別選定于植株受臭氧熏蒸后第35天、51天和第71天，采用Li-6400光合儀器配置的標準葉室測量植物C02響應曲線，選取CO2濃度為800 mg·m-3時的光合速率代表葉片光合作用進行統計。

1.3.3 生物量

在熏蒸結束后，對樣本植株進行全株采集，并按照不同器官進行分類，包括根、莖、葉，分別進行清洗，烘干稱量直至干質量穩定。

1.3.4 有效光合面積與碳水化合物

有效光合面積是指植物所有參與光合作用的葉面積，碳水化合物的積累根據植物的光合速率與有效光合面積共同決定，分別采用如下公式計算：

S有效=N葉片×S葉（1）

Cm（H2O）n=Pn×S合數（2）

式中：S有效、S葉分別為有效光合面積和平均葉面積，cm2；N葉片為葉片數量，個；Pn為光合速率，以CO2計，μmol·cm-2·s-1; Cm（H2O）n為碳水化合物，以CO2計，μmol·s-1。

1.3.5 非結構性碳水化合物

植物的碳水化合物可分為結構性碳水化合物和非結構性碳水化合物，其中非結構性碳水化合物由可溶性糖和淀粉組成，采用蒽酮比色法測定。

1.4 數據分析

采用SPSS軟件中的重復測量法分析臭氧和測量時期對葉片數量、葉面積、光合速率、生物量、碳水化合物等指標的交互作用，并對各測量時期不同指標的臭氧效應進行單因素方差分析，事后采用最小顯著性差異法（LSD）進行多重比較，各指標在方差分析的同時進行正態分布和方差齊性檢驗。文中制圖均使用Origin 2022和Adobe Illustrator軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 葉片

2.1.1 葉片形態

如圖2所示，AA+40和AA+80處理均對白蠟葉片數量產生抑制作用，熏蒸35 d和51d后，AA+40處理下葉片數量相對于大氣處理分別減少14.9%和4.81%，AA+80處理下葉片數量分別減少30.77%和8.71%，而熏蒸7ld后，AA+40處理（-12.27%）對白蠟葉片的抑制略高于AA+80處理（- 1.12%）。在不同臭氧熏蒸時長下，銀杏的葉片數量隨03濃度增加呈增加趨勢，熏蒸51d后，AA+40和AA+80處理下葉片數量顯著增加，分別增加71.57%和97.3%；熏蒸7ld后，AA+40和AA+80濃度下銀杏葉片數量分別增加26.58%和49.37%。

2.1.2 葉片面積

隨著臭氧濃度增加，白蠟的平均葉片面積隨著熏蒸時間延長呈下降趨勢，其中熏蒸35 d后，AA+40處理與AA+80處理對葉面積生長的抑制程度接近，見圖3。熏蒸51d后，相對于大氣處理，AA+40和AA+80處理下白蠟葉片面積分別減少13.27%和38.84%。在3個臭氧熏蒸時長下，AA+40和AA+80處理均對銀杏葉面積生長有所抑制，其中，熏蒸51d后對銀杏葉面積生長的抑制更嚴重（P=0.025），相對于大氣處理，AA+40和AA+80處理造成葉面積分別下降10.15%和20.35%。

2.1.3 有效光合面積

有效光合面積是植物葉片數量與平均葉面積的乘積，由圖4可知，在不同O3處理下，白蠟的有效光合面積均受到臭氧脅迫的抑制，熏蒸35 d和71d后，AA+40和AA+80濃度臭氧熏蒸對白蠟有效光合面積的抑制程度相近。而熏蒸71d后，AA+40處理比AA+80處理對白蠟有效光合面積的抑制程度更大，相對于大氣處理，AA+40處理和AA+80處理下白蠟的有效光合面積分別減少24.04%和23.96%。在不同O3處理下，AA+80處理比AA+40處理對銀杏葉片有效光合面積的促進作用更大。AA+80處理下，隨著熏蒸時長增加，葉片的有效光合面積逐漸增加，第35、51、71天熏蒸下，相對于大氣處理，銀杏光合有效面積分別增加34.34%、31.86%、25.89%。

2.2 光合速率

由圖5所示，不同03熏蒸時長下，AA+40處理和AA+80處理對白蠟的光合速率產生了促進作用，白蠟在熏蒸35 d后，AA+40處理造成白蠟葉片光合速率下降33.84%，其余處理均促進了白蠟葉片的光合速率。

不同濃度的O3處理對銀杏的光合作用主要表現為抑制，見圖5，在熏蒸35 d后，AA+40和AA+80濃度O3均對植物的光合作用產生略微促進作用。在熏蒸51、71d后，AA+40和AA+80處理對比AA銀杏光合速率均有不同程度的下降，尤其在AA+80處理下，光合速率下降顯著，表現為熏蒸71d后，相比AA降低了51.64%。

2.3 生物量和碳水化合物

植物生物量的積累和葉片的碳水化合物因O3濃度和種植物類別差異而有所不同，如表1所示，在O3熏蒸71d后，AA+40處理能夠促進白蠟根的生物量積累，而AA+80處理會削弱白蠟根的生物量積累。對于銀杏來說，隨著03濃度的升高，根的生物量也隨之減小。其中白蠟、銀杏的莖和葉生物量受到O3脅迫的影響趨勢不如根明顯，隨著O3濃度升高，白蠟的莖生物量略微升高，銀杏的莖生物量略微降低。兩種植物的葉器官在受到O3脅迫下表現一致，AA+40處理和AA+80處理均會造成植物葉片生物量的降低。

由圖6可知，在不同熏蒸時長下，AA+40處理和AA+80處理對植物合成碳水化合物能力的影響存在差異。在O3熏蒸35 d后，白蠟碳水化合物的積累能力分別下降了55.66%（AA+40）和23.7%（AA+80），熏蒸51d后，碳水化合物分別下降了70.81% （AA+40）和59.89% （AA+80）。在O3熏蒸71d后，相對于大氣處理，AA+40處理促進白蠟的碳水化合物增加10.1%，而AA+80處理造成白蠟的碳水化合物的積累能力下降7.01%。熏蒸35 d后，AA+40處理和AA+80處理均表現為促進銀杏碳水化合物的積累能力，相對于大氣處理，分別增加4.55%和60.48%，而在熏蒸51d和71d后，AA+40處理和AA+80處理均對銀杏碳水化合物的積累能力有所抑制，且在熏蒸51d時的抑制作用最明顯，相對于大氣處理，碳水化合物的積累分別下降63.05%和40.48%。

由碳水化合物與葉片數量、葉面積、光合速率的相關性分析結果（表2）發現，白蠟、銀杏的光合速率與碳水化合物呈顯著性相關，葉片數量、葉面積與碳水化合物之間不相關。有效光合面積是葉片數量和葉面積的乘積，在兩種植物中與碳水化合物也未表現出較強的相關性。

2.4 非結構性碳水化合物

O3對非結構性碳水化合物的影響（圖7和圖8）具體表現為白蠟在熏蒸35 d和71d后，AA+40和AA+80處理下葉片的淀粉含量整體呈下降趨勢，而在熏蒸51d后，AA+40和AA+80處理均對白蠟葉片淀粉的積累略有促進作用，其中淀粉含量上升，而可溶性糖含量下降。對銀杏而言，在熏蒸35 d和71d后，AA+40處理促進了植物淀粉的積累；銀杏熏蒸51d后，O3濃度升高促進了淀粉的水解，其中淀粉含量下降20.6%；3個熏蒸天數都表現出，隨著O3濃度的增加，促進銀杏可溶性糖的分解，在熏蒸第71d后，相對于大氣處理，AA+40和AA+80處理下銀杏可溶性糖含量分別下降4.11%和23.14%。

3 討論

3.1 AA+40和AA+80處理O3對植株葉片和生物量的影響

葉片數量變化不僅是由于植物器官成熟、衰落導致的正常生理現象造成，還可能是因為環境條件脅迫和生物因素導致其不正常脫落。在AA+40和AA+80處理下，白蠟葉片數量整體呈下降趨勢，這與白月明等、李品等，學者研究結果相一致，隨著O3濃度的升高和脅迫時間的延長，植物葉片的葉綠素含量會逐漸下降，抗氧化系統活性受到抑制，活性氧（ROS）水平積累，導致葉片受到損傷，進而影響其正常的生理功能，包括葉片生長。當O3濃度增加時，銀杏的葉片數量上升，且3個熏蒸時長下均表現為施加O3濃度處理促進了銀杏的葉片生長，之前的O3對月季光合作用的影響研究發現短期內AA+60處理促進了月季的暗反應發生，加速CO2同化率從而促進月季生長，與本研究中O3促進植物葉片生長表現一致。此外，銀杏體內的黃酮有清除氧環境的作用，也表現出一定的抗氧化性。植物葉片生長和脫落還有許多其他影響因素，關于O3促進葉片生長或減緩葉片脫落的誘因還需要進一步研究。

當O3濃度增加，白蠟與銀杏的植物葉片面積表現為減小趨勢，且AA+40和AA+80處理下均為減小趨勢，這與之前的研究結果一致。由試驗結果可知，隨著O3濃度增加，白蠟的有效光合面積減小而銀杏的有效光合面積增加，其中銀杏的有效光合面積增加主要由于其葉片數量的增加，此外，也有可能是由于銀杏植株整體響應O3脅迫，表現出一定的形態補償效應。

植物的生物量在一定程度上表征植物的生產力，隨著O3濃度的變化，白蠟根的生物量變化差異明顯大于其他部分的生物量變化，且3個部分生物量變化趨勢存在差異，白蠟根的生物量在AA+40處理下對比AA處理有所增加，而AA+80處理下根的生物量有所下降，表明高O3熏蒸后根部碳積累減少。白蠟莖的生物量隨O3濃度的升高略微增加，葉的生物量隨O3濃度升高略微下降，與白蠟葉片數量受氧化脅迫脫落相一致r32l。AA+40處理和AA+80處理對銀杏3個部分的生物量積累均呈抑制作用，隨著O3濃度增加，3個部分的生物量呈下降趨勢。銀杏的葉片數量隨著03濃度增加，而生物累積量卻下降，可能是由于單個葉片的質量有所下降，葉片的碳物質量累計下降。值得討論的是，需要考慮不同取樣時間下植物新陳代謝的活性，第35、51天和71天的取樣時間分別接近八月、九月和十月，白蠟和銀杏生長速率隨著自然時節呈先上升后下降的趨勢，可能也對葉片生長及生物量的積累有一定影響。

3.2 AA+40和AA+80處理O3對植物光合速率的影響

O3對植物光合作用的影響主要體現在對光能的利用、光合速率以及氣孔行為的改變等方面。現有研究表明O3脅迫會導致植物的光合速率下降，影響光合產物的合成與降解。也有學者研究發現隨著O3濃度增加，植物的葉綠素含量隨之增加，葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，可能由于O3脅迫刺激了植物葉片的生理響應，通過葉綠素含量的增加促進了植物光合速率的增加。在本試驗中，AA+40處理和AA+80處理促進了白蠟的光合速率，其中熏蒸51d和71d后對光合速率的促進作用更顯著（P＜0.001）。在熏蒸前期（35 d），AA+40處理和AA+80處理對銀杏的光合速率有微弱的促進作用，而在熏蒸中、后期（51、71 d），AA+40處理和AA+80處理均對銀杏光合速率有顯著抑制作用（P＜0．05），這與已有研究結論一致，即長時間的O3濃度積累會抑制植物光合作用的效率H5）。

3.3 AA+40和AA+80處理O3對植株碳水化合物和非結構性碳水化合物的影響

碳水化合物在一定程度可以表征植物進行光合作用的能力，AA+40和AA+80處理O3熏蒸35 d和51d后，白蠟的碳水化合物的積累能力有所抑制。銀杏在03熏蒸前期（35 d），AA+40處理和AA+80處理下碳水化合物的積累能力有所促進，而熏蒸51、71d后，銀杏的碳水化合物的積累能力均受到抑制。整體而言，白蠟和銀杏的碳水化合物隨著O3濃度增加和脅迫時間延長，均受到不同程度的抑制，碳水化合物的積累能力由植物葉片的有效光合面積和光合作用效率共同決定，O3對白蠟的葉片生長和銀杏的光合速率均產生了不同程度的脅迫影響，綜合導致了這兩種木本植物的碳水化合物積累減少。

白蠟、銀杏的光合速率與碳水化合物之間均呈顯著性相關。碳水化合物是植物光合作用的產物，03對植物光合作用的影響主要導致碳水化合物累積量的變化，即其中光合速率由植物葉片結構（氣孔開度、色素細胞等）和生長環境（光照、溫度以及O2、CO2濃度等）共同決定，這些影響植物進行光合作用的因素與O3濃度升高的協同影響還需要進一步的試驗研究。

非結構性碳水化合物是植物進行正常生命活動的重要能源物質，其含量變化可以表征植物恢復生長和儲能的潛力，白蠟的淀粉含量在熏蒸中期（51d）略微受到促進，表明在此階段白蠟受到一定03濃度脅迫后，可能啟動了自身恢復補償機制，淀粉水解成可溶性糖可直接用于自身能量供應以維持正常光合，并修復O3損傷，提高抗性。銀杏葉片的淀粉含量在熏蒸前期（35 d）和后期（71 d），受到AA+40濃度O3的刺激，對比AA處理淀粉含量增加，可能由于低、中O3濃度促進了銀杏的光合作用，從而促進淀粉含量的積累。可溶性糖對于植物的調節和指示相對復雜，其既是植物光合作用的直接產物，還參與了其他的植物生命活動，如植物細胞的滲透調節與環境適應。在熏蒸前期（35 d），AA+80處理對白蠟的可溶性糖含量產生了促進作用，而銀杏的可溶性糖含量變化在3個熏蒸時期下，受到AA+40處理O3熏蒸的影響較小，這與之前對銀杏葉片的光合作用研究結論相符。

4 結論

本試驗中，白蠟和銀杏兩種木本植物幼苗對環境濃度+40 nmol·mol-1和環境濃度+80 nmol·mol-1處理03脅迫響應表現存在差異：

（1）形態響應表現為O3脅迫下白蠟的葉片數量變化不顯著，葉片面積下降，有效光合面積下降；而銀杏的葉片數量上升，葉片面積呈現下降趨勢，有效光合面積增加。

（2）白蠟的光合速率隨著O3濃度增加而增加，而銀杏的光合速率隨著O3濃度增加而減小。

（3）白蠟和銀杏的淀粉和可溶性糖含量均受到O3脅迫呈下降趨勢，不同熏蒸時期下，環境濃度+40nmol·mol-1和環境濃度+80 nmol·mol-1處理促進了非結構性碳水化合物含量的增加。

整體而言，環境濃度+40 nmol·mol-1和環境濃度+80 nmol·mol-1處理對白蠟的光合速率影響較弱，環境濃度+40 nmol·mol-1和環境濃度+80 nmol·mol-1處理對銀杏的葉片生長影響較弱。此外，由于本試驗03熏蒸時間較短且植株是一年期幼苗，具體響應差異機理還需進一步探索。

（責任編輯：葉飛）

基金項目：國家自然科學基金項目（32101359，31971509）；中國農業科學院科技創新工程