高丹草在低濃度銅-鎘-菲復合脅迫下的生長及響應特性

摘要：針對焦化廠等工礦廢棄地殘留的重金屬-多環芳烴污染風險高、低成本綠色環保技術缺乏等問題，通過田間試驗，研究低濃度銅-鎘-菲復合脅迫下高丹草萌芽率，生物量，銅、鎘累積，菲去除及葉綠素含量的變化規律，探索其生長及污染物遷移累積等響應特性。結果表明：10 mg·kg-1菲和100 mg·kg-1銅復合脅迫可促進高丹草生長，莖葉和根系生物量分別增加14.7%和8.1%，5mg．kg、鎘抑制了高丹草生長。銅、鎘主要累積在高丹草根部，菲-銅復合脅迫可促進銅的遷移，且提高菲去除率40.6%，菲-鎘復合則阻礙了鎘的遷移。低濃度銅和菲可刺激葉綠素。合成，而銅、鎘復合脅迫造成葉綠素b含量下降。相關性分析證實高丹草生長、污染物遷移及葉綠素合成之間具有較強的相關性。研究表明，高丹草在低濃度銅-鎘-菲復合脅迫下可以生長，并在重金屬遷移、有機物代謝及葉綠素變化等過程中呈現脅迫響應。

關鍵詞：高丹草；菲；銅；鎘；葉綠素

中圖分類號：X173；X53 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）08-1753-07 doi：10.11654/jaes.2023-1020

2014年我國土壤污染狀況調查公報顯示，全國土壤環境狀況不容樂觀，重金屬污染物中鎘和銅的點位超標率分別達7.0%和2.1%，有機物中多環芳烴的點位超標率達1.4%。同年在全國30個省市開展的礦山地質環境監測結果顯示，山西省礦山采場達9.5萬hm2，居全國礦山開發占地總量的20.74%。山西省多地煤焦化產業的發展產生了大量退役工業廢棄地。隨著新常態下產業轉型升級，山西省工業廢棄地的修復工作已持續多年，部分地區自然生態基底初步恢復，并取得了一定的經濟和環境效益。盡管如此，修復后的土地仍殘留少量污染物，導致部分土地資源的浪費。歐靈芝等對高砷煤礦周邊旱作土壤重金屬污染評價的研究結果表明，鎘和銅處于輕度污染水平，但作物對其吸附能力較強，可能引起健康風險。由于多環芳烴和重金屬排放的共同來源，兩者往往形成復合污染，加劇修復難度。焦化廢棄地中多環芳烴和重金屬復合污染問題，更是受到了廣泛關注。

植物原位修復相對于其他物理、化學修復技術綠色環保且成本較低，同時不會產生二次污染，有利于污染區的長期生態恢復。其中，牧草因具有生長周期短、適應能力強、易栽培、可刈割等優點，成為修復植物的潛在選擇。高丹草相比于其他牧草，具銅有產量高、適應范圍廣、抗逆性強、動物易消化等特性，已作為我國畜牧業發展飼料的首選之一。Oh等的研究表明銅對高丹草的種子萌芽率有一定的影響，且銅易累積在其根系中。先露露等的研究表明鎘可抑制高丹草的光合作用，影響其正常生長。丁俊男等對土壤菲脅迫下高丹草幼苗葉片的光合作用進行了研究，結果表明，菲濃度為50 mg·kg-1時高丹草葉片光合作用所受影響較小，而土壤菲濃度提高至200mg·kg-1會造成高丹草葉片光合電子傳遞能力受阻。趙穎等研究了污灌區多環芳烴-砷復合污染土壤的植物修復效果，結果表明高丹草對多環芳烴的降解率超過99.5%，且具有一定的砷富集特性。由于多種重金屬和多環芳烴共存土壤中的植物生長特性及修復機理與單一污染土壤存在較大差異，且針對高丹草在低濃度復合污染土壤中的研究報道較少，因此有必要對其進行深入研究。

本試驗以高丹草為研究對象，選擇銅、鎘作為重金屬污染源，菲作為多環芳烴污染源，通過大田試驗，研究在不同組合的銅-鎘-菲低濃度脅迫下，高丹草的生長特性及其對重金屬累積遷移和菲去除特性，探索高丹草在低濃度復合污染土壤中的生長響應規律，以期為礦業廢棄地資源的開發利用提供有益經驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

高丹草種子購于太原市晉農種子有限公司，供試土壤采自某地農田未污染土壤，基本理化性質為：pH值7.84，堿解氮60.93 mg·kg-1，速效鉀126.57 mg·kg-1，速效磷2.05 mg·kg-1，有機質3.73 g·kg-1，Cu25.63 mg·kg-1， Cd 0.532 mg·kg-1。

乙醇、無水硫酸鈉、甲苯、尿素、苯酚、氫氧化鈉、次氯酸鈉、氯化鎘、硫酸銅等試劑均為分析純，菲（純度大于98％）購于西亞試劑（成都）。

1.2 試驗設計

1.2.1 污染物濃度選擇及污染土樣制備

依據我國《土壤環境質量農用地土壤污染風險管控標準》（GB 15618-2018）中農用地土壤中銅、鎘的污染風險篩選值及管制值，并依據文獻調研，選取菲濃度10 mg·kg-1、銅濃度100 mg·kg-1和鎘濃度5mg·kg-1作為低濃度復合污染的參考濃度。清潔土壤施入底肥后（氮肥0.30 g·kg-1、磷肥0.2 g·kg-1、鉀肥0.3 g·kg-1），邊噴灑邊攪拌加入污染物母液（2 mL 20mg·mL-1菲、5 mL 20 mg·mL-1鋼和2 mL 10 mg·mL-1鎘），制成所需濃度的污染土樣（10 mg·kg-1菲、100mg·kg-1銅、5 mg·kg-1鎘）備用。

1.2.2 復合污染條件下高丹草生長及累積遷移特性試驗設計

選擇飽滿的高丹草種子若干，用3%雙氧水浸泡殺菌30 min后反復沖洗，在蒸餾水中吸脹后播種于裝有80 g污染土壤的培養皿中，每皿放25粒種子，將培養皿置于25℃的光照培養箱培，以清潔土壤為對照，每個處理重復5次。種子露白視為發芽，每天觀察并統計種子發芽率。

從2022年7月26日至9月26日，為期2個月，通過大田試驗來研究復合污染下高丹草生長及修復特性。將高丹草種子在生化培養箱中催芽后播種于25cm×15 cm×15 cm的塑料盆中，每盆裝入配制好的污染土壤4 kg，一周后間苗，每盆留20株。塑料盆中立一根PVC管，用于透氣和澆水，保持60％田間持水量。設置單一菲、菲-銅復合、菲-鎘復合以及菲-銅-鎘復合污染實驗組，以未污染土壤+高丹草作為空白對照組，以單一銅、單一鎘污染組作為單一重金屬污染的對照組，分別記為PHE、PHE - Cu、PHE - Cd、PHE-Cu-Cd、CK、Cu、Cd，每個處理重復3次。植株生長2個月后，采集帶回實驗室，進行各指標的測定。同時收集土壤樣本，測定土壤中銅、鎘及菲的殘留量，用以評估高丹草對復合污染物的累積遷移特性。

1.3 分析測試方法

（1）干質量測定

植株收獲后，用蒸餾水洗凈、晾干，將根、莖、葉分開，105℃烘箱殺青1h后，置于70℃烘箱烘干至恒質量，稱量記為各部分干質量。

（2）菲和重金屬濃度測定

參考Ⅲ784-2016規定的多環芳烴提取方法對土壤樣品中的菲進行提取，提取液經二氯甲烷—丙酮提取以及二氯甲烷沖洗—正己烷洗脫，濃縮定容到2mL，過0.22 μm孔徑濾膜后采用LC-16型高效液相色譜檢測。檢測條件：C18反相柱，甲醇：水=90： 10（V/V），流速為1 mL·min-1，檢測波長為254 nm，注射量為10 μL，停留時間為5.6-6.2 min。

采用HNO3-HClO4將0.2 g植物干樣品250℃消解并煮至清亮，定容至50 mL后，采用電感耦合等離子體質譜儀（Nexion 1000，美國PerkinElmer）測定植物組織中的銅、鎘含量。土壤樣品中的重金屬采用島津AA-6800型原子吸收分光光度計測定。

土壤中污染物的去除率（剛采用公式（1）計算。

R=（C0-Ct/C0）×100％（1）

式中：C0為污染物初始濃度，mg·kg-1；Ct為試驗結束后土壤中污染物濃度，mg·kg-1。

重金屬在高丹草各組織中的轉移系數（TF）用公式（2）計算。

TF=M地上部分/M根部（2）

式中：M地上部分、M根部分別表示植物地上部分和根部的重金屬含量，mg。

（3）葉綠素含量測定

采用乙醇浸提比色法測定葉綠素含量。取新鮮植物葉片0.2 g，剪成2 mm寬的碎條，加入少量石英砂及8 mL 95%的乙醇避光浸提24 h，研磨沖洗至葉片變白，提取液過濾后將濾液用乙醇定容至25 mL，以95%乙醇為空白，采用UV-26001紫外—可見光分光光度計測定波長在665 nm和649 nm處的吸光度。采用Arnon公式計算葉綠素含量（C葉綠素，mg·g-1）。

Ca=13.95×A665-6.88×A649（3）

Cb=24.96×A649-7.32×A665（4）

C葉綠素=C×VT/m鮮×1000（5）

式中：Ca為葉綠素a的濃度，mg·L-1；Cb為葉綠素b的濃度，mg·L-1;C為葉綠素濃度，mg·L-1；VT為提取液體積，mL；m鮮為樣品鮮質量；葉綠素含量以樣品鮮質量計，mg·g-1。

2 結果與討論

2.1 高丹草在低濃度復合污染土壤中的生長特性

圖1A為不同脅迫下高丹草的萌芽情況，分析可知，低濃度的菲和銅對高丹草的萌芽率均有一定影響。與CK組相比，PHE中高丹草的萌芽數減少2個，相應萌芽率降低了9％，加入100 mg·L-1銅后，PHE-Cu中萌芽率降低至81%。鎘對高丹草萌芽率的抑制較為顯著，PHE-Cd中萌芽數降低至13個，萌芽率較CK組降低了35%。而PHE-Cu-Cd中高丹草萌芽率僅為71%。

圖1B為不同脅迫下高丹草的生物量變化，分析可知，在為期2個月的生長過程中，高丹草的生長未受到顯著抑制。低濃度菲對高丹草的生長有一定的促進作用。與CK組相比，PHE組中根、莖、葉的干質量分別提高了5.8%、6.2%和8.5%。馬麗等的研究表明，低濃度菲具有與植物生長激素（生長素和赤霉素）類似的環狀結構，從而可促進植物莖葉生長，趙海燕等的研究結果也表明低濃度菲對丹參根的生長具有促進作用。PHE-Cu對高丹草生長表現出促進作用，尤其對根系生長作用明顯，生物量較PHE增加了8.1%，這是因為銅是植物生長的必需微量元素之一。鎘對高丹草各部分的生長均表現出抑制作用，PHE-Cd中莖、葉生物量均下降了20%，這可能是因為鎘導致高丹草根系細胞質膜遭到嚴重破壞，從而造成生理功能紊亂。由于鎘的抑制作用，PHE-Cu-Cd中高丹草生物量下降了5.5%- 8.2%（P＞0.05）。

2.2 高丹草對復合污染物的累積遷移特性

高丹草對銅的累積情況如圖2A所示，分析可知，銅主要累積在高丹草根部，在CK組的比例可達74%，這與王佳樂等的研究結果一致。與CK組相比，銅脅迫造成根部累積量增加了9. 1%，TF系數為0.3，較CK組降低了13.7%，這可能是因為植物對銅的吸收促進了其從土壤向根部的累積和遷移。相關研究表明，銅作為植物所必需的微量營養元素，可參與合成植物生理代謝所需的酶和結構蛋白。PHE-Cu中根部銅累積量較其在莖、葉中的累積量降低了19.7%，這可能是由于植物對銅的吸收促進了高丹草根系向莖葉方向的營養輸配。由于鎘阻礙了植物葉綠素、糖及蛋白質合成，導致PHE-Cu-Cd處理高丹草的各組織中銅累積量較其他組偏小。

高丹草對鎘的累積情況如圖2B所示，分析可知，鎘在高丹草中也主要累積在根部（50.0%-70.8%），且各處理對莖、葉中鎘累積的影響較小。與CK組相比，鎘脅迫造成高丹草各組織中鎘累積量提升，TF為0.64。PHE-Cd組中根部鎘累積量提高了4.2%，但TF下降至0.59。Zhan等的研究表明，菲可與土壤中的H+以共軛體的方式結合，從而提高土壤pH值，導致土壤鎘活性降低，進而使植物對鎘的遷移轉運能力降低r2u。PHE-Cu-Cd處理根部鎘累積量降低了16.7%，這與梁瑞等的研究結果相似，即銅-鎘復合可能抑制植物對鎘的遷移。

高丹草生長2個月后測定了土壤中菲的去除率，結果如圖2C所示。PHE中菲的殘留量為1.56 mg·kg-1，PHE-Cu中菲的殘留量為0.93 mg·kg-1，較前者菲的去除率提高了40.6%，這可能與前述菲-銅復合共同促進高丹草的生長及營養遷移密切相關。而由于鎘抑制了高丹草的生長，削弱了其通過遷移作用去除菲的能力，造成PHE-Cd中菲殘留量較高，為1.57mg·kg-1。PHE-Cu-Cd中菲的殘留量最高，較PHE-Cd高出19.3%，這可能是因為銅、鎘互相作用抑制了植物對菲的遷移轉化。

2.3 復合污染對高丹草葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用的基礎物質，復合污染對植物的毒害作用可以通過對植物葉綠素含量的影響來表征。由圖3分析可知，與CK相比，菲促進了高丹草的葉綠素合成，PHE中葉綠素。和葉綠素b的含量分別增加了6.1%和8.3%。楊丹等的研究結果也表明，低濃度菲會刺激植物應激合成更多葉綠素。PHE-Cu中葉綠素a較CK增加了14.1%，葉綠素b降低了1.7%，這可能是因為銅作為葉綠素合成過程中部分酶的催化劑發揮了積極作用。葉綠素合成量的增加可能是上述菲-銅促進高丹草生長的重要原因。PHE-Cd中葉綠素a和葉綠素b較PHE分別降低了16.8%和1.5%，顯然葉綠素。的合成受到了較明顯的抑制。由于葉綠素b主要負責收集光能，葉綠素。負責將收集到的光能轉化為化學能，由此推斷，鎘可能導致高丹草的光能轉化系統受阻，這與先露露等的研究結果一致?；赑HE-Cu的促進作用，PHE-Cu-Cd中葉綠素。受到的抑制有所緩和，較PHE-Cd提高了6.9%，但葉綠素b下降了15.6%。相關研究表明，葉綠素b是由葉綠素a在葉綠素。加氧酶的催化下合成的，由此可推斷，銅、鎘復合脅迫可能對葉綠素。加氧酶的催化過程造成了損傷。葉綠素a/葉綠素b的結果進一步驗證了上述分析，與CK相比，PHE-Cu中葉綠素a/葉綠素b上升與菲和銅的促進作用相關，而PHE-Cd中葉綠素a/葉綠素b下降則與鎘對葉綠素a的合成抑制密切相關。

2.4 低濃度復合污染與高丹草的生長響應關系分析

為判斷各污染物對高丹草生長是否存在交互影響，采用式（6）計算高丹草根、莖、葉干質量的凈變化量（AM）。ΔM=0表示污染物間無交互作用；ΔM＞0表示各污染物間對植物毒害拮抗；ΔM＜0表示各污染物間對植物的毒性協同。

ΔM=（M1+2+3-MC）-（M1-MC）-（M2-MC）-（M3-MC）（6）

式中：Mc、M1+2+3、M1、M2、 M3分別代表CK、PHE-Cu、PHE-Cd、PHE-Cu-Cd復合污染及各PHE、Cu、Cd單一污染下植物的干質量。

表1為高丹草根、莖、葉在各復合脅迫條件下的ΔM。由表1可知，菲-銅復合作用下，高丹草的ΔM＞O，說明菲-銅對高丹草的毒害表現為拮抗作用。但從2.1節該脅迫條件下的生物量變化分析可知，根、莖、葉干質量均有不同程度的增加，說明該條件下的毒性作用不明顯。菲-鎘復合對高丹草的毒害表現為協同作用（∑ΔM=-8.86），而銅的加入使這種毒害作用有所緩解（∑ΔM=-4.99），尤其表現在對莖干質量的影響上。

采用Spearman相關矩陣，進一步研究了單一及復合污染情況下的高丹草生物量，菲去除，銅、鎘累積及葉綠素含量等的相關性。由圖4分析可知，高丹草的生物量與其中的銅累積呈正相關，并且與葉中的銅累積關系更為密切，這與銅促進高丹草生物量的規律相吻合。葉中銅累積與莖中銅累積（0．90）較其與根中銅累積（0．70）的相關性更強，這進一步驗證了銅對高丹草的促進作用可能歸因于其對光合作用的促進，尤其是對葉綠素的促進作用，這一點可從其葉中銅累積與葉綠素a（0.50）和葉綠素b（0.87）有較高的相關性得到驗證。同樣，與本研究鎘脅迫規律一致，根中鎘累積對生物量的增長具有強烈抑制，表現為負相關（-0.50-0.30），這可能是因為鎘較強的抑制毒性導致高丹草根際生態被破壞，表現為根中鎘累積抑制根干質量（-0.50）。此外，根中鎘累積對葉綠素。（-0.50）的抑制也可從中得到驗證。

3 結論

（1）高丹草在低濃度菲-銅-鎘復合污染土壤中的生長未受到顯著抑制，且低濃度菲和銅可分別促進葉片和根系的生物量增長，鎘對根系的抑制作用較明顯，但在可控范圍內。

（2）銅和鎘主要累積在高丹草根部，且銅和鎘脅迫均有促進根系銅、鎘向莖、葉遷移的現象，而菲脅迫導致銅的累積，并使銅從莖、葉向根系遷移。

（3）低濃度菲可促進葉綠素的合成，菲-銅復合進一步提高了葉綠素a的含量，菲-鎘復合使高丹草光能轉化系統受阻，抑制葉綠素的合成。

（4）交互影響分析結果表明，菲-銅對高丹草的生長表現為拮抗作用，而菲-鎘表現為協同作用。

基金項目：山西省基礎研究計劃青年項目（202203021222280）；山西省高?？萍紕撔马椖浚?022L549）