長期不同施肥措施對鹽堿地稻田土壤微生物數量和群落結構的影響

摘要：為闡明鹽堿地稻田長期不同施肥對表層土壤微生物數量和群落結構的影響，以大安站鹽堿地水稻長期定位施肥試驗土壤為對象，采用磷脂脂肪酸（PIFA）分析法研究了單施氮肥（N）、無機肥配施（NPK）、有機肥單施（M）、有機肥與無機肥配施（MNPK）和秸稈還田配施無機肥（RNPK）對土壤微生物數量和群落結構的影響。結果表明：不同施肥處理土壤中共檢測出57種PLFA生物標記，M、MNPK、RNPK和NPK處理的PLFA含量較N處理分別增加26.47%、29.76%、25.07%和13.20%，其中M、MNPK和RNPK處理顯著高于N處理（P＜0.05）。MNPK處理土壤中的真菌／細菌的比值最大，較二者之比最小的M處理高6.00%，說明有機肥配施化肥對鹽堿地稻田土壤生態系統的穩定性具有更好的改善作用。RNPK處理土壤中革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之比最小，較二者之比最大的M處理降低了13.71%，說明秸稈還田配施化肥處理的土壤營養脅迫小，能有效改善土壤的營養狀況。不同施肥處理微生物群落多樣性大小表現為N處理土壤的Shannon-Wiener多樣性指數（H）、Pielou均勻度指數（J）和Simpson優勢度指數（D）最大，分別較3項指數最小的NPK處理增加10.91%、12.00%和13.79%。冗余分析結果表明，鹽分電導率（EC）、有機質和pH對土壤微生物群落變化具有顯著影響，解釋量分別為54.8%、39.8%和33.1%。因此，長期有機肥與化肥配施、有機肥單施和秸稈還田配施無機肥能有效增加土壤微生物生物量并優化微生物群落結構，進而改善土壤生態環境。

關鍵詞：蘇打鹽堿地；水稻；有機培肥；土壤微生物；磷脂脂肪酸（PIFA）；秸稈還田

中圖分類號：S511；S154.3 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）08-1786-10 doi：10.11654/jaes.2023-0810

蘇打鹽堿土在我國東北松嫩平原西部廣泛分布，僅吉林省西部面積就高達153萬hm2。由于長期受干旱和半干旱氣候控制，加之過度放牧和人類活動的影響，該區域土壤鹽堿化加劇，植被退化嚴重。土壤鹽堿化不僅對植物產生滲透脅迫和離子毒害，造成土壤養分的匱乏或不平衡，也在一定程度上影響了土壤微生物的數量和群落結構，導致土地生產功能和資源利用率下降。此外，蘇打鹽堿土堿性強，鹽堿空間變異大，治理難度高，探尋科學合理的蘇打鹽堿地培肥措施對于提升土地生產力，改善土壤微生物群落結構，促進農田生態系統可持續發展具有重要意義。

長期以來，蘇打鹽堿土的治理措施主要包括土壤改良和植被修復，具體分為水利工程、農業耕作、化學改良及耐鹽堿植物篩選等。這些治理措施的實質皆是降低鹽堿危害或提高植物抗性。前人通過在蘇打鹽堿土治理中的不斷實踐，總結出“改土是前提，培肥是根本”的成功經驗。近年來許多研究者在開展蘇打鹽堿土改良的同時，也愈加關注土壤培肥問題。培肥的核心在于提升土壤肥力，而微生物的數量等參數是評價土壤肥力的重要指標。因此，開展不同培肥措施對土壤微生物的影響研究有利于全面認識土壤培肥的科學意義，對于生產實踐也具有重要的指導作用。

微生物在土壤中廣泛參與各種養分的循環轉化，它們的數量和群落結構通?？梢杂行Х从惩寥鲤B分和能量循環的活躍程度，微生物對土壤物質組分、理化性質和微環境等具有高度的響應特性。由于鹽堿土可溶性鹽離子濃度高、水熱條件差、可供微生物利用的C、N含量低等原因，其土壤微生物總量低于同生態區域的其他土壤，并且單一鹽分土壤的微生物數量低于復合型鹽分土壤。在農田生態系統中，土壤微生物的活躍程度常隨著施肥處理的改變而改變，朱桃川等分析發現，長期增施有機肥的鹽堿化土壤細菌群落多樣性顯著增加。也有研究指出，長期施用有機肥不僅可以促進微生物多樣性的增加，還會刺激某些特定微生物群體的增殖，使其參與并加速復雜有機化合物的降解。郭振威等則報道了秸稈還田配施有機肥可顯著改善土壤性質，增加土壤養分含量及微生物數量，從而達到優化土壤結構、提升土壤肥力的目的。

近年來，隨著微生物研究的快速發展，微生物技術在鹽堿土治理修復上也得到越來越多的應用。磷脂脂肪酸（PLFA）方法是一種常用的測定土壤微生物組成并定量的方法，是鑒定土壤中微生物的重要方法，雖有一定的局限性，但相較于耗時費力的平板微生物分離法、Biolog微平板法和價格高昂的16SrRNA方法，PLFA方法更加經濟、快捷、準確。李新等利用PLFA譜圖技術分析了河套平原的鹽堿土微生物數量，發現微生物總量與土壤含鹽量和堿化度呈顯著負相關，且鹽堿化程度越高，標記物多樣性越單一，說明以鹽堿為主導的土壤環境對微生物具有抑制作用。然而，鹽堿土對微生物的抑制作用能否通過施肥措施得到緩解或改善，迄今還未見報道。為此，本研究以鹽堿地水稻長期定位施肥試驗土壤為研究對象，采用PLFA方法擬探究不同施肥處理對鹽堿地稻田土壤微生物群落結構的影響，解析土壤鹽分、養分與微生物的互作關系，闡明不同施肥措施對蘇打鹽堿地稻田土壤微生物菌群的影響，以期為蘇打鹽堿地稻田科學施肥技術的建立提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

本研究基于吉林大安農田生態系統國家野外科學觀測研究站（簡稱大安站，45°35＇58＂-45°36＇28＂N，123°50＇27＂-123°51＇31＂E）的鹽堿地水稻長期定位施肥試驗進行。該站位于松嫩平原西部蘇打鹽堿土的典型分布區，土壤類型為蘇打型草甸鹽土或堿土，以及草甸鹽堿化土壤。氣候類型為溫帶大陸性季風氣候，全年光照充足，無霜期130-140 d，全年日照時數平均在3 000 h以上，年平均氣溫4.3℃，年平均積溫超過2 900℃，年均降雨量為350-400 mm。長期定位施肥試驗開始于2010年，共設有11個不同施肥處理，每個處理設有4個重復，小區完全隨機區組設計，面積為20 m2（5 m×4 m）。

1.2 試驗設計

本研究土壤采自長期定位施肥試驗的5個不同施肥處理，即單施氮肥處理（N）、無機肥配施處理（NPK）、有機肥單施處理（M）、有機肥與無機肥配施處理（MNPK）和秸稈還田配施無機肥處理（RNPK）。施肥處理的氮肥為尿素（含N 46.2％），施用量為N200 kg·hm-2；磷肥為普通過磷酸鈣（含P2O5 16%），施用量為P2O5 100 kg·hm-2；鉀肥為硫酸鉀（含K2O50%），施用量為K2O 100 kg·hm-2。M處理肥料為當地腐熟羊糞，施用量為30 t·hm-2; MNPK處理無機肥用量占75%，有機肥用量占25%，折合腐熟羊糞用量為10 t·hm-2; RNPK處理的無機肥用量與NPK處理相同，秸稈還田量為10t·hm-2，基本為秸稈全量還田。

土壤樣品采集于2022年6月水稻分蘗盛期進行，每個小區采集5點0-20 cm土壤混合樣。取部分鮮土樣放入-80℃冰箱內保存，樣品冷凍一周內進行PLFA的測定；其余部分土樣放置陰涼處風干后研磨過篩，用于測定土壤基本理化性質。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 土壤理化性質的測定

土壤pH值采用pH計（PHSJ-3F）測定，土壤電導率（EC）采用電導率儀（DDS-12DW）測定，土水比均為1：5。有機質含量采用重鉻酸鉀-硫酸外加熱法測定，速效磷含量采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定，堿解氮含量采用堿解擴散法測定，Ca2+、Mg2+、Na+、K+、CO2-3、HCO3、Cl-和SO2-4含量采用常規方法測定。對于數據異常的樣品進行反復多次測定，剔除異常值或以多次測定的平均值表示，具體測定方法參照《土壤農業化學分析方法》。

1.3.2 土壤微生物生物量的測定

用PLFA生物標記法測定土壤的微生物生物量，以甲酯19：0做內標，提取與分析方法參考文獻，檢測主要步驟為提取、分離、酯化和GC-MS分析，具體參照文獻[28]進行。

1.4 微生物標記物的分類

微生物標記物的分類參考已公開發表的文獻，具體分類結果總結列于表1。

1.5 微生物多樣性指數計算

本研究通過計算Shannon_Wiener、Pielou均勻度和Simpson優勢度對微生物多樣性進行分析。

（1） Shannon-Wiener多樣性指數（H）

H=-∑PilnPi

Pi=Ni/N

式中：Ni為處理i的特征PLFA的個數；N為該試驗中總特征PLFA的個數。

（2）Pielou均勻度指數（J）

J=-∑Piln Pi/ln S

式中：S為微生物群落中PLFA生物標記出現的頻次，即豐富度。

（3）Simpson優勢度指數（D）

D=1-∑Pi2

1.6 數據處理

數據處理采用Excel軟件，方差分析（ANOVA）采用SPSS軟件，相關性分析和熱圖繪制采用Origin2021，冗余分析（RDA）采用R（4.1.1）軟件。圖表中數據為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 土壤基本理化性質

不同施肥處理的土壤基本理化性質具有一定的差異（表2）。在5個施肥處理中，僅MNPK處理的土壤pH顯著低于NPK和RNPK處理（P＜0．05），其余4個施肥處理的土壤pH差異不顯著；N處理的EC顯著低于MNPK處理（P＜0．05），其余4個施肥處理的電導率差異不顯著。NPK處理土壤有機質含量顯著低于M和MNPK處理（P＜0．05），M處理土壤堿解氮和速效磷含量顯著高于N、NPK和MNPK處理（P＜0．05），以土壤速效磷含量為例，NPK、M、MNPK和RNPK處理的速效磷含量分別較N處理增加2.59、5.79、3.01倍和3.20倍。

2.2 土壤微生物PLFA含量

在所有施肥處理中總共檢測到了57種PLFA生物標記（表3）。在N、NPK、M、MNPK及RNPK中分別發現了52、50、50、51種和55種PLFA生物標記，總含量分別為（116.72±12.03）、（132.13±12.75）、（147.61±11.98）、（151.45±24.75） nmol·g-1和（145.98 ±19.36）nmol·g-1，N處理的總含量顯著低于M、MNPK和RNPK處理。RNPK處理土壤中PLFA生物標記種類最多，MNPK處理土壤中PLFA生物標記總含量最高。所有處理中，完全分布的PLFA生物標記有48種，不完全分布的PLFA生物標記有9種。在57種標記中，有顯著差異的共18種，其中MNPK處理和N處理之間存在15種具有顯著差異的標記，占83.33%。

2.3 土壤特征微生物類群PLFA含量

土壤微生物中細菌的PLFA含量最高，其次是真菌和放線菌（圖1）。MNPK處理的細菌含量最多[（121.18±17.50）nmol·g-1]，分別較M、RNPK、NPK和N處理增加3.25%、5.15%、16.00%和32.84%，在5個施肥處理中，僅MNPK處理細菌含量顯著高于N處理，其余4個處理細菌含量與N處理無顯著差異。MNPK處理的真菌含量最多[（16.60±2.37）nmol.g-1]，分別較RNPK、M、NPK和N處理增加6.07%、9.28%、19.86%和39.38%，MNPK處理土壤真菌含量顯著高于N處理，其他處理之間差異不顯著。放線菌含量在5個施肥處理間沒有顯著差異，真菌和細菌的PLFA含量比值（真菌／細菌）表現為MNPK＞RNPK＞NPK＞N＞M。

革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）之間PLFA含量有明顯差異（圖2）。革蘭氏陽性菌含量最多的M處理[（34.64±0.59）nmol·g-1]較含量最少的N處理增加0.32倍，M和MNPK處理革蘭氏陽性菌含量顯著高于N和NPK處理（P＜0.05）。革蘭氏陰性菌含量最多的RNPK處理較最少的N處理增加了0.30倍，5個處理之間，革蘭氏陰性菌含量無顯著差異（P＞0．05）。革蘭氏陽性菌與革蘭氏陰性菌之比（G+/G-）表現為M＞MNPK＞N＞NPK＞RNPK。

2.4 土壤微生物群落多樣性指數

微生物群落多樣性指數在不同施肥處理中沒有顯著性差異（表4）。N處理的H／指數、J指數和D指數均最大，其中H指數較M、MNPK、RNPK和NPK處理分別增加1.67%、3.39%、5.11%和10.91%，J指數較M、MNPK、RNPK和NPK處理分別增加1.82%、3.70%、5.66%和12.00%，D指數較M、MNPK、RNPK和NPK處理分別增加3.12%、6.45%、10.00%和13.79%，表明不同施肥處理間土壤微生物群落的3種多樣性指數具有相同的變化趨勢。

2.5 土壤微生物數量、群落結構與土壤理化性質的關系

為進一步了解土壤環境因子對微生物群落的影響，將土壤環境因子與微生物群落進行RDA分析（圖3），結果表明微生物群落與土壤環境因子指標生物RDA分析中前兩個排序軸總共解釋了群落變化的8 3.62%，其中第一排序軸解釋了55.16%，第二排序軸解釋了28.46%。土壤環境因子對土壤微生物群落變化影響大小順序為EC（r2=0.548）＞土壤有機質（r2=0.398）＞pH（r2=0.331）＞Na+（r2=0.293）＞HCO-3（r2=0.277）＞K+（r2=0.205）＞SO2-4（r2=0.186）＞Cl-（r2=0.138）＞速效磷（r2=0.070）＞Ca2++ Mg2+（r2=0.051）＞CO2-3（r2=0.047）＞堿解氮（r2=0.036）。其中，對土壤微生物群落變化具有顯著影響的因子有EC、土壤有機質和pH，解釋量分別為54.8%、39.8%和33.1%。由此可見，EC、土壤有機質和pH是影響長期不同施肥鹽堿地稻田土壤微生物群落結構的主要環境因子。

3 討論

3.1 土壤微生物數量和種類對不同施肥措施的響應

通常，土壤微生物數量是評價土壤肥力的重要指標之一。M、MNPK及RNPK處理較N處理顯著增加了土壤微生物生物量。本研究顯示，M、MNPK和RNPK處理的有機質含量較NPK處理分別增加15.46％、14.23%和4.86％。也有研究指出，施肥可增加土壤的微生物生物量，有機肥配施無機肥可增加稻田根際土壤的微生物生物量，對河套灌區鹽漬化土壤微生物群落研究表明增施有機肥和秸稈還田能夠改善土壤微環境，顯著增加土壤微生物生物量。本研究結果與上述研究基本一致，其原因可能是有機肥或秸稈還田為鹽堿化土壤輸入了大量的有機物料，增加了土壤微生物宿主的數量，為微生物提供碳源，進而促進微生物生長。

土壤微生物群落組成及多樣性既體現了土壤的生態脅迫，也反映著土壤的生物活性。本研究運用PLFA法定量研究了鹽堿地稻田不同施肥處理下土壤微生物群落結構及多樣性。研究結果發現，所有處理中共檢測出57種PLFA生物標記，其中RNPK處理中PLFA生物標記的種類最多。有研究報道的秸稈配施氮肥土壤微生物群落中檢測到33種PLFA標記，也有研究指出，在秸稈、有機肥和無機肥的共同施用下的土壤微生物群落中僅檢測到30種PLFA標記。因此不能簡單地用土壤PLFA種類的多少來判斷施肥方式的好壞，不同土壤微生物對環境的敏感性存在差異。

3.2 土壤微生物多樣性與群落結構對不同施肥措施的響應

土壤微生物多樣性特征目前廣泛采用Shannon-Wiener多樣性指數、Pielou均勻度指數和Simpson優勢度指數表示。本研究發現，鹽堿地稻田長期不同施肥的土壤微生物多樣性指數無顯著差異。有研究指出，長期外源養分（特別是氮素）添加會降低土壤微生物的多樣性，也有研究在Cedar Creek長期氮添加實驗和Nutrient Network聯網實驗中得出施氮對土壤微生物多樣性的影響并不顯著的結論。前者認為長期氮素添加導致土壤微生物多樣性降低主要是基于施氮引發了土壤酸化，后者認為并未產生顯著影響的原因是由于施氮對土壤的pH未產生顯著的影響。本研究結果與后者研究結果相近，N處理的各項多樣性指數雖高，但與其他處理并無顯著差異（表4），同時N處理pH與其他處理也無顯著差異（表2）。造成本研究結果與前者不相同的原因可能是由于本研究選用的蘇打鹽堿土為一類特殊土壤，其具有高pH和高堿化度的特征，鹽堿地稻田長期施用氮肥具有增加稻谷產量和改良土壤的雙重功效。此外，本研究檢測方法的限制也可能是造成這種差異的原因?？傊?，對于N處理具有較高的多樣性指數的深層原因還有待進一步研究。

真菌／細菌能夠反映出土壤微生物群落結構的穩定性，比值越高則生態系統越穩定。有研究報道，施用有機肥能夠有效改善土壤理化性質，提高土壤肥力，并且為土壤細菌提供良好的生長環境。研究結果顯示MNPK處理的真菌／細菌最大，說明該施肥處理對于鹽堿地稻田土壤生態系統的穩定性具有更好的改善作用。在土壤細菌群落中，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌是兩大主要類群，G+/G-與土壤肥力具有緊密聯系，比值越高預示著營養脅迫程度越大。本研究發現RNPK處理土壤中G+/G-最小，表明該土壤營養脅迫小，長期秸稈還田能有效改善土壤的營養狀況，從而提高土壤中微生物生物量。鄔奇峰等的研究表明，長期秸稈還田可改變其群落結構并能夠顯著提高土壤的微生物生物量，這可能是由于秸稈還田可以提高土壤有機質的礦化率，有機質礦化過程又可以為微生物提供能量。

3.3 土壤微生物與鹽分、養分之間的關系

通常土壤微生物數量和多樣性與地表的植被類型、土壤含水量、土壤pH、有機質含量及養分含量等理化性質密切相關。本研究發現，土壤EC、有機質含量和pH是影響鹽堿地稻田土壤微生物群落結構的主要環境因子。土壤有機質是土壤中大多數微生物的主要能量來源，它的含量是決定土壤微生物多樣性和群落結構的重要因素。牛世全等研究發現河西走廊地區鹽堿化土壤微生物群落結構與pH和EC顯著相關。不同鹽堿程度對土壤微生物群落結構有重要影響，隨著土壤鹽分增加，土壤結構松散程度逐漸變大，穩定性降低，從而影響土壤微生物的生存。前期研究發現，土壤pH和EC是表征蘇打鹽堿土鹽堿化程度的重要參數，其數值與土壤各鹽分離子含量等指標具有顯著的相關性。在蘇打鹽堿土改良實踐中常用土壤pH和EC的下降程度來判定土壤改良效果。本研究結果表明，土壤微生物數量和群落結構變化直接反映著土壤鹽堿程度和有機質含量的變化（圖3），因此可作為驗證鹽堿土改良效果的重要指標。

4 結論

長期有機肥與化肥配施、有機肥單施和秸稈還田配施無機肥處理的土壤微生物磷脂脂肪酸含量最高，三者比較而言，長期有機肥與化肥配施對鹽堿地稻田土壤生態系統的穩定性具有更好的改善作用，秸稈還田配施無機肥對鹽堿地稻田土壤營養狀況具有更好的改善作用。蘇打鹽堿土的電導率、有機質含量和土壤pH是影響微生物群落結構的主要環境因子。長期有機肥與化肥配施、有機肥單施和秸稈還田配施無機肥均能有效增加土壤微生物生物量并優化微生物群落結構，進而改善土壤生態環境。

（責任編輯：李丹）

基金項目：吉林省科技發展創新創業卓越人才（團隊）項目（20220508IIORC）；國家自然科學基金面上項目（41977148）；中國科學院黑土地保護與利用科技創新工程專項（XDA28110103）