半導體聚合物和光敏劑摻雜聚苯乙烯微球用于微塑料活體余輝成像示蹤

關鍵詞 微塑料；聚苯乙烯微球；半導體聚合物；余輝成像

微塑料是塑料碎片經過長期紫外線暴露及物理磨損后形成的直徑小于5 mm 的塑料纖維、顆粒或碎片[1]，主要成分包括聚乙烯（PE）、聚丙烯（PP）、聚氯乙烯（PVC）、聚苯乙烯（PS）和聚對苯二甲酸類（PET）等，其造成的污染已與全球氣候變化、臭氧消耗和海洋酸化并列成為全球四大環境問題之一[2-4]。研究表明，微塑料已經通過大氣和生態循環進入到食物鏈中，對食品造成污染，在海產品、瓶裝水、食用鹽以及果蔬類食品中均有檢出[5-7]。此外，在人類胎盤、大腦、心臟和糞便中也檢出了微塑料[8-9]。機體攝入微塑料后會對機體造成炎癥感染、代謝紊亂和氧化應激等不利影響[10-11]。然而，微塑料對于人類健康的潛在影響仍不清楚，微塑料在生物體內的分布、生存、形態及其發育的影響仍未得到充分評估。因此，構建可以成像示蹤微塑料的探針對人體內微塑料的可視化監測具有重要意義。

目前報道的微塑料成像手段主要有PET/CT 成像[12]和熒光成像。微塑料在活體內的成像示蹤多采用標記法。Im 等[12]通過在微塑料氨基聚苯乙烯上修飾放射性金屬元素⁶⁴Cu，采用PET/CT 技術對活體內的微塑料進行成像示蹤；Delaney 等[13]在不同尺寸的微塑料聚苯乙烯上修飾放射性⁸⁹Zr，通過PET/CT 技術實現對活體內微塑料的示蹤。但是， PET/CT 成像技術存在放射性污染，并且儀器復雜且昂貴。微塑料熒光成像中最常用的熒光探針是尼羅紅染料。Cole[14]將尼龍、聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚丙烯纖維嵌入水溶性冷凍劑后，使用低溫切片機進行切片，得到特定長度的微塑料纖維，采用尼羅紅進行熒光標記，應用于活體成像。Ma 等[15]利用尼羅紅對纖維切片機和刀片切割的不同長度的紡絲材料微米纖維進行熒光標記，并將其應用于水生生物活體內成像，為體內過程觀察和毒理學評估提供了高效方便的示蹤劑。此外，一些熒光納米材料也被應用于微塑料成像示蹤。例如， Xu 等[16]將聚L-乳酸（PLLA）和疏水性聚乳酸共混后摻入量子點（CuInS₂@ZnS QDs）制備聚乳酸薄膜用于斑馬魚體內微塑料的熒光成像示蹤。

熒光成像的優勢是無輻射污染、靈敏度高、儀器設備簡單且價格低，已被廣泛用于生物成像[17]。但是，目前熒光成像所使用的熒光探針多存在局限性，例如，小分子熒光染料不穩定，易發生光漂白；熒光探針需持續激發光照射，從而造成自發熒光背景以及生物組織損傷等問題。長余輝材料是在光激發停止后仍能持續發光的物質，其發光壽命長，允許激發和成像兩種操作分離，能夠消除傳統熒光成像技術中因持續激發光引起的自發熒光背景和組織損傷，得到高信噪比的余輝信號。因此，長余輝材料在生物傳感和成像領域備受關注[18-22]。相比于摻雜金屬離子的無機長余輝納米材料，半導體聚合物余輝納米材料不摻雜任何金屬離子，并且具有生物可降解性，對組織不會造成毒副作用，因此更有利于在活體內應用。Miao 等[ 23]利用納米沉淀法將半導體聚合物分子聚[2-甲氧基-5-（2-乙基己基氧基）-1，4-亞苯基]（MEHPPV）與產單線態氧的光敏劑2，3-萘菁硅二（三己基硅氧烷）（NCBS）經兩親性共聚物聚合得到近紅外余輝納米粒子，用于小鼠活體淋巴結和腫瘤成像，其余輝成像信噪比是傳統熒光成像的127 倍。Xu 等[24]采用聚[（9，9-二辛基-2，7-二亞乙烯）-交替-共-{2-甲氧基-5-（2-乙基己氧基）-1，4-亞苯基}]（PF-MEHPPV）代替MEHPPV 作為余輝底物，摻雜的具有AIE 效應的光敏劑與余輝基底PF-MEHPPV 之間發生有效能量轉移，進一步引發“自激發余輝效應”，增強了余輝強度并延長了余輝持續時間。該方法被應用于活體腫瘤余輝成像。然而，目前尚未見將余輝發光信號標記在微塑料上并應用于活體內可視化監測的報道。

本研究以苯乙烯為反應單體、聚乙烯吡咯烷酮為表面活性劑、過硫酸鈉為引發劑，摻入半導體聚合物分子PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS，通過聚合反應制備得到具有余輝發光信號的聚苯乙烯復合微球（PNPS）（圖1A）。PF-MEHPPV 充當余輝基底， NCBS 既可產單線態氧氧化余輝基底，也是能量受體，接受氧化態的不穩定中間體釋放出的光子，使材料的余輝發光轉移至近紅外區域，起到提高組織穿透深度的作用。將PNPS 應用于小鼠活體內余輝成像（圖1B），實現了對聚苯乙烯微球的成像示蹤。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

日立SU8100（Regulus 8100）型掃描電子顯微鏡（日本株式會社）；UV-3600PLUS 紫外-可見-近紅外分光光度計（日本島津公司）；ZEN 3700 納米激光粒度儀（英國馬爾文儀器公司）；F-7000 熒光分光光度計（日本日立公司）；BSA124S 電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ3200DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Centrifuge 5810 R 高速離心機（德國艾本德公司）；DZK-K50B 真空干燥箱（合肥達斯卡特生物科技有限公司）；IVIS Lumina XRMS Series III 小動物活體成像系統（美國鉑金埃爾默公司）。

苯乙烯（St，gt;99.0%， TCI（上海）化成工業發展有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP， MW=10000，上海源葉生物科技有限公司）；聚（乙二醇）-block-聚（丙二醇）-block-聚（乙二醇）（PEG-b-PPG-b-PEG， Mn～12600，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；碘化鉀（KI， 99.5%，上海麥克林生化科技股份有限公司）；2，3-萘菁硅二（三己基硅氧烷）（NCBS， 97%，加拿大TRC 公司）；聚[（9，9-二（2-乙基己基）-9H-氟-烯-2，7-亞乙烯）-共-（1-甲氧基-4-（2-乙基己氧基）-2，5-亞苯基-亞乙烯基）]（PF-MEHPPV，上海百靈威化學技術有限公司）；四氫呋喃（THF）、乙醇和Na2S2O8（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）。堿性氧化鋁固相萃取柱（QTY∶20 EA/PK，杭州微米派科技有限公司）；灌胃針（8 號彎針，北京中科慧達科技有限公司）。模擬組織液（胃液SGF、唾液SSF 和腸液SIF，廣州創峰自動化科技有限公司）。實驗用水為超純水（杭州娃哈哈有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 純聚苯乙烯微球（PS）和余輝發光PNPS的合成

市售苯乙烯中含有阻凝劑，防止苯乙烯發生自聚，因此在實驗前需對其進行去除阻凝劑處理。將苯乙烯溶液加入到裝有堿性氧化鋁的固相萃取柱中洗滌3 次后， 保存在裝有干燥的無水氯化鈣的棕色試劑瓶中，在4 ℃儲存，備用。

參考文獻[25-28]的方法并進行部分改進合成PS 和PNPS。稱取1.0 g PVP 置于圓底燒瓶中，然后加入98 mL 超純水，在室溫下超聲5 min 后，磁力攪拌1 min，待PVP 完全分散后，將圓底燒瓶放入35 ℃油浴中，攪拌。體系密封除氧15 min（氮氣球除氧，重復3～5 次）后，將5 mL 苯乙烯溶液加入到體系中。將0.15 g 引發劑Na2S2O8 分散到2 mL 水中，超聲分散均勻后加入到上述體系中，邊攪拌邊升溫到80 ℃，反應24 h。將反應后的溶液以11000 r/min 離心20 min， 產物用超純水洗滌3 次，在45 ℃真空干燥24 h，得到PS。

將1.0 g PVP 和98 mL 超純水加入圓底燒瓶中，超聲至PVP 充分分散。將分散液置于35 ℃油浴中，攪拌。體系密封除氧15 min（氮氣球除氧，重復3～5 次）后，將1 mL PF-MEHPPV 的THF 溶液（5 mg/mL）與250 μL NCBS 的THF 溶液（1 mg/mL）混勻，立即加入到5 mL 苯乙烯溶液中，形成混合溶液后加入到圓底燒瓶中。將0.15 g 引發劑Na₂S₂O₈ 分散到2 mL 超純水中，超聲分散均勻后加入到上述體系中，邊攪拌邊升溫到80 ℃后，反應24 h。將反應后的溶液以11000 r/min 離心20 min， 產物用超純水洗滌3 次，45 ℃真空干燥24 h，得到黃色的固體粉末，即為摻雜PF-MEHPPV 和NCBS 的聚苯乙烯復合微球（PNPS）。

1.2.2 PF-MEHPPV NPs 和NCBS NPs的合成

參考文獻[23]的方法并進行部分改進合成NPs。將半導體聚合物PF-MEHPPV（0.2 mg/mL， 5 mL）和兩親性共聚物PEG-b-PPG-b-PEG（5 mg/mL， 20 mL）在THF 中充分混合，超聲處理后，將其快速注入到20 mL 超純水中，在氮氣氣氛中蒸發（65 ℃）去除THF，用0.22 μm 過濾器除去產物溶液中較大的顆粒，過濾液用超濾離心管（截留分子量10 kDa）離心并使體積濃縮至1 mL， 再用超純水反復洗滌3 次，除去未反應的單體，獲得PF-MEHPPV NPs。

將半導體聚合物PF-MEHPPV（0.2 mg/mL， 5 mL）和兩親性共聚物PEG-b-PPG-b-PEG（5 mg/mL， 20 mL）在THF 中充分混合，加入光敏劑NCBS（0.05 μmoL），超聲處理。其余過程與制備PF-MEHPPV NPs 的過程相同，最終得到NCBS NPs。

1.2.3 PNPS 的余輝發光性能測試

將15 mg PNPS 粉末置于黑色96 孔板中均勻鋪平，用紅光LED 燈（（650±10） nm， 0.07 W/cm²）激發5 min 后，立即轉移到小動物成像儀中，在激發濾光片設置為“Block”，發射濾光片分別設置為“Open”、“Em 570 nm”和“Em 790 nm”這3種模式下，在不同時間點采集余輝圖像，曝光時間設置為60 s， 每個時間點采集圖像前均用紅光LED 燈激發5 min。

1.2.4 PNPS 的穩定性實驗

（1） 余輝穩定性將5 mg PNPS 粉末分別分散于1 mL 超純水和1 mL 不同模擬組織液（SGF、SSF和SIF）中，制備4 組待測液。分別取200 μL 上述4 組待測液置于黑色96 孔板中，用紅光LED 燈（（650±10） nm， 0.07 W/cm²）激發5 min 后，立即轉移到小動物成像儀中，在激發濾光片設置為“Block”、發射濾光片設置為“Open”的模式下，在不同時間點采集余輝圖像，曝光時間設置為60 s，每次采集圖像前均用LED 燈激發5 min。（2） NCBS 擴散實驗將25 mg PNPS 粉末分別分散于5 mL 超純水和5 mL 模擬胃液中，以8000 r/min 離心，在不同時間點收集上清液，并以NCBS NPs 的水分散液作為對照，利用熒光分光光度計在狹縫5 nm、電壓500 V、激發波長690 nm 的條件下掃描熒光發射光譜。（3） 過硫酸鈉殘留實驗配制0.8 mol/L KI 標準溶液，分別移取200 μL 一系列不同濃度的Na₂S₂O₈ 標準溶液（0～500 μg/mL）與200 μL KI 溶液混合，靜置30 min，作為顯色反應的定量基準對照組。將25 mg PNPS 粉末分別分散于5 mL 超純水和5 mL 模擬胃液中，分別以超純水和模擬胃液作為空白對照，吸取放置不同時間的200 μL分散液，與200 μL KI 標準溶液混合，靜置30 min，觀察顏色變化。

1.2.5 PNPS 的組織穿透能力測試

將15 mg PNPS 粉末置于黑色96 孔板中均勻鋪平，用紅光LED 燈（（650±10） nm， 0.07 W/cm²）激發5 min 后，將切好的不同厚度的豬肉組織置于孔板上方，并立即轉移到小動物成像儀中，在激發濾光片設置為“Block”、發射濾光片設置為“Open”的模式下，激發停止0.25 min 后采集余輝圖像，曝光時間設置為60 s。

1.2.6 小鼠活體內的PNPS 余輝成像實驗實驗

小鼠選用5～6 周齡的BALB/c 雌性小鼠，所有動物實驗均遵循江南大學動物倫理委員會關于實驗動物使用與護理的規定（倫理審核編號：JN.No20231007b0660120[445]）。將12 只小鼠隨機分為兩組，一組3 只，以PS 微球灌胃，作為對照組；另一組9 只，以PNPS 復合微球灌胃，作為實驗組。分別稱取5 mg PS 和PNPS 粉末溶于1 mL 無菌水中，超聲分散5 min 后，用1 mL 注射器吸取200 μL 分散液，借助灌胃針（8號灌胃針，彎針）灌胃小鼠，用紅光LED 燈（（650±10） nm，0.07 W/cm²）照射小鼠5 min 后立即轉移到小動物成像儀中進行成像，在激發濾光片設置為“Block”、發射濾光片設置為“Open”的模式下，在紅光LED 燈激發停止0.25 min 后采集小鼠余輝圖像，曝光時間設置為60 s， 每個時間點采集余輝圖像前均用紅光LED 燈照射5 min。

2 結果與討論

2.1 PS和PNPS的表征

通過掃描電子顯微鏡以及納米激光粒度儀對制備得到的純PS 微球和PNPS 復合微球的形貌及電勢進行表征。由圖2A 和2B 可見， PS 微球和PNPS 復合微球的形貌均為球形，并且較為均一，粒徑分別為（220±6.96） nm 和（235±15.06） nm（圖2C）。PS 微球和PNPS 復合微球具有相似的Zeta 電勢，分別為（?12.30±0.26） mV 和（?11.73±0.20） mV（圖2D）。以上結果表明，半導體聚合物PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS 摻雜對PS 微球的粒徑和Zeta 電勢均無明顯的影響。

2.2 PF-MEHPPV NPs 和NCBS NPs 的光學性質及能量轉移可行性

Jiang 等[22]報道了半導體聚合物納米粒子近紅外余輝發光的機理。基于該機理，對本研究的余輝發光機理進行了分析（圖3A）。光敏劑NCBS 在光照激發下可以產生單線態氧（¹O₂），半導體聚合物PF-MEHPPV 中的碳碳雙鍵（C=C）被¹O₂ 氧化成PF-MEHPPV-環氧雜環（PF-MEHPPV-dioxetane）高能中間體，這種中間體極不穩定，會很快降解并釋放出光子， PF-MEHPPV 釋放出的光波長在可見光區（500～600 nm）， 可進一步通過能量轉移激發光敏劑NCBS，從而將余輝發光轉移到近紅外區域（780 nm）。為考察本研究中PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS 之間是否發生能量轉移，對其進行了熒光光譜和紫外-可見吸收光譜表征。由于PF-MEHPPV 和NCBS 分子不溶于水，因此將PF-MEHPPV 和NCBS 分別通過納米沉淀的方法制備得到PF-MEHPPV NPs 和NCBS NPs 的水分散液后，再進行測試。在激發波長為490 nm條件下， PF-MEHPPV NPs 在500～600 nm 范圍內展示出一個寬的熒光發射峰（圖3B），而NCBS NPs 在521、690 和739 nm 下均有激發光譜峰（圖3C 曲線a），在最大激發波長690 nm 下得到的發射光譜主要位于近紅外區域（750～850 nm）（圖3C 曲線b）。由紫外-可見吸收光譜（圖3D）可見， PF-MEHPPV NPs 的吸收峰主要在200～520 nm（圖3D 曲線a），而NCBS NPs 在200～450 nm 和650～800 nm 波段均有吸收（圖3D 曲線b）。因此， NCBS NPs可以吸收紫外和可見區域的光，也可以吸收近紅外光，而PF-MEHPPV NPs只能吸收紫外和可見區域的光。為了測試NCBS NPs 能否被PF-MEHPPV NPs 發出的光激發，將熒光光譜儀激發波長設置為521 nm 并對光敏劑NCBS NPs 進行激發，可觀察到780 nm 處的熒光光譜峰，但熒光強度較弱（圖3E曲線a）。為測試紅光LED燈（（650±10） nm）能否激發光敏劑NCBS NPs，將熒光光譜儀激發波長設置為650 nm，得到了750～850 nm 范圍內的熒光光譜峰，并且熒光強度較強（圖3E 曲線b）。上述結果表明， PF-MEHPPV NPs 的發光通過能量共振轉移激發NCBS NPs，從而發射近紅外區域的光具有可行性，而NCBS NPs可以用650 nm的光進行有效激發。因此，后續實驗中選用紅光LED燈（（650±10） nm）作為激發光源。

2.3 PNPS 復合微球的余輝性能研究

為了考察PNPS 復合微球的余輝性能，通過小動物活體成像儀采集PNPS 復合微球的余輝成像。由圖4A 和4B 可見，在紅光LED 燈激發5 min 后， PNPS 在發射濾光片為“Open”模式下余輝持續發光時間可以達到96 h，在激發停止0.25 min 后余輝強度可達到1.641×10⁸ p/（s·c·m²·sr），表明其具有良好的余輝強度和持續發光時間。

為了進一步驗證余輝發光能否轉移到近紅外區域，對PNPS 在相同預照射條件下不同發射波長處的余輝發光成像進行采集。如圖4C 和4D 所示，當發射濾光片波長設為570 nm 時，在激發停止0.25 min 后PNPS 的余輝強度為9.398×10⁷ p/（s·cm²·sr）；當波長設置為790 nm 時，激發停止0.25 min 后余輝強度為4.971×10⁷ p/（s·cm²·sr）。上述結果表明， PF-MEHPPV NPs 確實有部分發光轉移到了近紅外區域，其組織穿透能力得以提高。

2.4 PNPS 復合微球的穩定性研究

考察了PNPS 復合微球的穩定性。采集PNPS 復合微球分散到不同的模擬組織液（SSF、SGF 和SIF）以及水溶液中的余輝發光，如圖5 所示。在相同的紅光LED 燈照射下， 4 種分散液在放置不同時間點的余輝強度略有差別， PNPS 在胃液環境中的余輝強度并未受到酸性環境的不利影響，反而比其它3 種溶液的強度略高，這主要是因為NCBS 染料分子的熒光行為受酸性環境的影響；4 種分散液的余輝強度隨著時間延長而基本趨于穩定，但稍有下降的趨勢，這主要與NCBS 染料分子的光漂白性質有關。以上結果表明， PNPS 復合微球具有較好的余輝穩定性，在不同模擬組織液中放置96 h 后，余輝強度仍能達到5×10⁶ p/（s·cm²·sr）以上。

為了進一步考察NCBS 染料能否從PNPS 復合微球中擴散，將PNPS 復合微球分別分散在模擬胃液和水溶液中，放置不同時間后，離心，測定上清液的熒光光譜，結果如圖6 所示，與染料NCBS 的熒光強度相比， PNPS 復合微球無論是在水溶液（圖6A）還是在模擬胃液（圖6B）中，隨著時間延長， 離心后的上清液均未表現出明顯的NCBS 的特征發射峰，表明PNPS 在兩種溶液中放置96 h 后， 幾乎沒有NCBS 染料分子擴散到溶液中，表明PNPS 具有較好的穩定性。

在PNPS 復合微球合成過程中，使用過硫酸鈉作為引發劑。為了驗證最終的PNPS 復合微球是否含有Na₂S₂O₈ 殘留，利用Na₂S₂O₈ 與KI 的顯色反應進行研究。保持KI 濃度不變，改變Na₂S₂O₈ 標準溶液的濃度（0～500 μg/mL），反應30 min， 作為顯色反應的定量基準對照組（圖6C），顏色越深，表明Na₂S₂O₈ 濃度越高。將PNPS 分散在水溶液（圖6D）和模擬胃液（圖6E）中，放置不同時間后的溶液與KI 標準溶液進行顯色反應，與定量基準對照組進行比較，顏色均未發生明顯變化，表明PNPS分散液中幾乎不含有Na₂S₂O₈。

2.5 PNPS 復合微球的余輝發光組織穿透能力

將豬肉組織切割成不同厚度，放置在裝有15 mg PNPS 固體粉末（預照射5 min）的孔板中，進行余輝圖像采集，進一步考察PNPS 復合微球的余輝發光的組織穿透能力。如圖7 所示，當豬肉組織厚度為0.5 cm 時，采集的余輝強度可以達到1.205×10⁷ p/（s?cm²?sr）；隨著豬肉組織厚度逐漸增大，余輝發光強度逐漸下降，直至組織厚度增至1.8 cm 時，余輝強度為9.483×10⁵ p/（s?cm²?sr）；組織厚度繼續增至2.0 cm時，未采集到材料的余輝發光信號。上述結果表明，在此測試條件下， PNPS 的余輝穿透組織深度至少可達到1.8 cm， 將其應用到活體成像中具有一定的可行性。

2.6 PNPS 復合微球在小鼠活體內的余輝成像

為了考察PNPS 復合微球在小鼠活體內的余輝成像效果，將純PS 微球和PNPS 復合微球粉末制備成分散液后灌胃小鼠，在紅光LED 燈的激發停止0.25 min 后采集余輝圖像，每個時間點采集圖像前均用紅光LED 燈激發5 min。如圖8A 所示，對照組小鼠灌胃純PS 微球后，在24 h 內均未表現出余輝信號，表明純PS 微球不具有余輝性能。對實驗組小鼠灌胃相同質量的PNPS 復合微球， 30 min 后采集余輝圖像，發現發光信號主要分布在小鼠胃部；隨著灌胃時間延長至2 h，小鼠胃部的余輝強度減弱，且在4 h 后轉移到腸道部位；灌胃10 h 后，小鼠胃部的余輝強度較4 h 前明顯減弱，說明PNPS 復合微球可以隨著時間延長而逐漸代謝；當灌胃時間達到24 h 時，小鼠胃部仍能檢測到余輝信號；當灌胃時間達到48 和72h時，小鼠全身未檢測到余輝信號。

將灌胃后的小鼠進行解剖，對主要器官進行成像，結果如圖8B 和8C 所示。對照組小鼠灌胃純PS 微球24 h 后所有器官均不發光，而灌入PNPS 復合微球24 h 的實驗組小鼠的胃部及肺部均有余輝，胃部的余輝發光強度相對更強，表明PNPS 復合微球在體內的停留時間可以達到24 h，并且少量PNPS 復合微球會進入肺部。解剖灌胃48 和72 h 的實驗組小鼠，對其主要器官進行成像，發現灌胃48 h 的小鼠胃部仍具有余輝信號，而灌胃72 h 后小鼠的器官均未檢出余輝信號。上述結果表明， PNPS 復合微球可以通過余輝發光信號追蹤到微球在小鼠體內分布的時間達到24 h，對解剖后器官的成像示蹤可以達到48 h。

3 結論

本研究通過共摻雜半導體聚合物PF-MEHPPV 和光敏劑NCBS，成功制備了余輝發光聚苯乙烯復合微球，并實現了共摻雜聚苯乙烯復合微球在小鼠活體內的余輝成像。共摻雜對聚苯乙烯微球的粒徑和電勢無明顯影響，摻雜后的聚苯乙烯復合微球余輝發光持續時間可達96 h，具有較好的余輝發射強度和近紅外發光，組織穿透深度可達1.8 cm，并且在小鼠活體內監測到的余輝成像信號持續長達24 h， 解剖器官的余輝成像信號可以持續到48 h。本研究為微塑料在生物活體內的成像示蹤提供了新方法。