QuEChERS-高效液相色譜-串聯質譜法測定淡水魚中地西泮及孔雀石綠的殘留量

【摘要】目的：采用高效液相色譜-串聯質譜法同時測定淡水魚中地西泮和孔雀石綠的殘留量。方法：采用QuEChERS前處理技術，利用高效液相-串聯質譜法對目標物進行測定。結果：孔雀石綠和地西泮在0.1～2.0 ng/mL范圍內線性關系良好，回收率在95.1%～106.7%，檢測限為0.1μg/kg，定量限為0.5μg/kg。結論：本法靈敏度高，操作簡單，結果準確可靠，可同時測定淡水魚中孔雀石綠和地西泮的殘留量。

【關鍵詞】高效液相色譜-串聯質譜法；淡水魚；地西泮；孔雀石綠

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.003

【基金項目】遼寧省應用基礎研究計劃項目（2022JH2/101300076）：食品安全非靶向篩查及溯源識別關鍵技術研究。

Determination of Diazepam and Malachite Green Residues in Freshwater Fish by QuEChERS-HPLC-MS/MS

CHEN Yuwei， ZHOU Ziren， ZHAO Lei， GAO Guanghui*

（Liaoning Inspection Examination and Certification Centre， Shenyang 110036， China）

Abstract： Objective： To determine the residues of diazepam and malachite green in freshwater fish simultaneously by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）. Methods： The QuEChERS pretreatment technology was used， and the target compounds were determined by HPLC-MS/MS. Results： Malachite green and diazepam showed good linearity in the range of 0.1～2.0 ng/mL， with recoveries ranging from 95.1% to 106.7%， a detection limit of 0.1μg/kg， and a quantification limit of 0.5μg/kg. Conclusion： This method is sensitive， easy to operate， and the results are accurate and reliable. It can be used for the simultaneous determination of malachite green and diazepam residues in freshwater fish.

Keywords： HPLC-MS/MS； freshwater fish； diazepam； malachite green

地西泮（Diazepam，C16H13ClN2O）又名安定[1]，具有鎮靜、抗驚厥等作用，屬于苯二氮卓類鎮靜劑，是獸醫臨床上用來使動物恢復平靜，減輕或消除動物狂躁不安的藥物[2-4]。如果人們長期食用地西泮殘留超標的水產品，會導致中樞神經系統受到嚴重干擾。很多國家將地西泮列為在水產動物捕撈以及運輸過程中禁止使用的藥物。GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規定，地西泮僅允許治療使用，但進入市場前不得檢出。

孔雀石綠屬于人工合成的三苯甲烷類堿性工業染料，在水中主要代謝為脂溶性的隱色孔雀石綠。孔雀石綠進入人類或動物機體后，通過生物轉化還原代謝成脂溶性的隱色孔雀石綠，其毒性要比孔雀石綠還強，具有高殘留、高毒和致癌、致畸、致突變危害，嚴重威脅人們的身體健康[5]。《中華人民共和國農業農村部公告第250號》已將孔雀石綠列為禁用物質，規定在淡水魚中不得qJpPdbiOj3jfmX6T2UYGJQ==檢出。

地西泮的檢測依據SN/T 3235—2012《出口動物源食品中多類禁用藥物殘留量檢測方法液相色譜-質譜/質譜法》，孔雀石綠的檢測依據GB/T 19857—2005《水產品中孔雀石綠和結晶紫殘留量的測定》。本文采用QuEChERS+高效液相色譜-串聯質譜法（HPLC-MS/MS）同時測定地西泮和孔雀石綠，不僅滿足了方法的準確性，還極大地提高了基層檢驗機構的工作效率。

1材料與方法

1.1儀器、試劑及樣品來源

串聯四極桿液質聯用儀（美國賽默飛公司），對照品地西泮、孔雀石綠草酸鹽（純度為98.0%）、隱色孔雀石綠（純度為94.0%）、內標氘代孔雀石綠（純度為99.4%）和氘代隱色孔雀石綠（純度為98.5%）均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司。

乙腈、甲酸（Sigma公司）均為色譜純；水為Millipore超純水；其他試劑均為分析純。

本研究采用的樣品為從市場中通過多階段分層隨機購買的鯽魚、鯉魚、黑魚、草魚等淡水魚，包括活體淡水魚。

1.2溶液制備

1.2.1標準品溶液的制備

稱取地西泮、孔雀石綠、隱色孔雀石綠、d5-孔雀石綠和d5-隱色孔雀石綠標準品適量，用乙腈稀釋制成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 ng/mL系列標準溶液（內標質量濃度為1.0 ng/mL）。

1.2.2樣品溶液的制備

將魚去頭、鱗、刺后搗碎，稱取已搗碎的樣品5.00 g，置于50 mL離心管中，加入50μL內標溶液（500μg/L），精密加入25 mL乙腈，10，000 r/min勻漿提取30 s，加中性氧化鋁3 g，渦旋2 min，3500 r/min離心10 min，取上清液3 mL，加正己烷1 mL，渦旋2 min，3500 r/min離心10 min，棄去正己烷層，取乙腈層用0.2μm濾膜濾過后，作為供試品溶液。

1.3檢測方法

1.3.1色譜及質譜條件

色譜柱：Waters C18 column（2.1 mm×50 mm，1.7μm）；流動相：0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；柱溫：30℃；進樣量：2μL，梯度洗脫程序見表1。

離子源：電噴霧正負離子模式（ESI+），掃描模式為多反應監測（MRM）模式；毛細管壓力：3500 V（Postive Ion），2500 V（Negative Ion）；鞘氣流速：50Arb；輔助氣流速：10Arb；吹掃氣流速：0Arb；離子傳輸管溫度：325℃；脫溶劑溫度：350℃。

1.3.2測定方法

取標準品溶液及樣品溶液各2μL，注入液質聯用儀，采用標準曲線法計算含量。

2實驗方法與結果

2.1儀器條件優化

首先將0.5μg/mL待測化合物的標準溶液分別以流動注射的方式在正離子模式下進行母離子全掃描，確定分子離子，然后對其子離子進行全掃描，優化碰撞能量等參數，得到孔雀石綠、隱色孔雀石綠和地西泮的最佳質譜條件。孔雀石綠、隱色孔雀石綠及其內標、地西泮檢測參數見表2，色譜圖見圖1至圖6。

2.2方法的線性范圍及檢出限

將系列標準溶液按照“1.3”的方法進行檢測，以待測物質量濃度為橫坐標，待測物峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，地西泮、孔雀石綠及其代謝物在0.1～2 ng/mL范圍內線性關系良好，能夠滿足樣品的定量分析需求。檢出限（以3倍信噪比S/N=3計）及定量限（以10倍信噪比S/N=10計）結果見表3。

2.3回收率及精密度實驗

以空白基質為樣品，在0.5、1、5μg/kg這3個水平下進行加標回收實驗，平行測定6個樣品，計算加標回收率，結果見表4。

2.4樣品測定結果

選取淡水魚中地西泮陽性樣品，進行自建方法和國標方法比對，精確度符合要求。

2.5結果分析

本研究建立了一種同時檢測水產品中孔雀石綠和地西泮殘留量的檢測方法，其線性范圍、檢出限、定量限和加標回收率等指標均滿足GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范食品理化檢測》的要求。將陽性樣品測定的結果同標準方法進行比較，相對偏差≤15%，滿足GB/T 27404—2008的精密度要求。同時，本研究所建立的前處理方法也能大大節約前處理時間。原來采用抽檢細則指定的方法每天只能提取20批樣品，而采用本研究所建立的前處理方法每天可以處理50批樣品，這極大地提高了檢驗人員的工作效率。

3結束語

通過QuEChERS/HPLC-MS/MS法測定淡水魚中的孔雀石綠和地西泮殘留量。根據孔雀石綠和地西泮的性質，對樣品采用乙腈提取，用中性氧化鋁凈化后，又用正己烷去除脂溶性雜質。該方法易于操作，簡便快速。經方法學驗證，該方法的回收率、精密度和準確度能夠滿足水產品中獸藥殘留分析的要求。

【參考文獻】

[1] TAKAI Y，TOKUSUMI H，SATO M，et al.Combined effect of diazepam and polystyrene microplastics on the social behavior of medaka（Oryzias latipes）[J].Chemosphere，2022，299：134403.

[2]李存，皇甫偉國，楊挺，等.液相色譜串聯質譜法快速測定豬尿中10種鎮靜劑類藥物殘留量[J].分析化學，2010，38（7）：1015-1018.

[3] DEKOSKY S T，WILLIAMSON J B. The long and the short ofbenzodiazepines and sleep medications：Short-term benefits，long-term harms[J]. Neurotherapeutics，2020，17（1）：153-155.

[4]張祖維，李木子，李雪蓮，等.液相色譜-串聯質譜法測定豬尿液中地西泮及其7種代謝物殘留[J].中國動物檢疫，2021，38（3）：112-118.

[5]張蓓蓓，趙永剛.加速溶劑萃取/超高效液相色譜-串聯質譜法測定沉積物中三苯甲烷類殺菌劑[J].分析測試學報，2016，35（10）：1328-1332.

【作者簡介】

陳玉威，女，1978年出生，高級工程師，研究方向為食品質量與安全。

通信作者：高廣慧，女，1976年出生，主任藥師，研究方向為食品質量與安全。

（編輯：李鈺雙）