突觸后支架蛋白Preso 在顱腦沖擊傷誘導創傷后應激障礙中的作用機制

摘要： 將36 只雄性C57 小鼠隨機分為對照組（ Sham 組） 、3.5 MPa 顱腦沖擊傷（ blast-related traumatic brain injury，bTBI）組、4.5 MPa bTBI 組、5.5 MPa bTBI 組、4.5 MPa bTBI+生理鹽水組（bTBI+SA 組）、4.5 MPa bTBI+小分子多肽組（bTBI+TAT-FERM 組） ，每組6 只；將12 只 Preso -/-小鼠隨機分為Sham 組和 4.5 MPa bTBI 組，每組6 只。對小鼠進行bTBI 造模，完成后常規飼養2 周，4.5 MPa bTBI+生理鹽水組和4.5 MPa bTBI+TAT-FERM 組在bTBI 造模后每天通過尾靜脈給藥1 次，連續給藥5 d。與對照組相比， 3.5 MPa bTBI 組小鼠焦慮抑郁行為改變不顯著； 4.5 MPa bTBI 和5.5 MPa bTBI 組小鼠出現創傷后應激障礙（ posttraumatic stress disorder， PTSD）樣癥狀。與對照組相比， 4.5 MPa bTBI 組Preso/mGluR1 復合體形成增加，使用TAT-FERM 可阻斷Preso 與mGluR1 的相互作用，可在不改變Preso/mGluR1 復合體組成分子蛋白表達的情況下抑制Preso/mGluR1 復合體形成，并且改善bTBI 所導致的PTSD 癥狀。bTBI 促進Preso/mGluR1 復合體形成是bTBI 誘致PTSD 癥狀的重要分子病理機制，通過阻斷Preso 與mGluR1 相互作用可減輕bTBI 對PTSD 的影響，進而為治療bTBI 相關的PTSD 提供了潛在靶點。

關鍵詞： 顱腦沖擊傷；創傷后應激障礙；突觸后支架蛋白；代謝性谷氨酸受體；小分子多肽

中圖分類號： O383 國標學科代碼： 13035 文獻標志碼： A

顱腦損傷（traumatic brain injury， TBI）是現代戰爭中最主要的創傷類型，其中炸藥、炮彈等爆炸所產生的沖擊波是引起顱腦損傷的重要原因[1]。美軍有關退伍軍人的流行病學調查研究顯示，顱腦沖擊傷（blast-related traumatic brain injury， bTBI）的發生率接近10%，且有15% 的 bTBI 傷員會在退伍后產生一系列創傷后的心理應激反應，以創傷后應激障礙（posttraumatic stress disorder， PTSD）最典型[2-3]。PTSD 是一種在重大創傷事件后出現的嚴重精神疾病，表現出對創傷記憶的過度反應、恐懼消退受損等臨床特征，對家庭和社會造成極大的負擔。目前，對于bTBI 與PTSD 之間產生相關性的具體機制仍不清楚，導致缺少有效的診斷標志物和藥物治療靶點。

大量的研究表明，TBI 導致的神經元興奮性毒性損傷是引起繼發性腦損害的重要機制之一，與突觸后谷氨酸能受體功能異常密切相關[4]。Preso（也稱Preso1）是近期發現的一種突觸后支架蛋白分子，可通過其FERM 結構域與代謝性谷氨酸受體（metabotropic glutamate receptor， mGluR）形成突觸后蛋白復合體，在神經元突觸可塑性的調節過程中發揮重要作用[5]。進一步的研究發現，TBI 后Preso 促進mGluR1介導的神經元興奮性毒性損傷，其具體機制與Preso/mGluR1 復合體的形成有關[6]。但是，Preso/mGluR1復合體在bTBI 誘導PTSD 樣焦慮抑郁行為中的作用尚不明確。因此，本研究在構建小鼠bTBI 模型的基礎上，探討Preso/mGluR1 復合體在bTBI 相關PTSD 中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

本實驗采用約8 周齡的雄性C57 小鼠和Preso 基因敲除（Preso-/-）小鼠，分別由空軍軍醫大學實驗動物中心和上海南方模式生物科技公司提供。小鼠飼養在20～25 ℃ 的環境中，明暗交替時間為12 h∶12 h，通風良好，自由進食與飲水。將36 只C57 小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為對照組（Sham 組）、3.5 MPabTBI 組、4.5 MPa bTBI 組、5.5 MPa bTBI 組、4.5 MPa bTBI+生理鹽水組（bTBI+SA 組）和4.5 MPabTBI+小分子多肽組（bTBI+TAT-FERM 組），每組各6 只；將12 只Preso-/-小鼠適應性喂養1 周后，隨機分為Sham 組和4.5 MPa bTBI 組，每組各6 只。所有動物實驗均經空軍軍醫大學動物倫理委員會批準，許可證號為20210419。

1.2 方法

1.2.1 沖擊波模型的建立

本實驗采用BST-Ⅰ型生物激波管（陸軍軍醫大學大坪醫院）模擬bTBI。每組6 只小鼠麻醉后放于生物激波管末端動物固定架上，距離激波管末端擋板10 cm 處，且均位于同一垂直平面上，右側頭部朝向沖擊波來源方向，同時通過激波管爆炸沖擊波（驅動段壓力分別為3.5、4.5 或5.5 MPa）造成單次bTBI。

1.2.2 藥物干預

實驗所使用的小分子干擾多肽TAT-FERM 由南京金斯瑞公司合成，通過小鼠尾靜脈注射的方式將TAT-FERM 以3 nmol/g（小鼠體重）/天10 μg/g 的劑量給藥，4.5 MPa bTBI 造模后連續給藥5 d。

1.2.3 曠場實驗

每個曠場試驗箱的尺寸為40 cm × 40 cm × 35 cm，測試前首先將曠場反應箱底部、放置物以及側壁用75% 酒精清理消毒，防止之前小鼠所殘留的氣味、大小便等影響測試準確性；將小鼠從飼養籠里取出，背向實驗者放在曠場的中央區域，拉上簾子后實驗者迅速離開，任由小鼠在曠場反應箱中自由活動；測試結束后要用75% 酒精清理消毒整個曠場箱體，等待晾干后更換小鼠繼續重復以上實驗（在測試下一只小鼠前需將酒精完全揮發）。利用Smart 3.0 視頻分析軟件進一步分析小鼠在15 min 內在中心位置的次數和運動距離百分比。如果小鼠更傾向于在曠場試驗箱中間運動，被認為是抗焦慮行為，反之則是焦慮行為。

1.2.4 高架十字迷宮實驗

高架十字迷宮裝置通常由兩段開臂和兩段閉臂構成，距離地面高度51 cm，各臂長66 cm，寬5 cm，閉臂臂高15 cm，測試前要用75% 酒精清理確保整個高架十字迷宮裝置的清潔，盡可能創造一個干凈、無味道的理想試驗環境；將小鼠從飼養籠里取出，背向實驗者將小鼠輕輕放在高架十字迷宮裝置的中央區域，并使其面向開臂，拉上簾子后迅速安靜的離開；實驗結束后將其取出放回飼養籠，做好實驗完成動物的標記信息，用75% 酒精和紙巾清潔迷宮，等待晾干后更換小鼠繼續重復以上實驗。用Smart 3.0 視頻軟件進一步分析，記錄小鼠進入開臂的次數（open arm entry， OE， noe）和進入開臂的時間（arm openingtime， OT， tot），進入閉臂的次數（closed arm entry， CE， nce）和進入閉臂的時間（arm closing time， CT， tct），計算小鼠進入開臂次數的百分比γnoe =（noe/noe +nce）×100%以及進入開臂時間的百分比γtot =（tot／tot +tct）×100%。

1.2.5 免疫印記雜交（Western blot）

bTBI 造模后第17 d 每組取3 只小鼠進行免疫印記雜交實驗。提取蛋白時，在新鮮的小鼠皮層腦組織樣品中加入RIPA 裂解液并勻漿，離心后取上清，制備好的蛋白樣品于?80 ℃ 保存。使用BCA 法測定蛋白樣品濃度，在10% 的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，轉膜至PVDF 膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h。一抗Preso（1∶1 000，Abclonal）、mGluR1（1∶800，Abcam）、β-actin（1∶1 000，Proteintech）于4 ℃ 孵育過夜，在常溫下二抗孵育2 h，在發光儀（ChemiDoc Touch，Bio-Rad）對條帶發光。

1.2.6 蘇木精-伊紅（Hamp;E） 染色

bTBI 造模后第17 d 每組取3 只小鼠進行Hamp;E 染色。將石蠟包埋好的腦組織切成10 μm 薄片，然后放入甲醇中脫脂2 min，再依次浸入95% 乙醇、70% 乙醇和蒸餾水中進行脫水處理，每次均為2 min。將脫水后的切片依次浸入hematoxylin 染料、蒸餾水、酸性洗滌劑和eosin 染料中10 min，再次脫水后進行透明化處理并封片。

1.2.7 統計學分析

實驗數值以x±s 表示，利用GraphPad Prism 9.0 進行統計學分析與作圖。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差齊性，則用Turkey 檢驗法進行兩組間比較，以P＜0.05 表示數據具有統計學差異。

2 結 果

2.1 bTBI 可誘導小鼠PTSD 樣焦慮抑郁行為

分別使用驅動段壓力為3.5、4.5 和5.5 MPa 的爆炸沖擊波建立小鼠bTBI 模型，波形曲線（圖1）顯示，小鼠頭部實際受到的沖擊波超壓峰值分別為225、360 和410 kPa。在造模后第15 d 和第16 d 分別對各組小鼠進行曠場實驗和高架十字迷宮實驗的行為學檢驗。曠場實驗結果顯示（表1），與Sham 組相比，3.5 MPa bTBI 組進入中心區域次數和中心區域運動距離百分比無明顯差異；4.5 和5.5 MPa bTBI 組進入中心區域次數和中心區域運動距離百分比均顯著降低（P＜0.05）。高架十字迷宮實驗結果顯示（表2），與Sham 組相比，bTBI 各組進入開臂次數百分比（γnoe）和進入開臂時間百分比（γnot）均顯著降低（P＜0.05）。在造模后第17 d Hamp;E 染色顯示（圖2），與Sham 組相比，3.5 MPa bTBI 組小鼠未見明顯組織、細胞結構損傷；4.5 和5.5 MPa 組皮層組織出現部分細胞結構破壞。以上結果表明，bTBI 可誘導小鼠PTSD樣焦慮抑郁行為。

2.2 Preso-/-動物bTBI 造模后未見明顯焦慮抑郁樣行為

Zhang 等[6] 前期已建立Preso-/-動物，實驗表明Preso 基因敲除不影響健康成年小鼠的運動、焦慮和空間記憶。為了確定Preso 是否與bTBI 誘導的PTSD 樣焦慮抑郁行為有關，選擇驅動段壓力為4.5 MPa的爆炸沖擊波建立bTBI 模型，通過曠場實驗和高架十字迷宮實驗對Preso-/-小鼠進行行為學檢驗。曠場實驗結果（表3）顯示，與Sham 組相比，bTBI 組進入中心區域次數和中心區域運動距離百分比無明顯差異。高架十字迷宮實驗結果（表4）顯示，與Sham 組相比，bTBI 組γnoe和γnot無明顯差異。以上結果表明，Preso 可能是bTBI 誘導PTSD 樣焦慮抑郁狀態的關鍵因素。

2.3 Preso/mGluR1 復合體在bTBI 后的表達變化

bTBI 損傷后，對C57 小鼠腦組織進行Western blot 檢測，結果顯示bTBI 組中的Preso 和mGluR1 與Sham 組相比表達無顯著性差異（圖3（a））。進一步的免疫共沉淀結果顯示bTBI 組中Preso 與mGluR1 之間的相互作用顯著增多（P＜0.05，圖3（b））。以上結果提示，bTBI 并不影響Preso/mGluR1 復合體中相關分子的表達變化，而是會增加Preso 與mGluR1 之間的相互作用，進而促進Preso/mGluR1 復合體的形成。

2.4 TAT-FERM 可阻斷bTBI 后Preso 與mGluR1 之間的相互作用

針對Preso 與mGluR1 之間的相互作用位點設計小分子干擾多肽TAT-FERM（GRKKRRQRRRPQKTLYNVEEE），阻斷Preso 的FERM 結構與mGluR1 的結合。Western blot 結果顯示，bTBI+TAT-FERM 組與bTBI+生理鹽水（SA）組相比，Preso 和mGluR1 的表達未見明顯改變（圖4（a）），但Preso 與mGluR1 的相互作用顯著減少（P＜0.05，圖4（b）），這表明TAT-FERM 有效阻斷了Preso 與mGluR1 之間的結合。

2.5 TAT-FERM 減輕bTBI 對小鼠PTSD 樣焦慮抑郁狀態的影響

建立C57 小鼠bTBI 模型后連續5 d 給其尾靜脈注射小分子多肽TAT-FERM 和生理鹽水（SA），隨后通過曠場實驗和高架十字迷宮實驗對其進行行為學檢驗。曠場實驗結果（表5）顯示，與SA 組相比，TAT-FERM 組進入中心區域次數無明顯差異，但中心區域運動距離百分比顯著升高（P＜0.05）。高架十字迷宮實驗結果（表6）顯示，與SA 組相比，TAT-FERM 組的γnoe和γnot均顯著升高（P＜0.05）。以上結果表明，bTBI 造模能誘致小鼠PTSD 樣焦慮抑郁狀態。

3 討 論

既往的研究發現，TBI 不但會引起急性神經系統損傷，其致傷效應還會不斷累積，進而導致遠期神經功能障礙，以認知障礙、情緒改變和創傷后應激等為典型癥狀[7]。bTBI 作為一種較特殊的TBI 類型，多見于經歷戰場環境的軍事作業人員，主要以輕型顱腦損傷為主[8]。雖然這種沖擊波引起的損傷效應并未導致明顯的腦組織結構性損害，但通過對退伍軍人的流行病學調查研究表明， bTBI 會顯著提高PTSD 的發生率[9]。

本研究通過小鼠動物模型模擬了不同致傷強度沖擊波的腦損傷效應，結果顯示，3.5 MPa 沖擊波所造成的腦損傷程度較輕，小鼠焦慮抑郁行為改變不顯著；經歷過4.5 和5.5 MPa bTBI 的實驗動物PTSD 樣改變更顯著，且與之對應的腦組織HE 染色結果表明存在部分細胞結構破壞。然而，bTBI 誘致PTSD 的生物學機制仍需要進一步探討。

谷氨酸受體介導的興奮性毒性損傷是TBI 后繼發性腦損害形成的重要機制，其中谷氨酸受體異常激活是其中關鍵的分子病理改變。mGluR1 是重要的谷氨酸受體亞型，在之前的研究中顯示其異常激活在TBI 后可加重神經元損傷[10]。此外，mGluR1 相關抑制劑可以在精神和心理疾病的治療中發揮潛在治療作用[11]。但是，一系列臨床研究表明，直接將mGluR1 作為干預靶點進行治療，并未在TBI 后PTSD 患者中發揮預期的效果，同時還帶來了許多副作用[12]。由此可見，深入探索mGluR1 在TBI 中的作用機理，對于尋找新的干預措施具有重要意義。

作為一種多結構域的突觸后支架蛋白， Preso 含有1 個FERM 結構域、1 個WW 結構域和2 個PDZ 結構域，其中FERM 結構域可與mGluR1 之間發生相互作用[5， 13]。本研究進一步證實，bTBI 造模未引起Preso-/-動物明顯的焦慮抑郁樣行為，而bTBI 造模對C57 小鼠Preso 和mGluR1 的表達也無顯著影響，但引起Preso 與mGluR1 之間的相互作用增強，從而促進Preso/mGluR1 復合體形成。Zhang 等[6] 的研究提示，調控Preso 與mGluR1 之間的相互作用能夠阻斷TBI 引起的急性神經元損傷。由此推測，bTBI 促進Preso/mGluR1 復合體形成極有可能是其誘致PTSD 癥狀的重要機制。

通過藥理學手段干預復合體形成，是探索突觸后蛋白復合體作用機制和發現干預靶點的重要方式。為了進一步明確Preso/mGluR1 復合體的作用，本研究針對Preso 與mGluR1 發生相互作用的FERM 結構域合成了小分子干擾多肽TAT-FERM。研究結果顯示，TAT-FERM 可以阻斷bTBI 后Preso 與mGluR1之間的相互作用，減少Preso/mGluR1 復合體形成。進一步的干預實驗表明，TAT-FERM 可以顯著改善bTBI 引起的PTSD 癥狀。這些結果不但證實了Preso/mGluR1 復合體在bTBI 相關PTSD 中的關鍵作用，同時也為開發潛在的藥物治療靶點提供了新的突破點。

4 結 論

顱腦沖擊傷（bTBI）可通過促進突觸后蛋白復合體Preso/mGluR1 形成，誘導bTBI 相關PTSD 樣行為學改變，而小分子多肽TAT-FERM 阻斷Preso/mGluR1 復合體形成可改善bTBI 誘導的PTSD 癥狀。

感謝陸軍軍醫大學大坪醫院張安強副教授團隊和清華大學莊茁教授團隊對實驗的支持和幫助。

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（責任編輯 張凌云）

基金項目： 國家重點研發計劃（2020-JCJQ-ZD-254-04）；國家自然科學基金（82171321）