BVDV-2d毒株的分離鑒定及同義密碼子使用模式分析

摘要： 本研究通過對腹瀉犢牛腸道內容物中分離到的牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）毒株進行分析，首次確認該毒株為BVDV-2d亞型，命名為22-Gansu-F3。通過病毒分離、鑒定及全基因組測序，本研究不僅探討了腹瀉犢牛腸道的病理變化，還分析了其同義密碼子使用模式的遺傳特征。結果表明，在開放閱讀框中，CpG二核苷酸的使用頻率顯著降低，并且在選擇同義密碼子的過程中，精氨酸對含CpG同義密碼子的使用具有顯著抑制作用。為了進一步明確不同功能性蛋白質編碼序列的同義密碼子使用模式的遺傳學特征，本研究比較了不同編碼序列的同義密碼子使用差異，發現N^pro和NS4A的編碼區在同義密碼子使用上與其他蛋白質顯著不同。此外，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的不同蛋白質編碼區在適應豬、羊和駱駝的同義密碼子使用模式上表現出良好的適應性，為這些動物體內病毒蛋白的翻譯提供了潛在的物質基礎。本研究結果為中國BVDV-2型的進化動態提供了新的理論依據，并為預防該亞型成為中國主要流行亞型提供了早期預警。

關鍵詞： 牛病毒性腹瀉病毒；BVDV-2d；病理變化；同義密碼子；遺傳

中圖分類號： S852.65 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2024）11-2111-11

Isolation， identification and analysis of synonymous codon usage patterns of BVDV-2d strain

YANG Xuanye^1，2， GAO Mingyang^1，2， HU Xinyan^1，2， WANG Jinqian^1，2， WANG Huihui^1，3， DING Yulin⁴， CAO Xiaoan³， MA Xiaoxia^1，2

（1.Biomedical Research Center/Key Laboratory of Biotechnology and Bioengineering of State Ethnic Affairs Commission， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China；2.School of Life Sciences and Engineering， Northwest Minzu University， Lanzhou 730010， China；3.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Lanzhou Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou 730046， China；4.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease， College of Veterinary Medicine， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot" 010018， China）

Abstract： This study analyzed a bovine viral diarrhea virus （BVDV） strain isolated from the intestinal contents of diarrheic calves， and classified it as subtype BVDV-2d for the first time and designated it as 22-Gansu-F3. Through viral isolation， identification， and whole-genome sequencing， this study not only explored the pathological changes in the intestines of diarrheic calves， but also analyzed the genetic characteristics of their synonymous codon usage pattern. Our findings revealed a significant reduction in the usage frequency of CpG dinucleotides within open reading frames. Besides， arginine showed notable suppression of synonymous codon usage containing CpG during the selection process for synonymous codon. To elucidate the genetic features of synonymous codon usage patterns among various functional protein-coding sequences， we compared the usage differences of synonymous codons in different coding sequences and found significant differences in the synonymous codon usage of the N^pro and NS4A encoding regions compared to other proteins. Furthermore， the different protein-coding regions of the BVDV-2d strain 22-Gansu-F3 exhibited good adaptability for synonymous codon usage pattern in pigs， sheep， and camels， and provided a potential material basis for the translation of viral proteins in these hosts. The research results offer new theoretical insights into the evolutionary dynamics of BVDV subtype 2 in China and serve as an early warning to prevent this subtype from becoming the predominant circulating subtype.

Key words： bovine viral diarrhea virus；BVDV-2d；pathological change；synonymous codon；heredity

牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）給中國養牛業造成了嚴重的破壞。根據侵染細胞后引起的不同的病變效應，將BVDV分為2種生物表型，即致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP）^[1]。由于BVDV基因組的高突變率，易感動物感染后通常導致不同的臨床癥狀^[2]。BVDV屬于黃病毒科瘟病毒屬的一員，擁有長度約12 kb的單股正鏈RNA基因組。病毒基因組編碼1個開放閱讀框（ORF），能夠編碼1個多聚蛋白質^[3]，該多聚蛋白質由N^pro、capsid、E0、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B組成^[4]。目前，在世界范圍內已鑒定出3種BVDV基因型：BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3（也稱為HoBi樣瘟病毒）^[5]。隨著中國集約化養牛業的發展，BVDV感染引起的重要流行傳染病越來越被重視，其中1b、1c、1m、1q、1v和2a型在中國最常見^[6-9]。

在病毒與宿主長期共同進化的過程中，BVDV進化出多種策略來逃避宿主的先天免疫和適應性免疫，從而促進病毒的生存和復制^[3，10-11]。在BVDV自身很強的遺傳變異率的推動下，其基因組在同義密碼子使用模式上表現出較大的遺傳差異，這有助于病毒完成感染并適應宿主內環境^[3，12]。以往中國BVDV流行病學的調查結果表明，BVDV-1型感染引起的陽性牛比例較高，BVDV-2型感染引起的陽性牛比例較低^[13-15]。此外，BVDV-2型毒株也與現有的BVDV-1型疫苗株存在抗原差異。相關生物學特征可能導致BVDV-2型在基因組結構上與BVDV-1型具有不同的遺傳模式，特別是在同義密碼子使用模式上表現出更明顯的差異^{[3，7，12，16-17]}。由于病毒蛋白質的同義密碼子使用模式可以在很大程度上反映病毒本身對宿主適應的進化動態，對BVDV-2型不同病毒蛋白質的同義密碼子使用模式的研究可以為BVDV-2型的進化途徑提供新的參考。本研究成功地從有明顯臨床癥狀（急性腹瀉）牛腸道內容物中分離出BVDV-2d毒株，命名為22-Gansu-F3。為了闡明BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的遺傳特性，本研究擬利用同義密碼子使用模式相關的分析方法對分離毒株基因組中不同編碼序列（N^pro、capsid、E0、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B）進行遺傳特性分析。

1 材料與方法

1.1 腹瀉牛腸道組織的采集

按照《中華人民共和國動物倫理審查指南》的相關要求，并經西北民族大學生命科學與工程學院動物倫理委員會和內蒙古農業大學獸醫學院動物倫理委員會批準，本研究對出現急性腹瀉臨床癥狀的犢牛尸體進行十二指腸、空腸、回腸和結腸組織樣品的收集，并將收集到的組織樣品放置于10%的福爾馬林中性緩沖液中進行固定處理，而后通過蘇木精-伊紅（HE）染色進行組織病理學檢測。對犢牛腸道內容物進行采集后，通過低溫冷鏈運輸至實驗室，置于-80 ℃保存以備后續研究。

1.2 毒株的檢測和亞型分類

使用TRIzol試劑（賽默飛世爾科技公司產品）從上述腸道內容物樣本中提取總RNA。RNA提取后根據M-MLV逆轉錄酶試劑盒（寶日醫生物技術有限公司產品）反轉錄為cDNA。利用本團隊前期檢測BVDV的方法^[7]對本試驗中的cDNA樣品進行RT-PCR特異性條帶[5′非翻譯區（UTR）序列區～250 bp]擴增。并對PCR結果進行測序，通過構建系統發育樹進一步分析遺傳分類。基于目前已經報道的不同基因亞型（BVDV1a-1u、BVDV2a-2d和BVDV3）的5′UTR序列（表1），利用MAGE 7.0軟件采用統計方法（鄰接進化樹法）對所擴增的5′UTR序列進行基因亞型的遺傳分析。

1.3 毒株的分離及毒價測定

使用10%（質量體積比）無鈣鎂磷酸鹽緩沖液將腸道內容物進行重懸，高速離心后，用0.22 μm微濾膜過濾上清液并進行除菌。用杜氏改良Eagle（DMEM）培養基與除菌后的上清液進行等體積混合后，將2 mL混合液加入匯合度約為50%的牛腎細胞系（MDBK）細胞培養物中，在5% CO₂和37 ℃的環境中孵育。2 h后棄掉上清液，并用DMEM培養基將細胞培養物洗滌3次，最后加入含有1%血清的DMEM病毒維持液培養細胞5 d。每天觀察細胞病變情況，連續盲傳5代。若犬腎細胞系（MDBK）細胞發生病變，則利用半數組織培養感染量（TCID₅₀）法進行病毒滴度檢測^[18]。

1.4 分離毒株基因組測序

根據GenBank數據庫中記錄的不同BVDV-2毒株的全基因組序列信息，按照BVDV不同毒株基因組中保守區設計出能夠覆蓋病毒全基因組的特異性引物序列（表2）。設計特異性引物來擴增覆蓋BVDV分離物全基因組的重疊區域（表2）。分別將RT-PCR擴增出來的特異性PCR產物利用DNA純化方法進行提取，而后插入pMD-18T（寶日醫生物技術有限公司產品）克隆載體上構成重組載體，并將鑒定為陽性的克隆載體送擎科生物技術有限公司進行測序。利用DNASTAR軟件中的EdiSeq程序進行編輯和裁剪，以組成完整的BVDV基因組。

1.5 分析分離毒株基因組的同義密碼子使用遺傳特征

基于分離毒株全基因組的核苷酸信息，利用相對同義密碼子使用度（RSCU）來評估目標編碼序列的同義密碼子使用偏嗜性^[19]。根據用RSCU判定同義密碼子使用偏嗜性的標準，RSCU越高，相應的同義密碼子使用的頻次越高；反之，使用頻次就越低。同義密碼子使用頻次越高或越低均表現出明顯的使用偏嗜性。為了界定59種同義密碼子使用偏嗜的程度，將RSCU值大于1.6和小于0.6的同義密碼子分別定義為優勢密碼子和劣勢密碼子。

分離毒株基因組中不同蛋白質編碼序列，分別利用RSCU計算公式進行計算，并利用主成分分析法（PCA）將代表59個維度的59種同義密碼子的RSCU數據降維后，制作2維散點圖，進行可視化處理^[20]。2維散點圖由PCA獲得的第1主成分參數（f′₁）和第2主成分參數（f′₂）構成，通過散點所表現出來的群體特征來展現目標編碼序列在同義密碼子使用模式上遺傳相似性的差異。此外，采用有效密碼子指數（ENC）分析突變壓力和自然選擇壓力對分離毒株不同編碼區同義密碼子使用模式的影響程度^[21]。根據ENC值的值域定義，當ENC值為61時，目標編碼序列的所有同義密碼子使用頻率是平均和隨機的（同義密碼子使用偏嗜性最弱）；當ENC值為20時，目標序列所編碼的氨基酸只選擇一種特定的同義密碼子來進行編碼（同義密碼子使用偏嗜性最強）。由編碼序列密碼子第3位的G+C含量（GC3）以及ENC值組成的散點圖能更明了地展示編碼序列結構與同義密碼子使用偏嗜性之間的相關性。

1.6 分析分離毒株不同編碼區對不同宿主同義密碼子使用模式的相似度

利用同義密碼子使用模式相似性指數的分析方法^[22]，分析病毒基因組中不同編碼序列同義密碼子使用模式與目標宿主同義密碼子使用模式之間的相似度。計算公式如下：

其中，R（A，B）反映向量A（病毒編碼序列）與向量B（目標宿主）在同義密碼子使用模式上呈現的矢量夾角的余弦值。a_i代表病毒編碼序列59個同義密碼子中密碼子i的RSCU值，b_i表示目標宿主密碼子i的RSCU值。D（A，B）反映病毒編碼序列與宿主在同義密碼子使用模式上的相似度，即數值越小，相似度越高。此外，本研究中所涉及的宿主包括牛、羊、豬、小鼠、兔和駱駝，并且特定宿主的同義密碼子使用模式可以在已報道的密碼子數據中查詢獲得^[23]。

2 結果與分析

2.1 BVDV毒株的分離與鑒定

利用RT-PCR技術可從腹瀉犢牛腸道內容物中擴增出特異性PCR產物條帶，經過測序獲得其5′UTR的序列信息。將獲得的序列信息與已知BVDV不同亞型5′UTR序列進行系統進化樹分析，發現其與BVDV-2d亞型的遺傳距離接近（圖1），將分離毒株命名為22-Gansu-F3。該毒株能夠致MDBK細胞發生細胞病變，使用TCID₅₀法測定毒價為10^-5.125/mL。

2.2 腹瀉犢牛腸道組織病變檢測

利用HE染色法，對所采集的腹瀉犢牛不同腸道組織進行病理學分析發現，十二指腸纖維化嚴重，黏膜層結構被嚴重破壞并伴隨小腸絨毛脫落（圖2A）；空腸固有層大量淋巴細胞、巨噬細胞、吞噬細胞和中性粒細胞聚集（圖2B）；回腸淋巴母細胞損傷導致淋巴細胞中心耗竭，腸上皮細胞腫脹、壞死、破裂（圖2C）；結腸上皮細胞大量脫落壞死并且伴隨纖維化（圖2D）。上述不同腸道組織的病變很可能是22-Gansu-F3毒株感染犢牛導致病毒性腹瀉的病理原因。

2.3 BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株同義密碼子使用偏嗜性

對BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株全基因組的RSCU值進行計算，結果表明，59種同義密碼子使用模式具有明顯的偏嗜性（表3）。具有2個同義密碼子的氨基酸在同義密碼子使用模式中是相對較平衡的，即RSCU數值在1.00左右波動；然而具有2種以上同義密碼子家族的氨基酸在同義密碼子使用模式上表現出明顯的偏嗜性。在這些具有明顯使用偏嗜性的同義密碼子中，使用頻率偏高的同義密碼子為編碼絲氨酸的AGU，編碼脯氨酸的CCA，編碼蘇氨酸的ACA，編碼精氨酸的AGA和AGG；使用頻率偏低的同義密碼子為編碼亮氨酸的CUU和CUC，編碼異亮氨酸的AUU，編碼絲氨酸的UCG，編碼丙氨酸的GCG，編碼脯氨酸的CCG，編碼蘇氨酸的ACG，編碼精氨酸的CGU、CGC、CGA和CGG。從表3可知，含有CpG二核苷酸的同義密碼子的使用被相對應編碼的氨基酸顯著抑制，并且精氨酸的6種同義密碼子（CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和AGG）使用模式均呈現出顯著的使用偏嗜性。這些結果表明BVDV-2d型 22-Gansu-F3毒株基因組在同義密碼子使用上受到遺傳選擇壓力的影響。

2.4 BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼序列具有不同的密碼子使用偏嗜性

根據ENC-GC3散點圖評判規則，散點越接近期望曲線，則其對應的編碼序列在同義密碼子使用模式上越受到核苷酸突變選擇壓力的影響，反之，散點越偏離期望曲線，則其對應的編碼序列在同義密碼子使用模式上越受到自然選擇壓力的影響^[21]。利用ENC-GC3散點圖對BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同蛋白質編碼序列進行分析，發現不同編碼序列的密碼子使用模式具有差異性，并且所有編碼序列的ENC值均位于“倒鐘”形期望曲線下方（圖3）。除了N^pro和NS4A編碼序列外，其余非結構蛋白質和結構蛋白質的編碼序列具有相似的密碼子使用偏嗜性。此外，NS4A編碼序列的密碼子偏嗜性最強，而N^pro編碼序列的密碼子偏嗜性最弱。這些結果均表明，突變選擇壓力與自然選擇壓力對BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株基因組的不同蛋白質編碼序列的影響是不均一的，且在N^pro和NS4A編碼序列上表現得更為突出。

基于ENC-GC3散點圖所反映出的密碼子使用偏嗜性（圖3），進一步利用主成分分析（PCA）法將BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株基因組中的不同編碼序列區與開放閱讀框（ORF）進行同義密碼子使用模式遺傳差異性的分析。結果（圖4）表明，NS2蛋白[第1主成分參數（f′₁）=0.19，第2主成分參數（f′₂）=0.10]與ORF（f′₁=0.21， f′₂=0.22）在同義密碼子使用模式方面具有極高的相似性，其他病毒編碼序列均不同程度地與ORF同義密碼子使用模式存在遺傳差異（圖4）。此外，NS5A（f′₁=0.40， f′₂=0.08）和NS5B（f′₁=0.42， f′₂=0.15）二者在同義密碼子使用模式上具有極高的遺傳相似性；而N^pro（f′₁=1.37， f′₂=-0.60）、P7（f′₁=-0.73， f′₂=-3.04）、NS3（f′₁=0.03， f′₂=0.51）、NS4A（f′₁=-2.91， f′₂=0.80）和NS4B（f′₁=-0.26， f′₂=-0.16）作為非結構蛋白質在同義密碼子使用模式上表現出明顯的遺傳差異。與非結構蛋白質編碼序列相比，雖然4種結構蛋白質在同義密碼子使用模式上的遺傳相似性較高，但是彼此之間也存在同義密碼子使用模式上的顯著遺傳差異，即C（f′₁=0.64， f′₂=0.36）、E0 （f′₁=0.46， f′₂=0.68）、E1（f′₁=-0.01， f′₂=-0.01）和E2 （f′₁=0.18， f′₂=0.98）。上述結果說明，生物學功能在特定病毒區域的同義密碼子使用模式中起著重要作用。

2.5 BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼區對宿主同義密碼子使用模式的差異性

鑒于BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼序列在突變選擇壓力與自然選擇壓力共同作用下所表現出來的同義密碼子使用的遺傳多樣性，相應的編碼序列在不同宿主細胞中的翻譯適應性的差異可以通過評估其與特定宿主同義密碼子使用模式的相似程度來展示。如圖5所示，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株的NS5B編碼區對6種宿主的密碼子使用適應性最高，而P7編碼區對這些宿主的密碼子使用適應性最低。除P7編碼區外，NS4A編碼區對宿主的密碼子使用適應性明顯較弱。由于BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株是牛源病毒株，我們建立了BVDV對牛密碼子使用適應性相關的參考（圖5B），以進一步評估該毒株在密碼子使用時對其他敏感宿主的適應程度。除此之外，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株不同編碼序列與豬、羊和駱駝在同義密碼子使用模式的相似度方面十分接近（圖5A、5C、5F）。此外，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株所有蛋白質編碼區域與小鼠的同義密碼子使用模式的相似度是最高的（圖5D），而其與家兔的同義密碼子使用模式的相似度最低（圖5E）。上述病毒不同編碼序列對宿主同義密碼子使用模式的適應性可以為今后深入研究BVDV-2d型22-Gansu-F3在其他宿主細胞內的蛋白質表達提供一些參考依據。

3 討論

當前中國畜禽養殖業處于高速發展的階段，這也為BVDV這種高突變率的病毒在易感動物中迅速傳播以及不斷產生新的突變亞型提供了極好的條件^{[8，9，24-25]}。針對由BVDV感染引起的腹瀉臨床病例，最快速有效的鑒定方法就是利用RT-PCR擴增5′UTR序列，并構建進化樹分析亞型分類；另外，病理切片也是深入了解BVDV感染導致腸道病理變化最直接的手段。本研究從中國甘肅省1頭急性腹瀉犢牛中分離到1株BVDV-2d基因型的田間毒株（22-Gansu-F3），并且通過病理切片分析發現腹瀉犢牛腸道組織的病變特征。當前，在中國分離的BVDV毒株基因型主要為1a～1d、1m～1n、1o～1q、1u、2a和2b^[9，26-27]。本研究在甘肅省養牛場分離并鑒定出來的BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株是該地區首次發現的田間毒株。與一些已經分離并定型的BVDV田間毒株不同，22-Gansu-F3毒株能夠引起犢牛的嚴重腹瀉，甚至造成犢牛死亡。這一致病特征不同于其他基因亞型（例如BVDV-1b和BVDV-1d）對犢牛致病力輕的特征，需防范其流行于中國不同地域^[28-29]。BVDV感染易感動物后通常會造成動物體內淋巴細胞的極速衰竭，最終導致患病動物免疫力降低，加重臨床癥狀^[30]。22-Gansu-F3毒株侵染犢牛后可引發腸道不同部位發生病理變化，可見空腸淋巴細胞被誘導增強，回腸淋巴細胞耗竭。鑒于病毒作為一種必須在活細胞中進行自我復制和快速進化的生物體^[31-32]， BVDV感染可影響宿主代謝網絡的正常狀態及補體系統的抗病毒狀態等^[33]，最終導致種類繁多的BVDV基因亞型對宿主的致病性也呈現出多樣性。

此外，對分離毒株進行遺傳進化的相關性分析，有助于研究被新型BVDV感染的犢牛器官組織發生的病理變化以及引起的特異性免疫應答。22-Gansu-F3毒株的基因組在密碼子使用模式上顯著抑制了多種同義密碼子的選擇使用，尤其是含有CpG二核苷酸的同義密碼子。由于CpG和UpA二核苷酸能夠在一定程度上刺激宿主的免疫反應，大多數感染哺乳動物和其他脊椎動物的RNA病毒對UpA和CpG二核苷酸有很大的抑制作用^[34-35]。此外，CpG二核苷酸可以顯著誘導由干擾素（IFN）激活的抗病毒活性^[36-37]。22-Gansu-F3毒株低頻率選擇含有CpG二核苷酸的同義密碼子，從而抑制IFN激活的抗病毒作用。22-Gansu-F3毒株除了在密碼子使用模式上抑制一些同義密碼子外，還依賴于具有特定密碼子使用模式的N^pro和 NS4A蛋白來成功維持其在宿主中的復制。N^pro蛋白作為一種獨特的蛋白酶，其在BVDV生命周期中發揮著多種生物學活性，例如水解酶活性和拮抗干擾素的活性等^[38-39]。NS4A可以作為NS3蛋白酶輔助因子、復制酶組分和病毒粒子成熟的輔助因子^[40]。同義密碼子使用模式的特殊性對目標蛋白質在翻譯、空間構象形成以及生物學活性方面均具有影響力^[41]。BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株N^pro和 NS4A蛋白同義密碼子使用模式表現出來的遺傳特異性與其具有多種生物學功能是相關的。除此之外，雖然與BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株ORF相比，P7編碼區具有明顯不同的同義密碼子使用模式，但P7編碼區在核苷酸成分限制介導的突變選擇壓力主導下形成的同義密碼子使用模式與病毒ORF的使用模式相似度較高。BVDV P7蛋白在感染性病毒顆粒的形成中起著重要作用，并協助病毒有效釋放^[42]。P7區密碼子的整體使用也可能在一定程度上受到P7蛋白生物學功能的影響。這種遺傳特征可能反映了P7蛋白的整體密碼子使用需要適應病毒多聚蛋白質的密碼子使用。除了形成不同病毒蛋白質的密碼子使用模式外，這些蛋白質對宿主的密碼子使用適應程度也影響其在不同源性細胞中的翻譯。值得注意的是，BVDV-2d型22-Gansu-F3毒株蛋白對不同宿主表現出高度的密碼子使用適應能力，表明該毒株具有在上述宿主細胞中正常翻譯表達的潛在能力。已有研究結果表明，BVDV-2毒株能夠采用與BVDV-1相似的翻譯動力學在豬源細胞中正常翻譯表達，并且導致豬相關組織發生病變^[43-44]。雖然尚無BVDV-2侵染駱駝的相關報道，但是BVDV-1能夠在駱駝體內完成復制的研究已有報道^[45]。Qi等^[46]指出BVDV不同毒株對宿主的感染范圍已經從牛擴大到了包括羊、豬和駱駝在內的其他偶蹄類動物。研究人員也注意到，兔子能夠作為BVDV的一種自然疫源性中間宿主來感染野外放養的牛群，只是兔子對于BVDV傳播流行方面的作用目前還不是很強^[47]。小鼠已經能夠作為一種BVDV試驗感染模型來研究BVDV侵染對宿主免疫系統抗病毒方面的分子機制^[48-49]。BVDV在小鼠體內順利增殖的生物學特性同時也為野外嚙齒類動物感染或者攜帶BVDV進而感染野外散養牛群增加了潛在風險。鑒于BVDV2d型22-Gansu-F3毒株在本研究中涉及到不同宿主的同義密碼子使用模式的良好適應性，有必要加強對其傳播擴散的監測，從而降低BVDV-2d型22-Gansu-F3的傳播流行對易感動物健康的影響。

4 結論

在本研究中，從具有急性腹瀉癥狀的犢牛腸道內容物中成功分離出1株細胞病變型的田間毒株BVDV-2d型22-Gansu-F3。5′UTR的系統發育樹分析結果顯示，BVDV-2d型22-Gansu-F3為中國甘肅省內首次發現的BVDV-2d基因亞型田間毒株。雖然BVDV-2d型22-Gansu-F3不是中國主要流行的BVDV毒株，但該毒株可導致牛急性腹瀉癥狀，并對牛腸道不同部位造成不同程度的病理損傷。進一步分析該毒株基因組在同義密碼子使用模式方面的遺傳特性，發現BVDV-2d型22-Gansu-F3對不同種屬宿主表現出良好的密碼子使用模式上的適應性，這有助于今后深入研究BVDV-2亞型毒株在不同宿主體內復制的相關機制。同時，本研究建議將BVDV-2d毒株在國內的傳播流行納入監測范疇，防止其成為國內優勢流行毒株。

參考文獻：

[1] RIDPATH J F. BVDV genotypes and biotypes： practical implications for diagnosis and control[J]. Biologicals：Journal of the International Association of Biological Standardization，2003，31（2）：127-131.

[2] LANYON S R， HILL F I， REICHEL M P， et al. Bovine viral diarrhoea：pathogenesis and diagnosis[J]. Veterinary Journal，2014，199（2）：201-209.

[3] ZHOU J H， GAO Z L， ZHANG J， et al. Comparative the codon usage between the three main viruses in pestivirus genus and their natural susceptible livestock[J]. Virus Genes，2012，44（3）：475-481.

[4] DENG R， BROCK K V. Molecular cloning and nucleotide sequence of a pestivirus genome， noncytopathic bovine viral diarrhea virus strain SD-1[J]. Virology，1992，191（2）：867-869.

[5] BAUERMANN F V， RIDPATH J F. HoBi-like viruses-the typical ‘atypical bovine pestivirus’[J]. Animal Health Research Reviews，2015，16（1）：64-69.

[6] DENG M L， JI S K， FEI W T， et al. Prevalence study and genetic typing of bovine viral diarrhea virus （BVDV） in four bovine species in China[J]. PLoS One，2015，10（4）：e0121718.

[7] WANG H H， WANG M Z， FENG X L， et al. Genetic features of bovine viral diarrhea virus subgenotype 1c in newborn calves at nucleotide and synonymous codon usages[J]. Frontiers in Veterinary Science，2022，9：984962.

[8] ZHANG K， ZHANG J Y， QIU Z Y， et al. Prevalence characteristic of BVDV in some large scale dairy farms in Western China[J]. Frontiers in Veterinary Science，2022，9：961337.

[9] ZHU J， WANG C， ZHANG L N， et al. Isolation of BVDV-1a， 1m， and 1v strains from diarrheal calf in china and identification of its genome sequence and cattle virulence[J]. Frontiers in Veterinary Science，2022，9：1008107.

[10]YARNALL M J， THRUSFIELD M V. Engaging veterinarians and farmers in eradicating bovine viral diarrhoea：a systematic review of economic impact[J]. The Veterinary Record，2017，181（13）：347.

[11]EVANS C A， PINIOR B， LARSKA M， et al. Global knowledge gaps in the prevention and control of bovine viral diarrhoea （BVD） virus[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2019，66（2）：640-652.

[12]MA X X， MA P， CHANG Q Y， et al. The analyses of relationships among nucleotide， synonymous codon and amino acid usages for E2 gene of bovine viral diarrhea virus[J]. Gene，2018，660：62-67.

[13]WANG L N， WU X M， WANG C B， et al. Origin and transmission of bovine viral diarrhea virus type 1 in China revealed by phylodynamic analysis[J]. Research in Veterinary Science，2020，128：162-169.

[14]ZHOU Y， REN Y， DAI G， et al. Genetic characterization and clinical characteristics of bovine viral diarrhea viruses in cattle herds of Heilongjiang province， China[J]. Iranian Journal of Veterinary Research，2022，23（1）：69-73.

[15]CHANG L L， QI Y P， LIU D， et al. Molecular detection and genotyping of bovine viral diarrhea virus in Western China[J]. BMC Veterinary Research，2021，17（1）：66.

[16]GAO M Y， YANG X Y， WU Y H， et al. Analysis for codon usage bias in membrane anchor of nonstructural protein 5A from BVDV[J]. Journal of Basic Microbiology，2023，63（10）：1106-1114.

[17]MUCELLINI C I， SILVA JU＇NIOR J V J， DE OLIVEIRA P S B， et al. Novel genomic targets for proper subtyping of bovine viral diarrhea virus 1 （BVDV-1） and BVDV-2[J]. Virus Genes，2023，59（6）：836-844.

[18]MUHSEN M， AOKI H， IKEDA H， et al. Biological properties of bovine viral diarrhea virus quasispecies detected in the RK13 cell line[J]. Archives of Virology，2013，158（4）：753-763.

[19]SHARP P M， LI W H. Codon usage in regulatory genes in Escherichia coli does not reflect selection for rare codons[J]. Nucleic Acids Research，1986，14（19）：7737-7749.

[20]GUSTAFSSON C， GOVINDARAJAN S， MINSHULL J. Codon bias and heterologous protein expression[J]. Trends in Biotechnology，2004，22（7）：346-353.

[21]WRIGHT F. The ‘effective number of codons’ used in a gene[J]. Gene，1990，87（1）：23-29.

[22]ZHOU J H， ZHANG J Z， SUN D J， et al. The distribution of synonymous codon choice in the translation initiation region of dengue virus[J]. PLoS One，2013，8（10）：e77239.

[23]NAKAMURA Y， GOJOBORI T， IKEMURA T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases：status for the year 2000[J]. Nucleic Acids Research，2000，28（1）：292.

[24]DIAO N C， GONG Q L， LI J M， et al. Prevalence of bovine viral diarrhea virus （BVDV） in yaks between 1987 and 2019 in mainland China：a systematic review and meta-analysis[J]. Microbial Pathogenesis，2020，144：104185.

[25]SHAH P T， NAWAL BAHOUSSI A， AHMAD A， et al. Bovine viral diarrhea virus in China：a comparative genomic and phylogenetic analysis with complete genome sequences[J]. Frontiers in Veterinary Science，2022，9：992678.

[26]YESILBAG K， ALPAY G， BECHER P. Variability and global distribution of subgenotypes of bovine viral diarrhea virus[J]. Viruses，2017，9（6）：128.

[27]WANG W， SHI X C， CHEN C Y， et al. Genetic characterization of a noncytopathic bovine viral diarrhea virus 2b isolated from cattle in China[J]. Virus Genes，2014，49（2）：339-341.

[28]ZHANG S Q， TAN B， DING Y L， et al. Complete genome sequence and pathogenesis of bovine viral diarrhea virus JL-1 isolate from cattle in China[J]. Virology Journal，2014，11：67.

[29]BIANCHI M V， KONRADT G， DE SOUZA S O， et al. Natural outbreak of BVDV-1d-induced mucosal disease lacking intestinal lesions[J]. Veterinary Pathology，2017，54（2）：242-248.

[30]KELLING C L， STEFFEN D J， COOPER V L， et al. Effect of infection with bovine viral diarrhea virus alone， bovine rotavirus alone， or concurrent infection with both on enteric disease in gnotobiotic neonatal calves[J]. American Journal of Veterinary Research，2002，63（8）：1179-1186.

[31]KOONIN E V， DOLJA V V， KRUPOVIC M. The logic of virus evolution[J]. Cell Host amp; Microbe，2022，30（7）：917-929.

[32]SANJUáN R， DOMINGO-CALAP P. Mechanisms of viral mutation[J]. Cellular and Molecular Life Sciences，2016，73（23）：4433-4448.

[33]LIU C， LIU Y H， LIANG L， et al. RNA-Seq based transcriptome analysis during bovine viral diarrhoea virus （BVDV） infection[J]. BMC Genomics，2019，20（1）：774.

[34]ATKINSON N J， WITTEVELDT J， EVANS D J， et al. The influence of CpG and UpA dinucleotide frequencies on RNA virus replication and characterization of the innate cellular pathways underlying virus attenuation and enhanced replication[J]. Nucleic Acids Research，2014，42（7）：4527-4545.

[35]FROS J J， DIETRICH I， ALSHAIKHAHMED K， et al. CpG and UpA dinucleotides in both coding and non-coding regions of echovirus 7 inhibit replication initiation post-entry[J]. eLife，2017，6：e29112.

[36]MAGNUSSON M， MAGNUSSON S， VALLIN H， et al. Importance of CpG dinucleotides in activation of natural IFN-alpha-producing cells by a lupus-related oligodeoxynucleotide[J]. Scandinavian Journal of Immunology，2001，54（6）：543-550.

[37]UCCELLINI M B， BUSCONI L， GREEN N M， et al. Autoreactive B cells discriminate CpG-rich and CpG-poor DNA and this response is modulated by IFN-alpha[J]. Journal of Immunology，2008，181（9）：5875-5884.

[38]CHI S S， CHEN S， JIA W J， et al. Non-structural proteins of bovine viral diarrhea virus[J]. Virus Genes，2022，58（6）：491-500.

[39]TAO J， LIAO J H， WANG J Y， et al. Pig BVDV-2 non-structural protein （Npro） links to cellular antiviral response in vitro[J]. Virus Genes，2017，53（2）：233-239.

[40]FELLENBERG J， DUBRAU D， ISKEN O， et al. Packaging defects in pestiviral NS4A can be compensated by mutations in NS2 and NS3[J]. Journal of Virology，2023，97（9）：e0057223.

[41]ZHOU M， GUO J H， CHA J， et al. Non-optimal codon usage affects expression， structure and function of clock protein FRQ[J]. Nature，2013，495（7439）：111-115.

[42]OESTRINGER B P， BOLIVAR J H， CLARIDGE J K， et al. Hepatitis C virus sequence divergence preserves p7 viroporin structural and dynamic features[J]. Scientific Reports，2019，9（1）：8383.

[43]XU X R， ZHANG Q C， YU X L， et al. Sequencing and comparative analysis of a pig bovine viral diarrhea virus genome[J]. Virus Research，2006，122（1/2）：164-170.

[44]TAO J， WANG Y， WANG J， et al. Identification and genetic characterization of new bovine viral diarrhea virus genotype 2 strains in pigs isolated in China[J]. Virus Genes，2013，46（1）：81-87.

[45]GAO S D， LUO J H， DU J Z， et al. Serological and molecular evidence for natural infection of Bactrian camels with multiple subgenotypes of bovine viral diarrhea virus in Western China[J]. Veterinary Microbiology，2013，163（1/2）：172-176.

[46]QI S H， WO L J， SUN C， et al. Host cell receptors implicated in the cellular tropism of BVDV[J]. Viruses，2022，14（10）：2302.

[47]GRANT D M， DAGLEISH M P， BACHOFEN C， et al. Assessment of the rabbit as a wildlife reservoir of bovine viral diarrhea virus：serological analysis and generation of trans-placentally infected offspring[J]. Frontiers in Microbiology，2015，6：1000.

[48]LIU Y， WU C H， CHEN N N， et al. PD-1 Blockade restores the proliferation of peripheral blood lymphocyte and inhibits lymphocyte apoptosis in a balb/c mouse model of CP BVDV acute infection[J]. Frontiers in Immunology，2021，12：727254.

[49]CHEN N N， JIANG D J， SHAO B H， et al. Anti-BVDV activity of traditional chinese medicine monomers targeting NS5B （RNA-dependent RNA polymerase） in vitro and in vivo[J]. Molecules，2023，28（8）：3413.

（責任編輯：陳海霞）