藥用植物穿心蓮離體培養技術及其應用研究進展

摘要： 穿心蓮為我國重要的南藥之一，用于清熱解毒、涼血消腫，其主要活性成分穿心蓮內酯具有抗癌、抗HIV病毒、抗炎、保肝等功效。然而，穿心蓮內酯人工合成難度較大，主要從人工栽培的植物原料中提取，栽培植物原料的質量因受土壤、氣候、水肥管理等各種因素的影響而參差不齊，穿心蓮生長周期長且占用土地資源。植物離體培養技術在種苗快繁及活性成分積累等方面都具有顯著優勢，是實現穿心蓮活性成分快速、高效生產的重要途徑之一。穿心蓮組織離體再生技術體系日益完善，從外植體到完整植株的組織離體再生技術日漸成熟，已在種苗繁育、倍性育種等方面有了一定的應用。同時，在穿心蓮愈傷組織培養、細胞懸浮培養、不定根培養、毛狀根培養過程中，通過優化培養條件和使用適宜的誘導子可大幅增加培養物中穿心蓮內酯等活性成分的積累。該文分別從穿心蓮組織、細胞、不定根及毛狀根培養等方面，全面系統地綜述了近年來國內外關于穿心蓮離體培養技術以及其生產穿心蓮內酯的研究進展，以期促進穿心蓮離體培養技術的發展與應用，為離體生產穿心蓮內酯的研究提供參考。此外，還提出了未來在穿心蓮離體培養技術及通過該技術生產穿心蓮內酯的研究中需重點關注的3個方面：（1）熟化完善穿心蓮組織離體再生技術體系，建立全面系統的評價體系；（2）優化培養條件和高效誘導子聯用，進一步提高穿心蓮內酯等重要活性成分產量；（3）開展通過細胞懸浮培養技術生產穿心蓮內酯的生物反應器培養研究。

關鍵詞： 穿心蓮， 組織培養， 細胞懸浮培養， 穿心蓮內酯， 進展

中圖分類號： Q945文獻標識碼： A文章編號： 1000-3142（2024）07-1392-11

Research progress of in vitro culture technology and itsapplication of medicinal plant Andrographis paniculata

CHEN Dongliang1*， ZHONG Chu2， JIAN Shaofen2

（ 1. Institute of Cash Crops， Guangxi Academy of Agricultural Sciences， Nanning 530007， China; 2. National Center forTMC Inheritance and Innovation， Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants， Nanning 530023， China ）

Abstract： Andrographis paniculata is one of the most important “Southern Medicines” in China. It is used for clearing heat and detoxifying， cooling blood and reducing swelling. Its main active ingredient andrographolide has functions in anti-cancer， anti-HIV， anti-inflammation and liver protection. Andrographolide is difficult to be synthesized artificially， mainly relying on extraction from cultivated plant materials. However， the quality of cultivated medicinal materials is affected by various factors such as soil， climate， water and fertilizer managements， and A. paniculata has a long growth cycle， occupying land resources. The technology of plant in vitro culture has significant advantages in rapid propagation of seedling and accumulation of active ingredients， which is one of the important ways to achieve production of active ingredients rapidly and efficiently in A. paniculata. The in vitro regeneration technology system of A. paniculata is becoming increasingly perfect， and the in vitro regeneration technology from explants to complete plants is becoming more and more mature， and it has been applied in seedling propagation and ploidy breeding. At the same time， during callus culture， cell suspension culture， adventitious root culture and hairy root culture of A. paniculata， the accumulation of andrographolide and other active ingredients in the culture could be greatly increased by optimizing the culture conditions and using appropriate inducers. This paper comprehensively and systematically reviewed the research advances on the in vitro culture technology of A. paniculata and production of andrographolide from the aspects of tissue， cell， adventitious root， and hairy root cultures. This paper aimed to provide reference for promoting the development and application of in vitro culture technology of A. paniculata， as well as for the study of in vitro production of andrographolide. It also put forward three aspects that need be focused on in future research on in vitro culture technology of A. paniculata and the production of andrographolides by this technology： （1） To mature and improve the tissues in vitro regeneration technology system of A. paniculata， and to establish a comprehensive and systematic evaluation system; （2） To further increase the yield of andrographolide and other important active ingredients by optimizing the culture conditions and its combination with efficient inducers; （3） To carry out researches in bioreactor culture of the production of andrographolide by cell suspension culture technology.

Key words： Andrographis paniculata， tissue culture， cell suspension culture， andrographolide， advances

穿心蓮（Andrographis paniculata ）又名一見喜、印度草、欖核蓮，為爵床科（Acanthaceae）穿心蓮屬（Andrographis）一年生草本藥用植物，其干燥地上部分入藥，具有清熱解毒、涼血消腫之功效（國家藥典委員會，2020）。穿心蓮是國家基本藥物婦科千金片、消炎利膽片等中成藥的主要原料，也是穿心蓮內酯滴丸、金雞膠囊、穿心蓮片、復方穿心蓮片、清火梔麥片、玉葉清火膠囊等多種中成藥的主要組分。穿心蓮地上部分主要活性成分穿心蓮內酯是近70年來研究最廣泛的天然產物之一，已經大量應用于臨床，在抗癌、抗HIV病毒、抗炎、保肝等方面效果顯著（Islam et al.， 2018; Burgos et al.， 2020; Ren et al.， 2021）。隨著對穿心蓮及其活性成分藥用價值的不斷開發，穿心蓮內酯等活性成分商業化需求量巨大。但是，因其結構復雜、人工合成難度較大，目前主要從人工栽培而來的植物原料中提取。盡管穿心蓮已在印度、巴基斯坦、斯里蘭卡、泰國、馬來西亞、中國和印度尼西亞等國家進行了廣泛種植（Kandanur et al.， 2019；陳東亮等，2020），但由于穿心蓮內酯的生物合成和積累與栽培種的基因型、栽培模式、氣候因子、地理環境等有關（Tajidin et al.， 2019; Rafi et al.， 2020; Dalawai et al.， 2021; 鐘楚等， 2021），加上穿心蓮栽培面積受日益緊縮的土地資源約束，故僅依靠從農業生產而來的植物原料中提取穿心蓮內酯具有一定的局限性。

植物組織、器官、細胞等離體培養已經發展成為最具吸引力的次生代謝物生產替代途徑之一（Murthy et al.， 2014；Espinosa-Leal et al.， 2018）。植物離體培養技術包括組織培養、細胞懸浮培養、不定根培養、毛狀根培養及原生質體培養等技術，其在保持藥用植物種性、藥用活性成分積累及遺傳轉化等研究方面都具有顯著優勢。穿心蓮組織培養技術研究始于20世紀70年代，目前技術體系日益完善，從外植體到完整植株的組織離體再生技術日漸成熟，已在種苗繁育、倍性育種等方面有了一定的應用。同時，在穿心蓮愈傷組織培養、細胞懸浮培養、不定根培養、毛狀根培養過程中，通過優化培養條件和使用適宜的誘導子可大幅增加培養物中穿心蓮內酯等活性成分的積累。

本文從穿心蓮組織、細胞、不定根及毛狀根培養等方面，全面系統地綜述了近年來穿心蓮離體培養技術以及通過離體培養技術生產其主要活性成分的研究進展，并分析存在的問題，同時提出了進一步研究的方向，旨在促進穿心蓮離體培養技術的研究與應用以及進一步發展。

1穿心蓮組織培養

1.1 穿心蓮組織培養技術研究概況

植物組織培養的效果主要取決于外植體的選擇以及消毒、培養基種類、植物激素的配比、培養條件等因素。

1.1.1 外植體外植體是否能接種成功決定于其取材部位、取材的時間、消毒方式等因素。在穿心蓮組織培養過程中，植株葉片、腋芽、莖段、帶腋芽莖段及莖尖等部位均可作為外植體進行組織培養，但多數研究認為以其葉片和帶腋芽的莖段為外植體進行組織培養效果較好（Purkayastha et al.， 2008; Bansi & Rout， 2013; 陳榮珠， 2017; 戴燚等， 2018）。酒精、次氯酸鈉、氯化汞等試劑可用于穿心蓮外植體消毒，但消毒劑的濃度和消毒時間對外植體影響較大。陳榮珠（2017）和戴燚等（2018）的研究發現，當以帶腋芽莖段為外植體時，先用75%酒精消毒15 s，再用3%次氯酸鈉消毒30 min，其消毒效果最好，存活率高達56.33%；當用種子作為外植體時，先用75%酒精消毒15 s，再用3%次氯酸鈉消毒20 min，其存活率達到78.67%。

1.1.2 培養基基本培養基作為植物組織培養中主要的營養來源，其成分以及含量多少都直接影響外植體的生長和分化增殖狀態，不同的外植體使用的培養基種類也有所不同。黃格等（2010）研究認為MS是最適合穿心蓮芽增殖和生長的基本培養基，增殖率為83.3%且長勢良好。姬璇等（2017）對比了純瓊脂、MS、1/2MS、MS + 2.0 mg·L-1 6-BA 四種不同的培養基對穿心蓮種子萌發的影響，綜合考慮其萌發率和成活率，認為適合穿心蓮種子萌發的培養基為MS或1/2 MS。閆斌（2016）對比研究了MS、1/2MS、MT、H、B5五種不同的基本培養基對穿心蓮無菌苗生長的影響，認為1/2MS更適合穿心蓮種子苗的生長。姬璇（2018）對比研究了MS、N6和Nistch培養基對花藥培養的影響，認為N6培養基是最適合作為穿心蓮花藥培養的基本培養基。

1.1.3 植物生長調節劑基本培養基只能維持培養物的生存與最低營養需求，在基本培養基中添加一定配比的植物生長調節劑可誘導細胞分裂的啟動和愈傷組織生長以及根、芽的分化等。不同種類和配比的植物生長調節劑對外植體脫分化和器官發生的作用不同。

細胞分裂素、生長素是常用于植物組織培養的生長調節劑，細胞分裂素在組織培養中的作用是促進細胞的分裂和生長，刺激細胞的分化和芽的建成，同時影響愈傷組織的分化和芽的形成（Loyola-Vargas & Ochoa-Alejo， 2018）；生長素的作用是促進細胞的生長和延展，與植物的維管束和根的形成有關（Kuluev et al.， 2015）。在穿心蓮愈傷組織誘導和叢生芽分化時，將細胞分裂素（6-BA、KT等）和生長素（NAA、IAA、IBA、2，4-D等）搭配組合作為添加劑使用效果較好（表1），如戴燚等（2018）研究認為，穿心蓮愈傷組織誘導的最佳激素配比為MS + 1.0 mg·L-1 6-BA+1.5 mg·L-1 NAA；陳榮珠（2017）研究發現，MS + 1.0 mg·L-1 6-BA + 0.1 mg·L-1 2，4-D對穿心蓮叢生芽誘導效果最佳，增殖系數達18.47（增殖系數=出芽數/原有芽數）。然而，在基本培養基上不添加生長素，僅添加一種或一種以上細胞分裂素也可以誘導穿心蓮分化出叢生芽，并實現高效增殖，如Dandin和Murthy（2012）研究發現，將穿心蓮帶腋芽的莖段接種在MS+0.2 mg·L-1 6-BA的培養基上，外植體的平均叢生芽再生數可達9.25個；進一步優化激素配比發現，在MS + 0.2 mg·L-1 6-BA + 1.0 mg·L-1 KT的培養基上平均每個外植體叢生芽再生數可達39.08個。也有研究表明，將穿心蓮無菌苗的莖段接種在添加2.0 mg·L-1 6-BA 的MS培養基上，平均每個外植體叢生芽再生數可達34.1個，但誘導出的叢生芽卻無法伸長生長；而將再生出的叢生芽轉接在含有0.35 mg·L-1 GA3的MS培養基上2周后，叢生芽的伸長率可達96%，伸長長度高達3.9 cm（Purkayastha et al.， 2008）。這可能與細胞分裂素6-BA具有促進芽增殖而抑制芽伸長的作用有關。硫酸腺嘌呤（adenine sulfate，ADS）為細胞分裂素合成的前體，可以增加細胞分裂素的生物合成（Khan et al.， 2014），其作為一種促進芽增殖和生長的植物生長調節劑已被廣泛應用（Rency et al.， 2018）。Bansi和Rout（2013）的研究表明，穿心蓮莖段和葉片在MS+3.0 mg·L-1 6-BA+50 mg·L-1 ADS+1.0 mg·L-1 NAA的培養基上培養6周有利于愈傷組織的發育，愈傷組織在同樣的培養基上繼代培養6周后，每個外植體的平均叢生芽數可達28.6個，葉源愈傷組織的芽再生率為75.3%，莖源愈傷組織的芽再生率為63.4%。在生根培養階段，普遍認為在MS或1/2MS培養基上分別單獨添加0.5 mg·L-1 IBA和0.5 mg·L-1 NAA組培苗生根效果較好（表1）。

1.1.4 培養條件在植物組織培養過程中，培養室的光照、濕度、溫度等培養條件均是誘導植物器官發生的重要因素，都會在一定程度上影響外植體的分化與生長。光照是植物組織培養中重要的培養條件之一。姬璇等（2017）研究表明，穿心蓮種子在有光照的條件下萌發率高于黑暗條件下，黑暗條件下萌發的穿心蓮幼苗呈黃白色，莖稈細弱，葉子黃白；光照條件下植株呈綠色，莖稈粗壯，葉子鮮綠。穿心蓮組培苗常用的培養溫度為（25 ± 2） ℃，光照強度為2 000～2 500 lx，光周期為12 h光/12 h暗或16 h光/8 h暗。

1.1.5 煉苗移栽將一直在恒溫、高濕、低光等特殊環境下生長的試管苗移栽到外界自然條件下，需要經過一個逐步鍛煉和適應的過程。Bansi和Rout（2013）研究表明，將生根的穿心蓮組培苗移植在泥土、沙子和干牛糞1∶1∶1（w/V）的混合基質中，經溫室進行馴化后成活率可達60%，移栽于大田均能正常生長。而Dandin和Murthy（2012）研究表明，首先將生根的穿心蓮組培苗移植到含有無菌土壤和蛭石1∶1（w/V）混合的花盆中，在溫度（25±2） ℃， 光周期16 h光/8 h暗，相對濕度80%和50 μmol·m-2·s-1的光強條件下煉苗2周；然后將其置于蔭蔽環境下，馴化生長2周；最后將其置于野外自然環境下生長，成活率可達95%。Purkayastha等（2008）研究認為，將穿心蓮組培苗移栽到土壤、蛭石和蚯蚓堆肥（1∶1∶1）混合的花盆中，2周后成活率可達92%，植株生長健壯。閆斌等（2016）研究表明，長有6片真葉的穿心蓮組培苗在河沙與蛭石1∶1混合的基質中生長狀況良好，存活率達86.7%。

1.2 組織離體再生體系的評價

目前，在藥用植物穿心蓮上已建立了從外植體組織到完整植株的組織離體再生技術體系。Dandin和Murthy（2012）早在2012年就以帶腋芽的莖段為外植體，建立了穿心蓮高效的離體再生技術體系，并利用隨機擴增多態性DNA標記（random amplified polymorphic DNA，RAPD）對再生苗的遺傳穩定性進行了分析，分析結果表明該體系的再生植株與母體相比未產生任何基因型變異，再生植株葉片和莖器官中穿心蓮內酯含量均高于母體。Purkayastha等（2008）、Dandin和Murthy（2012）、Bansi和Rout（2013）同樣以帶腋芽的莖段和葉片為外植體，建立了穿心蓮高效離體快繁技術體系，但均未對再生植株的遺傳穩定性及藥用成分含量進行評價。Kadapatti和Murthy（2021）以穿心蓮屬Andrographis alata的帶腋芽莖段為外植體，建立了其高效離體快繁技術體系，并利用隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）和簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記對再生苗的遺傳穩定性進行了分析，結果表明該體系的再生植株與母體相比未產生任何基因型變異；并且，同時采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）檢測了再生植株中新穿心蓮內酯的含量，結果表明再生植株的新穿心蓮內酯含量與母體植株相當。

1.3 育種應用

穿心蓮種質資源多樣性貧乏，新品種選育嚴重滯后（陳東亮等，2020）。基于植物組織培養技術的倍性育種可以為穿心蓮品質改良和種質創新提供新途徑。在穿心蓮多倍體誘導方面，閆斌等（2016）以穿心蓮剛萌發的成熟胚為誘導材料，采用秋水仙堿為誘導劑進行誘導處理，初步建立了穿心蓮同源四倍體的誘導與鑒定方法，并獲得了4株穿心蓮的同源四倍體無菌苗，認為0.075%的秋水仙堿誘導24 h效果最佳，其四倍體誘導率為3.3%，該研究為后續穿心蓮的多倍體培育和種質創新研究奠定了基礎。佘曉環等（2022）用0.05%的秋水仙素浸種48 h，穿心蓮種子誘導成活率達89%，整個誘導試驗獲得8株四倍體植株。在單倍體誘導方面，姬璇（2018）以穿心蓮花藥為外植體，建立了穿心蓮花藥離體培養技術體系，成功獲得了穿心蓮單倍體胚性愈傷組織，該研究開創了穿心蓮單倍體育種的先河，為純合二倍體的誘導奠定了基礎。

1.4 愈傷組織培養生產穿心蓮內酯

穿心蓮愈傷組織中穿心蓮內酯等活性成分含量極低。植物激素NAA、2，4-D、TDZ、6-BA及KT等單獨或以一定比例搭配使用均可誘導穿心蓮愈傷組織積累穿心蓮內酯（Vidyalakshmi & Ananthi， 2013；Jindal et al.， 2016）。Jindal等（2016）以穿心蓮葉片為外植體， 建立了穿心蓮愈傷組織培養體系，發現葉片外植體在MS+1.0 mg·L-1 2，4-D+1.0 mg·L-1 NAA培養基上愈傷組織的誘導率高達92%，穿心蓮內酯含量也高達8.34 mg·g-1（fresh cell weight，FCW）。穿心蓮內酯是通過胞質內甲羥戊酸（mevalonate，MAV）途徑和質體脫氧木糖磷酸（deoxy-xylulose phosphate，DXP）途徑協同作用產生的（Singh et al.， 2018; Sinna et al.， 2018; Das & Bandyopadhyay， 2021）。Das和Bandyopadhyay（2021）的研究發現，用MAV途徑阻斷劑洛伐他汀（lovastatin）處理穿心蓮愈傷組織后，MAV途徑被阻斷，穿心蓮內酯合成向質體DXP途徑轉移，質體DXP途徑被上調，導致穿心蓮內酯的含量顯著增加，同時愈傷組織變綠；而用DXP途徑阻斷劑膦胺霉素（fosmidomycin）處理愈傷組織后，DXP途徑被阻斷，穿心蓮內酯合成向質體MAV途徑轉移，但質體MAV途徑不能單獨補償產生穿心蓮內酯，導致穿心蓮內酯產生減少；進一步研究發現，硝酸銀（AgNO3）可誘導穿心蓮愈傷組織產生穿心蓮內酯，與硝酸銀和膦胺霉素聯用相比，聯用硝酸銀和洛伐他汀處理其愈傷組織后，穿心蓮內酯的產量更高，為3.41～3.76 mg·g-1（dry cell weight，DCW），這表明DXP途徑在穿心蓮內酯的生物合成中起主導作用。此外，Das和Bandyopadhyay（2021）的研究還發現，在光照、硝酸銀、生物合成途徑阻斷劑處理過程中，葉綠素含量和穿心蓮內酯含量之間呈正相關。因此，在未來的研究中，通過有目的性地增加組織的葉綠素含量可能成為提升穿心蓮內酯產量的又一策略。

2穿心蓮細胞懸浮培養

藥用植物細胞培養研究的主要內容是，在細胞培養過程中，通過篩選高產組織或細胞系、優化培養條件及選用高效誘導子等方法，降低成本，并提高其活性成分產量，或者通過對次生代謝產物生物合成途徑的調控來達到相同目的。

2.1 愈傷組織誘導

理想愈傷組織的獲得決定了植物細胞懸浮培養體系建立的快速性和高效性。細胞懸浮培養應選用疏松且易碎的愈傷組織。由于穿心蓮植株葉片積累的二萜內酯類活性成分較其他器官多（Mishra et al.， 2010），出于活性成分積累的目的，研究者大多選用其葉片作為外植體來誘導理想的愈傷組織。Gandi等（2012）以3周齡實生無菌苗植株為材料，對比分析了選用植株莖、葉、根作為外植體對愈傷組織誘導的影響，認為葉片外植體在MS+2.0 mg·L-1 2，4-D+0.4 mg·L-1 6-BA的培養基上誘導出的愈傷組織疏松易碎，繁殖率高，適宜用于細胞懸浮培養。Sharma和Jha（2012）以溫室生長的穿心蓮幼嫩葉片為外植體，在添加1.0 mg·L-1 NAA和1.0 mg·L-1 2，4-D的MS培養基上誘導出的愈傷組織量最大，呈乳白色，疏松易碎，適宜用于穿心蓮細胞懸浮培養。Dawande和Sahay（2020）以種子萌發10 d而來的無菌苗為材料，研究了不同外植體（子葉、初生葉、上胚軸和下胚軸）、培養基（B5、SH）及不同激素配比對愈傷組織誘導的影響，結果表明在含有2.0 mg·L-1 2，4-D和0.1 mg·L-1 6-BA的SH培養基上，子葉和下胚軸的愈傷組織誘導效果最佳。

2.2 細胞培養產生穿心蓮內酯

通過優化培養條件、使用誘導子誘導等方式可使穿心蓮細胞懸浮培養物中穿心蓮內酯的積累量大幅提高。Sharma 和 Jha（2012）的研究表明，在MS+1.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-1 2，4-D液體培養基上的細胞培養物中穿心蓮內酯含量高達32.4 mg·g-1（FCW），是愈傷組織母體中穿心蓮內酯含量的2.4倍，是葉片中穿心蓮內酯含量的1.3倍。植物細胞培養物在受到合適的誘導子脅迫誘導后次生代謝產物的積累量會得到進一步增強（Yue et al.， 2016），這些誘導子包括生物誘導子、非生物誘導子和信號分子等。Gandi等（2012）首次報道了穿心蓮細胞懸浮培養過程中誘導產生穿心蓮內酯的方法，發現生物誘導子（酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、根生農桿菌532和農桿菌c58）比非生物誘導子（CdCl2、AgNO3、CuCl2、HgCl2）能更有效地誘導穿心蓮懸浮培養物中穿心蓮內酯的積累，以酵母誘導為最佳，穿心蓮內酯積累量可達13.5 mg·g-1（DCW），比對照增加了8.82倍。此外，還有研究表明，用1.5 mL的黑曲霉處理培養物10 d后，由葉源愈傷組織而來的細胞懸浮培養物中穿心蓮內酯積累最大，達13.2 mg·g-1（DCW），比對照增加了6.94倍；用0.6%的擴展青霉處理培養物8 d后，細胞培養物中穿心蓮內酯積累達8.1 mg·g-1（DCW），比對照增加了6.23倍（Vakil & Mendhulkar， 2013a）；用7.0 mg·L-1水楊酸處理培養物24 h后，穿心蓮內酯含量達3.7 mg·g-1（DCW），為對照的18.5倍；用20 mg殼聚糖處理培養物48 h后，穿心蓮內酯含量高達11.9 mg·g-1（DCW），是對照的59.5倍（Vakil & Mendhulkar， 2013b）。Sharma等（2014）在細胞懸浮培養過程中，用1.0 mg·L-1茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MJA）誘導處理培養物24 h后穿心蓮內酯含量比對照增加了5.25倍。Dawande和Sahay（2020）研究認為，在含20 g·L-1蔗糖的1/2MS液體培養基上光照20 h·d-1，3周后愈傷組織中穿心蓮內酯含量高達4.60 mg·g-1（DCW），在該培養條件下，用硫酸銅、茉莉酸甲酯、幾丁質和真菌菌絲誘導的穿心蓮細胞培養物穿心蓮內酯產量均有顯著提高，其中以80 mg·L-1硫酸銅誘導的穿心蓮內酯產量為最高，達29.42 mg·g-1（DCW）。這表明優化培養條件和誘導子誘導方法聯用可以顯著提高穿心蓮內酯的總體產量。目前，多數研究認為水楊酸（salicylicacid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）這兩種信號分子在植物的適應性調控方面具有拮抗作用（Brooks et al.， 2005；Zheng et al.， 2012），也有研究表明二者存在協同作用（Mur et al.， 2006）。水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）單獨使用均可誘導愈傷組織中穿心蓮內酯含量的增加（Zaheer & Giri， 2015）。Ahmed和Praveen（2023）研究發現，SA和JA對穿心蓮細胞培養物中穿心蓮內酯含量的影響均隨其濃度的增加而增加，其中13.8 mg·L-1 SA誘導的穿心蓮內酯含量為0.083 mg·g-1（DCW），比對照增加了18%，以21.0 mg·L-1 JA處理的穿心蓮內酯含量可達0.211 mg·g-1（DCW），比對照增加了3倍；此外，以10.35 mg·L-1 SA和15.75 mg·L-1 JA同時誘導，穿心蓮內酯含量可達0.28 mg·g-1（DCW），比對照增加了3.8倍。由此可見，在穿心蓮細胞懸浮培養過程中，多個正向誘導子的聯合使用比單個正向誘導子單獨使用效果更好。

3穿心蓮不定根的培養

3.1 不定根培養積累穿心蓮內酯

不定根由植物器官受傷或激素、病原微生物等外界因素的刺激誘導產生，不按正常時序發生且出現在非正常的位置，通常在莖、葉和下胚軸位置產生。植物不定根培養通常可積累大量的次生代謝產物，這為藥用植物活性成分的獲得提供了一種新途徑（Paek et al.， 2005）。目前，大部分藥用植物已成功誘導出不定根，并對其進行了搖瓶或生物反應器培養（苗佳琪，2022）。在穿心蓮不定根誘導方面，Praveen等（2009）以穿心蓮葉片為外植體，在含1.0 mg·L-1 NAA和含0.3%蔗糖的MS培養基上誘導出了不定根，在含0.5 mg·L-1 NAA和含0.3%蔗糖的MS液體培養基培養4周后其生物量比對照高出7倍，穿心蓮內酯含量較對照高出3.5倍。Sharma等（2013）以葉片為外植體，在含1.0 mg·L-1 NAA的改良MS培養基上平均每個外植體誘導出的不定根數可達26.7個，不定根誘導率達83%，在相同成分的液體培養基上培養5周后，穿心蓮內酯含量達133.3 mg·g-1（DCW），比對照高3.5～5.5倍。Das和Bandyopadhyay（2015）在含有2.0 mg·L-1 NAA的MS培養基上以葉片和根為外植體直接誘導出不定根，在相同液體培養基上培養4周后其不定根中穿心蓮內酯含量最高，為1.06 mg·L-1（DCW）。

3.2 誘導子誘導積累穿心蓮內酯

誘導子誘導不但能使細胞培養物中穿心蓮內酯含量積累增加，而且可在不定根培養過程中誘使穿心蓮內酯含量大量積累。Zaheer和Giri（2017）首次報道了化學誘導子水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）在穿心蓮不定根培養過程中對穿心蓮內酯積累的影響，發現不同濃度的JA 均可誘導不定根中穿心蓮內酯的積累，其中以3.45 mg·L-1 JA誘導為最佳，培養1周后其不定根中穿心蓮內酯含量為對照的10.8倍；而用不同濃度SA及其衍生物誘導穿心蓮不定根1周后發現，僅15.2 mg·L-1水楊酸甲酯（methyl salicylic acid，MSA）可使不定根中穿心蓮內酯的含量比對照增加2.6倍，表明JA對穿心蓮不定根培養中穿心蓮內酯含量的影響明顯優于SA。此外，Srinath等（2022）的研究發現，乙烯（ethylene，ETH）誘導可顯著促進不定根培養物生物量增加4倍，穿心蓮內酯含量增加5倍；光照可使穿心蓮內酯含量增加4.29倍。由此可見，植物生長調節劑作為誘導子可誘導穿心蓮不定根中穿心蓮內酯含量增加，但目前已知的可誘導穿心蓮不定根中穿心蓮內酯積累的化學誘導子種類較少，還需進一步篩選挖掘。

4穿心蓮毛狀根的培養

毛狀根是發根農桿菌侵染植物后產生的一種病理狀態，具有生長快、易于大量培養、激素自養、次生代謝產物產量高、生理生化和遺傳性穩定等特點，有很大的工業化潛力。近年來，毛狀根培養技術作為藥用植物的次生代謝產物開發新途徑受到人們的重視，已經成為繼組織培養和細胞培養體系之后的又一培養體系。Marwani等（2015）研究表明，以子葉為外植體，用菌株ATCC 15834侵染2 d，其毛狀根誘導效果最佳，在添加1.0 mg·L-1 IBA的1/2 MS液體培養基培養第2周，穿心蓮內酯含量最高，達5.4 mg·g-1（DCW）。Mahobia和Jha（2015）以MTCC 532為發根菌株，研究了不同外植體（葉片和根尖分生組織）、不同侵染方式（浸漬和滴注）、不同培養基對穿心蓮毛狀根誘導的影響，認為在添加80.0 mg·L-1乙酰丁香酮和0.3%蔗糖的1/2MS培養基上，采用侵染法共培養3 d，其毛狀根誘導率最高，可達58.76%。

5存在問題與展望

5.1 存在的問題

雖然有關穿心蓮組織離體培養再生完整植株的報道已有很多（Purkayastha et al.， 2008；Dandin & Murthy， 2012；Bansi & Rout， 2013），但要進行大規模生產應用，其離體再生效率還需進一步提高，激素配比有待進一步優化。此外，對于藥用植物而言，再生植株的遺傳穩定性及藥效成分含量高低既是其離體再生技術體系的又一重要評價指標，也是該技術體系能否大規模進行生產應用的關鍵和前提（繆劍華等，2017）。然而，目前很少有將再生植株的遺傳穩定性及藥效成分含量高低作為再生體系的評價指標。本研究發現，在穿心蓮愈傷組織、細胞、不定根及毛狀根培養生產穿心蓮內酯相關報道中，通過優化培養條件和使用誘導子均可顯著提高培養物穿心蓮內酯含量，并且多個誘導子聯用及優化培養條件聯用還可進一步提高培養物穿心蓮內酯產量，但鮮有該方面的研究報道。

5.2 展望

雖然前人已在穿心蓮離體培養方面取得了一定的技術性突破，組織離體再生技術體系日漸成熟，愈傷組織培養、細胞懸浮培養、不定根及毛狀根培養技術體系日益完善，并通過優化培養條件、使用誘導子誘導等方法，使培養物的活性成分（如穿心蓮內酯）的積累量已有了較大提升，但相對還處于基礎研究階段，距規模化生產應用還存在較大差距（Murthy & Dalawai， 2021）。相對于大宗中藥材而言，在穿心蓮離體培養技術及其生產活性成分的基礎研究還缺乏系統性，基于植物器官、組織及細胞離體培養生產重要次生代謝產物的一些關鍵技術還有待攻克。其他大宗中藥材在植物離體培養及產生重要活性成分方面的研究思路，尤其是已得到規模化生產應用的相關技術的研究思路，對穿心蓮相關研究具有很高的借鑒價值。筆者認為，未來在穿心蓮離體培養技術及產生重要活性成分方面應重點關注以下3個方面。

5.2.1 熟化完善穿心蓮組織離體再生技術體系，建立全面系統的評價體系通過優化植物生長調節劑配比、種類組合及培養條件等途徑，熟化完善穿心蓮組織離體再生技術體系，提高組織培養效率。對其他藥用植物的研究表明，利用ISSR、EST-SSR、RAPD、AFLP等分子標記或2種以上分子標記聯用對藥用植物再生植株進行遺傳穩定性評價是可靠且可行的（Mamdouh et al.， 2021; Sharma et al.， 2022; Babanina et al.， 2023）。因此，未來應在使穿心蓮組織離體再生技術體系高效化的同時，綜合運用多種分子標記檢測手段，加強穿心蓮再生植株遺傳穩定性及其主要活性成分跟蹤研究，建立全面系統的穿心蓮組織離體再生技術評價體系。

5.2.2 優化培養條件和高效誘導子聯用，進一步提高穿心蓮內酯等重要活性成分產量目前，已在人參（Panax ginseng）（Huang et al.， 2013）、肉蓯蓉（Cistanche deserticola）（Cheng et al.， 2005）、貫葉連翹（Hypericum perforatum）（Conceiao et al.， 2006）、水飛薊（Silybum marianum）（Sánchez-Sampedro et al.， 2005）、金盞菊（Calendula officinalis）（Wiktorowska et al.， 2010）等諸多藥用植物上，通過誘導子誘導使其細胞群的次生代謝產物積累增強。穿心蓮內酯的生物合成途徑已逐漸明晰（Das & Bandyopadhyay， 2021；鐘楚等，2021），但針對其生物合成途徑有目的地調控穿心蓮內酯含量的相關研究較少。因此，未來在穿心蓮離體培養生產穿心蓮內酯方面，應針對其生物合成途徑進行有目的地優化培養條件和高效誘導子聯用研究，以進一步提高其穿心蓮內酯等重要活性成分含量，為該技術的規模化生產應用提供可靠且高效的技術支撐。

5.2.3 通過細胞懸浮培養技術，開展生產穿心蓮內酯的生物反應器培養研究生物反應器培養具有生產規模大、周年生產、不受季節及區域性影響、自動化程度高、生產成本低等特點，在藥用植物次生代謝產物規模化生產方面應用前景廣闊。目前，已在人參細胞懸浮培養（Thanh et al.， 2014）、不定根（Song et al.， 2017）及毛狀根培養（Kochan et al.， 2018）、西洋參毛狀根培養（Kochan et al.， 2017）、白芷不定根培養（Hwang et al.， 2022）等方面，建立了相應活性成分生產的生物反應器培養技術體系，人參皂苷等重要活性成分已通過生物反應器實現規模化生產（Thanh et al.， 2014；Luthra et al.， 2021）。相比之下，針對穿心蓮該方面的研究嚴重滯后。目前，通過細胞懸浮培養生產穿心蓮內酯的研究較為深入，技術也較為成熟。因此，未來在穿心蓮細胞懸浮培養生產穿心蓮內酯的生物反應器培養研究方面具有廣闊前景。

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（責任編輯蔣巧媛王登惠）