高效液相色譜法檢測食用油中黃曲霉毒素B1的含量

摘 要：目的：建立一種利用高效液相色譜技術檢測食用油內黃曲霉毒素B1含量的方法。方法：以甲醇-水體系對樣品進行萃取，通過黃曲霉毒素B1特異性免疫親和柱進行凈化處理，并以甲醇作為洗脫劑進行洗脫，使用高效液相色譜儀進行檢測分析。結果：黃曲霉毒素B1濃度在0.1～40.0 ng·mL-1線性關系良好，相關系數為0.999 6；方法的平均回收率在97.2%～100.3%，相對標準偏差在0.4%～0.9%；方法檢出限為0.029 μg·kg-1，定量限為0.098 μg·kg-1，均滿足檢測要求。結論：該方法快速高效、操作簡便，且試劑耗材消耗少，適用于檢測食用油中黃曲霉毒素B1的含量。

關鍵詞：高效液相色譜法；食用油；黃曲霉毒素B1；含量測定

Determination of Aflatoxin B1 in Edible Oil by High Performance Liquid Chromatography

CHEN Xuyin， LUO Lin， SHAN Hua， WANG Huadong*

（Guizhou Jintaili Grain and Oil Development Co.， Ltd.， Guiyang 550014， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the determination of aflatoxin B1 in edible oil by high performance liquid chromatography （HPLC）. Method： The samples were extracted by methanol-water system， purified by aflatoxin B1 specific immunoaffinity column， eluted with methanol as eluent， and analyzed by HPLC. Result： Aflatoxin B1 concentration has a good linear relationship in the range of 0.1 ng·mL-1 to 40.0 ng·mL-1， the correlation coefficient was 0.999 6; the average recoveries ranged from 97.2% to 100.3%， and the relative standard deviations ranged from 0.4% to 0.9%; the limits of detection and quantitation were 0.029 μg·kg-1 and 0.098 μg·kg-1， both of which met the detection requirements. Conclusion： The method is fast， efficient， easy to operate， with less consumption of reagents and consumables. It is suitable for the determination of aflatoxin B1 in edible oil.

Keywords： high performance liquid chromatography; edible oil; aflatoxin B1; content determination

黃曲霉毒素來源于黃曲霉和寄生曲霉，是一類嚴重危害人體健康的霉菌毒素[1]。其中，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）因其強致癌性和高毒性而備受關注[2]。AFB1廣泛存在于土壤、動植物以及各種堅果中，主要污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米、大米、棉籽、啤酒和醬油等，對食品安全構成了嚴重威脅[3-4]。高效液相色譜法因其高壓、高效、高速、高靈敏度及高選擇性等特點，在食品分析領域得到廣泛應用[5]。然而，現有利用高效液相色譜法檢測食用油中AFB1含量的方法仍存在一些不足，如部分方法的凈化步驟復雜、試劑消耗量大、操作流程復雜等。為克服這些不足，本文致力于建立一種更為優化的利用高效液相色譜法檢測食用油中AFB1含量的方法，從而保障食用油的質量安全。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器及試劑

菜籽油，市售。

1260 Infinity型高效液相色譜儀配PHRED-HR-光化學衍生器，美國安捷倫公司；AP-02B型真空泵，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；QF-3800氮吹儀，北京華盛譜信公司；SK-1旋渦混合器，金壇市中大儀器廠；免疫親和柱（黃曲霉毒素B1專用），天津博納艾杰爾科技有限公司。

碘，天津科密歐試劑有限公司；乙腈、甲醇、正己烷，北京迪馬科技有限公司；黃曲霉毒素B1標準品（濃度為100 μg·mL-1，批號為1162-65-8），壇墨質檢科技有限公司；黃曲霉毒素B1標準品（濃度為2 μg·mL-1，批號為SB05-195-2008），農業農村部環境保護科研監測所；實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

選用Thermo UMISil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）進行分離。流動相為甲醇與水混合溶液（50∶50，V/V）。熒光檢測條件設置為激發波長360 nm，發射波長440 nm。為確保分離效果，流動相流速設定為1.0 mL·min-1，并維持柱溫在35 ℃。此外，衍生化步驟采用質量分數為0.05%的碘溶液，流速設置為0.2 mL·min-1。

1.3 標準溶液的配制

準確吸取1.0 mL的黃曲霉毒素B1標準物質，將其轉移至100 mL容量瓶中，使用乙腈作為稀釋劑添加至刻度線，獲得濃度為1 μg·mL-1的標準儲備液，4 ℃保存。精準量取0.5 mL的上述儲備液，轉移至50 mL容量瓶中，再以流動相作為稀釋液添加至刻度線，得到濃度為10 ng·mL-1的中間液。通過精確量取一定量制備的標準儲備液以及中間液，配制具有不同濃度梯度的標準工作液，分別為0.1、0.5、2.0、5.0、10.0、20.0 ng·mL-1及40.0 ng·mL-1。

1.4 樣品的提取及凈化

稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，添加84∶16（V/V）乙腈和水混合液，通過渦旋方式使其混合均勻，然后超聲提取20 min，以6 000 r·min-1的轉速離心10 min，量取4 mL上清液，加入超純水12 mL，充分混勻。在固相萃取裝置上安裝免疫親和柱，并棄去其中的保護液，調壓使樣品液以2 mL·min-1過柱，用10 mL水淋洗兩次后，抽干親和柱。添入2 mL甲醇以2 mL·min-1洗脫，收集洗脫液，經0.22 μm濾膜過濾，得待測樣液。

2 結果與分析

2.1 確定液相色譜條件

測試不同比例甲醇-水流動相（30∶70、40∶60、45∶55、50∶50，V/V）對檢測效果的影響。當甲醇與水的比例為30∶70時，觀察目標峰的保留時間較長，且峰形較寬，可能是流動相的極性較強，導致目標化合物在色譜柱上的保留行為發生變化，同時也使得樣品中的一些雜質與目標峰的分離效果不理想，雜質干擾較為明顯，從而影響了對目標化合物的準確檢測。甲醇與水的比例為40∶60和45∶55時，目標峰的保留時間逐漸縮短，峰形有所改善，但仍未達到理想狀態。在這兩種比例下，雖然部分雜質與目標峰的分離程度有所提高，但仍存在一定程度的重疊，可能會對定量分析造成一定誤差。當甲醇與水的比例調整為50∶50時，目標峰呈現對稱形態，樣品中的雜質干擾較小，明顯提高了檢測的準確性和可靠性。因此，選擇流動相甲醇與水的比例為50∶50進行后續實驗。

2.2 線性關系分析

根據1.2項色譜條件，分析各濃度標準溶液。以黃曲霉毒素B1的濃度為橫坐標，以其對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，結果如圖1所示。線性回歸方程為Y=27 217.3X，R2=0.999 6，表明具有良好的線性關系。

2.3 回收率和精密度

選取9份陰性樣品各5 g，分別加入不同量黃曲霉毒素B1標準品，根據1.4項所述流程制備待測樣品溶液，并在1.2項中所述的色譜條件下進行測定，加標回收實驗結果如表1所示。結果表明，在高、中、低3個加標水平下，樣品的平均回收率分別為100.3%、98.4%和97.2%，相對標準偏差在0.4%～0.9%，滿足《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）的標準要求。

2.4 重復性驗證

為驗證方法的重復性，選取5 g陽性樣品，在相同條件下進行6次重復測定。經計算，相對標準偏差為0.6%，符合國家標準GB/T 27404—2008所設定的30%的允許偏差。具體數據見表2。

2.5 質控樣考察

稱取5 g質控樣品各3份，根據1.4項所述方法制備待測樣品溶液，并在1.2項色譜條件下進行分析測定，最終測得結果為1.62 μg·kg-1。樣品來源于大連中食國實檢測技術有限公司（編號為CFAPA-QC618B-1），參考值為1.55 μg·kg-1。采用Z檢驗方法，經計算得，Z值為0.5，符合|Z|≤2的接受標準。

2.6 檢出限與定量限

為評估檢出限，取6份5 g陰性樣品，各加0.15 ng黃曲霉毒素B1標準品，按1.4項制備樣品并依據1.2項對其進行測定，分別以3倍信噪比和10倍信噪比對應的濃度作為方法的檢出限和定量限。結果顯示，樣品的濃度為0.029 μg·kg-1，低于檢出限0.03 μg·kg-1，符合《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）。另取3份5 g陰性樣品，各加0.5 ng黃曲霉毒素B1標準品，按相同步驟制備并測定，黃曲霉毒素B1的含量為0.098 μg·kg-1，該值低于規定的定量限0.1 μg·kg-1，與GB 5009.22—2016的要求相符合。

3 結論

本研究對樣品凈化步驟進行改良，將常規使用的PBS溶液替換為超純水，省去氮吹這一原有步驟。經優化實驗條件后，用于檢測食用油中黃曲霉毒素B1。結果表明，目標峰呈現良好的形態，與雜峰之間可以實現清晰的分離，且干擾因素大大減少。該方法操作流程簡單、檢測速度快、試劑使用量少，為測定食用油中黃曲霉毒素B1的含量提供了更為高效的定性與定量分析方法。

參考文獻

[1]黃良江.高效液相色譜非衍生法檢測食用油中的黃曲霉毒素B1的含量[J].現代食品，2023，29（5）：220-223.

[2]葉雅真，駱和東，張淑瓊，等.食用油中黃曲霉毒素B1快速檢測試劑盒的質量評價[J].中國油脂，2022，47（2）：91-95.

[3]許妍妍，董宇.食用油中黃曲霉毒素B1含量的測定能力驗證[J].安徽農業科學，2020，48（22）：185-186.

[4]曹晶晶，劉瑩，王雅楠，等.全自動免疫磁珠法與免疫親和柱法測定食用油中黃曲霉毒素B1的對比研究[J].糧油食品科技，2023，31（3）：153-158.

[5]莫星憂，何善廉，呂柏東，等.食用植物油中黃曲霉毒素B1檢測質量控制方法研究[J].中國標準化，2024（13）：241-245.

作者簡介：陳旭銀（1985—），男，貴州遵義人，本科，助理工程師。研究方向：糧油檢驗。

通信作者：王化東（1977—），男，土家族，湖南張家界人，中專，助理工程師。研究方向：糧油檢驗。E-mail： 404516012qq@.com。