氣相色譜法測定草魚中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考與氟苯尼考胺殘留量

摘 要：目的：建立氣相色譜法測定草魚中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考與氟苯尼考胺等4種抗生素殘留量的方法。方法：在堿性條件下用乙酸乙酯提取抗生素殘留物，正己烷去脂，MCX固相萃取小柱凈化，再經硅烷化試劑衍生化后供氣相色譜檢測，峰面積外標法定量。結果：4種抗生素組分在各自濃度范圍內線性關系良好，方法檢出限為0.1～0.3 μg·kg-1、定量限為1.0～3.0 μg·kg-1，加標回收率為82.8%～107.5%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.05%～5.99%。結論：該方法靈敏度高、準確性好，適用于草魚中4種抗生素殘留量的分析檢測。

關鍵詞：氣相色譜法；草魚；氯霉素類藥物；抗生素

Determination of Chloramphenicol， Thiamphenicol， Florfenicol， and Florfenicol Amine Residues in Grass Carps by Gas Chromatography

ZHENG Weiling

（Shenzhen Academy of Metrology amp; Quality Inspection， Shenzhen 518000， China）

Abstract： Objective： To establish a gas chromatography method for determining the residues of four antibiotics， including chloramphenicol， thiamphenicol， florfenicol， and florfenicol amine， in grass carp. Method： Antibiotic residues were extracted with ethyl acetate under alkaline conditions， defatted with n-hexane， purified with MCX solid-phase extraction column， derivatized with silanization reagent， and detected by gas chromatography. The peak area was quantified by external standard method. Result： The four antibiotic components showed good linear relationships within their respective concentration ranges. The detection limit of the method was 0.1～0.3 μg·kg-1， the quantification limit was 1.0～3.0 μg·kg-1， the recovery rate was 82.8%～107.5%， and the relative standard deviation （RSD） was 1.05%～5.99%. Conclusion： This method has high sensitivity and good accuracy， and is suitable for the analysis and detection of four antibiotic residues in grass carp.

Keywords： gas chromatography; grass carp; chloramphenicol drugs; antibiotic

氯霉素類藥物主要包括氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）、氟苯尼考（Florfenicol，FF），屬于廣譜性抗生素，可用于防治牲畜、家禽及水產動物等細菌性疾病[1]。目前，我國已禁止畜禽水產養殖業將CAP用于可食用動物，TAP、FF則是限量使用。氟苯尼考胺（Florfenicol Amine，FFA）是FF在動物體內的主要代謝物之一，可作為其殘留標示物[2]。近年來，在我國部分地區的水產養殖過程中仍存在違規或超限量使用CAP、TAP、FF等現象。因此，加強水產品中氯霉素類藥物殘留的監控檢測顯得至關重要[3]。本研究參照《食品安全國家標準 水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的測定 氣相色譜法》（GB 31656.16—2022）[4]，建立了氣相色譜測定草魚中CAP、TAP、FF與FFA殘留量的分析方法，旨在為水產品中氯霉素類藥物殘留監測提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚，購自某水產市場；乙腈中4種抗生素混合標準品（編號82113），包含氯霉素（Chloramphenicol，CAP）、甲砜霉素（Thiamphenicol，TAP）、氟苯尼考（Florfenicol，FF）和氟苯尼考胺（Florfenicol Amine，FFA），壇墨質檢科技股份有限公司；乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯和甲苯，均為色譜純，德國默克公司；N，O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）、三甲基氯硅烷（TMCS），均為分析純，上海麥克林化學試劑有限公司；MCX固相萃取柱（60 mg/3 mL），山東邦凱新材料有限公司。

1.2 儀器與設備

TRACE 1310氣相色譜儀（配備ECD檢測器），美國賽默飛世爾公司；GL2202-1SCN分析天平（精度0.01 g），德國賽多利斯公司；HSC-B水浴氮吹儀，天津市恒奧科技發展有限公司；ASE-12固相萃取裝置，天津奧特賽恩斯儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

準確吸取1.0 mL乙腈中4種抗生素混標溶液（CAP濃度為15 μg·mL-1，TAP、FF、FFA濃度均為150 μg·mL-1）于5 mL容量瓶中，用乙腈稀釋、定容至刻度，配制成CAP濃度為3 μg·mL-1，TAP、FF、FFA濃度均為30 μg·mL-1的4種抗生素混合標準中間溶液。

分別吸取3.5、5.0、16.5、50.0、165.0 μL和500.0 μL"4種抗生素混合標準中間溶液于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋、定容至刻度，配制成CAP濃度為1.05、1.50、4.95、15.00、50.00 μg·L-1和150.00 μg·L-1，TAP、FF、FFA濃度為10.5、15.0、49.5、150.0、500.0 μg·L-1和1 500.0 μg·L-1的4種抗生素混合系列標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

（1）樣品提取凈化。稱取5 g（精確至0.01 g）經均質后的草魚試樣于50 mL玻璃離心管中，加入20 mL乙酸乙酯-氨水（體積比，98+2），置于旋渦混合器上渦旋1 min，再置于超聲清洗器中超聲提取15 min后，4 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液轉移入100 mL雞心瓶中，將離心管中的殘渣重復提取1次，合并兩次提取離心后的上清液于雞心瓶中，加入3 mL 5%乙酸溶液，渦旋混勻，置于水溫40 ℃的旋轉蒸發儀上旋蒸至約1.5 mL，待凈化。

將待凈化液移至10 mL離心管中，取1.5 mL 5%乙酸溶液洗滌雞心瓶，洗滌液并入離心管中，加入5 mL正己烷，置于旋渦混合器上渦旋1 min，然后4 000 r·min-1離心5 min，吸取水層，再加入5 mL正己烷重復脫脂1次，吸取水層，備用。

將MCX固相萃取小柱安裝在固相萃取裝置上，先后用3 mL甲醇、3 mL超純水活化小柱，將脫脂后的備用液加入小柱中過柱，用2 mL 5%乙酸溶液淋洗，棄去淋洗液，用6 mL甲醇-氨水（體積比，98+2）洗脫，收集洗脫液于10 mL比色管中，置于水溫65 ℃的氮吹儀上，緩緩通入氮氣，蒸發至近干，再依次用1 mL甲醇、1 mL乙酸乙酯洗滌比色管壁，置于水溫65 ℃的氮吹儀上通入氮氣吹至近干，備用。

（2）試料與標液衍生化。①試料衍生化。向盛有備用試料的比色管中加入100 μL乙腈復溶，轉移至2 mL棕色反應瓶中，再用100 μL乙腈清洗比色管并將清洗液移入棕色反應瓶，加入100 μL衍生化試劑，含BSTFA-TMCS（體積比，99+1），蓋緊旋塞使用旋渦混合器渦旋10 s，然后置于40 ℃的烘箱中反應30 min。取出冷卻至室溫后，置于水溫55 ℃的氮吹儀上通入氮氣吹干，準確加入1.0 mL甲苯后渦旋混勻，待測。②標液衍生化。分別吸取1.0 mL 4種抗生素混合系列標準溶液至2 mL棕色反應瓶中，置于水溫55 ℃的氮吹儀上通入氮氣吹干，按照上述試料衍生化過程操作。

1.3.3 氣相色譜條件

色譜柱：TG-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣：高純氮，流速1.0 mL·min-1；進樣方式：不分流進樣；進樣口溫度：230 ℃；柱溫程序：80 ℃保持1 min，以30 ℃·min-1升至280 ℃，保持12 min；ECD檢測器溫度：300 ℃；尾吹流量：25 mL·min-1。

2 結果與分析

2.1 線性關系與相關系數

以經衍生后的4種抗生素混合系列標準溶液的質量濃度（X）為橫坐標，以各抗生素組分的峰面積（Y）為縱坐標，擬合標準工作曲線，獲得標準曲線方程和相關系數r。由表1可知，4種抗生素組分在各自濃度范圍內線性關系良好，相關系數r均大于0.999，符合《食品安全國家標準 化學分析方法驗證通則》（GB 5009.295—2023）[5]規定。

2.2 檢出限與定量限

稱取5 g（精確至0.01 g）陰性草魚試樣，添加4種抗生素組分的混合標準溶液（CAP濃度為1.05 μg·L-1，TAP、FF、FFA濃度為10.5 μg·L-1），按1.3.2方法對試樣進行處理，并采用1.3.3儀器條件進行測定。將4種抗生素組分色譜峰信噪比S/N≥3對應濃度作為方法檢出限；信噪比S/N≥10對應濃度作為方法定量限，測得CAP方法檢出限為0.1 μg·kg-1，TAP、FF、FFA方法檢出限為0.3 μg·kg-1；CAP方法定量限為1.0 μg·kg-1，TAP、FF、FFA的方法定量限為3.0 μg·kg-1，均滿足GB 31656.16—2022中靈敏度的要求。

2.3 準確度與精密度

稱取18份5 g（精確至0.01 g）的陰性草魚試樣，每6份分為1組，分別添加5、165、500 μL的4種抗生素混合標準溶液（CAP濃度0.3 μg·mL-1，TAP、FF、FFA濃度均為3.0 μg·mL-1），制備成低濃度（CAP濃度為0.3 μg·kg-1，TAP、FF、FFA濃度為3.0 μg·kg-1）、中濃度（CAP濃度為9.9 μg·kg-1，TAP、FF、FFA濃度為99.0 μg·kg-1）、高濃度（CAP濃度為30.0 μg·kg-1，TAP、FF、FFA濃度為300.0 μg·kg-1）3個水平加標試樣，按照1.3.2和1.3.3方法進行試樣處理和測定。每個水平重復6次。由表2可知，4種抗生素組分的加標回收率為82.8%～107.5%，相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為1.05%～5.99%，滿足GB 31656.16—2022中準確度與精密度的要求。

3 結論

本研究建立了一種氣相色譜法測定草魚中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考與氟苯尼考胺殘留量的方法。結果表明，4種抗生素組分在各自濃度范圍內線性關系良好，方法的靈敏度、準確度與精密度均符合GB 31656.16—2022中的相關要求，可以滿足檢驗檢測機構對草魚等水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考與氟苯尼考胺等4種抗生素殘留量的檢測需求。

參考文獻

[1]楊秋紅，艾曉輝，李榮，等.固相萃取-氣相色譜法同時檢測水產品中的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺[J].分析試驗室，2015，34（5）：533-537.

[2]鄭陸紅，張慧瓊，陳茹，等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定動物組織中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和其代謝產物氟苯尼考胺殘留量[J].現代食品，2022，28（20）：198-203.

[3]田衛政.液相質譜聯用法測定淡水魚及雞蛋中氯霉素類化合物殘留[J].食品工業，2024，45（9）：316-320.

[4]中華人民共和國農業農村部，中華人民共和國國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 水產品中氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留量的測定 氣相色譜法：GB 31656.16—2022[S].北京：中國標準出版社，2022.

[5]中華人民共和國國家衛生健康委員會，國家市場監督管理總局.食品安全國家標準 化學分析方法驗證通則：GB 5009.295—2023[S].北京：中國標準出版社，2023.

作者簡介：鄭煒玲（1995—），女，廣東惠州人，本科，助理工程師。研究方向：食品檢測、質量安全相關。