高效液相色譜法測定醬油中苯甲酸含量的測量不確定度評定

摘 要：本文采用高效液相色譜法檢測醬油中苯甲酸含量并進行測量不確定度評定。結果表明，在95%置信水平下，當醬油中苯甲酸含量為0.385 g·kg-1時，擴展測量不確定度為0.022 0 g·kg-1（k=2）。醬油中苯甲酸含量測量不確定度的主要貢獻為分析儀器、工作曲線的擬合、苯甲酸標準溶液和苯甲酸標準系列溶液配制。

關鍵詞：高效液相色譜法；醬油；苯甲酸；不確定度

Uncertainty Evaluation for Determining Benzoic Acid in Sauce by High Performance Liquid Chromatography

YAN Kaiqin， TAN Rongwei， ZENG Xiaoping， XIANG Junyi， ZHENG Xuezhi， TAN Zhilei

（Qingyuan Food Inspection Center， Qingyuan 511500， China）

Abstract： This article uses high-performance liquid chromatography to detect the content of benzoic acid in soy sauce and evaluate the measurement uncertainty. The results showed that at a 95% confidence level， when the benzoic acid content in soy sauce was 0.385 g·kg-1， the extended measurement uncertainty was 0.022 0 g·kg-1 （k=2）. The main contributions to the measurement uncertainty of benzoic acid content in soy sauce are analytical instruments， fitting of working curves， benzoic acid standard solutions， and preparation of benzoic acid standard series solutions.

Keywords： high performance liquid chromatography; sauce; benzoic acid; uncertainty

苯甲酸及其鈉鹽具有抑制霉菌、酵母和細菌的作用，可預防食品腐敗變質。常以苯甲酸鈉的形式廣泛用于醬油、醬腌菜、蜜餞和飲料等食品中。研究表明，正常劑量的苯甲酸不會對人體健康造成影響，但是長期且過量攝入苯甲酸含量超標的食品可能會對人體肝臟和腎臟以及胃產生危害[1]。《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》（GB 2760—2014）[2]明確規定了醬油中苯甲酸的最大使用量，但一些不法企業為了在生產經營中牟取利益，超限量使用苯甲酸。因此，準確測量醬油中苯甲酸的含量至關重要。本實驗參照《食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》（GB 5009.28—2016）[3]對醬油中的苯甲酸進行檢測，根據《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[4]和《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[5]分析評定液相色譜法測定醬油中苯甲酸含量的不確定度，以期提升醬油中苯甲酸含量測定的檢測方法和結果的準確度和可信度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

醬油樣品，由政府抽檢提供；苯甲酸標準溶液（1 000 μg·mL-1），中國計量科學研究院；亞鐵氰化鉀（分析純）、乙酸鋅（分析純）、甲醇（色譜純）和乙酸銨（分析純）。

高效液相色譜儀（LC-20A，配有PDA檢測器）、電子天平（HR-250AZ）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制

精密吸取苯甲酸標準溶液（1 000 μg·mL-1）10 mL于50 mL容量瓶（A級）中，用水定容，得到苯甲酸標準中間液（200 μg·mL-1）。分別精密吸取苯甲酸中間液0.05、0.15、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00 mL和5.00 mL于10 mL容量瓶，用水定容，配制成質量濃度分別為1、3、5、10、20、30、40、50、60、80 μg·mL-1和100 μg·mL-1的標準系列工作溶液，臨用現配。

1.2.2 樣品前處理

精密稱量約2 g醬油樣品，放入50 mL離心管中，加入約25 mL一級水，振蕩混勻，在50 ℃水浴下，超聲提取20 min，自然冷卻到室溫狀態后，加入2 mL亞鐵氰化鉀水溶液和2 mL乙酸鋅水溶液，搖勻后，以8 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉入50 mL容量瓶中，繼續向殘渣中加入約20 mL一級水重復提取1次，將上清液轉入上述50 mL容量瓶中，用一級水定容，搖勻。取部分上清液經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.2.3 儀器條件

色譜柱：Syncronis C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相組分：甲醇∶0.02 mol·L-1醋酸銨水溶液（5∶95，V/V）；流動相流速：1 mL·min-1；波長：230 nm；進樣量：10 μL。

1.3 建立測量模型

建立醬油中苯甲酸含量測定的測量模型，計算公式為

（1）

式中：X為試樣中待測物含量，g·kg-1；C為試樣中待測物濃度，μg·mL-1；V為試樣定容體積，mL；m為稱樣量，g；1 000為換算系數。

2 結果與分析

2.1 不確定度來源分析

本方法測量不確定度來源主要有以下7個方面：試樣稱量ur（m）；試樣定容ur（V1）；苯甲酸標準溶液ur（B）；苯甲酸標準曲線系列溶液配制ur（Vs）；工作曲線的擬合ur（C）；分析儀器ur（A）；重復性測定試樣ur（P）。其中試樣定容和制備苯甲酸標準曲線系列溶液的測量不確定度主要由兩個方面組成：量具體積校正；操作溫度與量具體積校正溫度的溫差。

2.2 試樣稱量引入的相對標準測量不確定度

天平稱量樣品的平均質量為2.035 6 g，由電子天平校準證書得到擴展測量不確定度為0.2 mg，包含因子為k=2，因此試樣稱量引入的相對標準測量不確定度為

2.3 試樣定容引入的相對標準測量不確定度

本實驗上清液定容使用的量具為50 mL的容量瓶（A級）。依據《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）[6]，50 mL的A級容量瓶20 ℃時，容量允差為±0.05 mL，按三角分布，計算該量具體積校正產生的標準測量不確定度為

操作溫度與量具體積校正溫度溫差為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，按均勻分布，計算溫差產生的標準測量不確定度為

綜合以上，得到試樣定容產生的相對標準測量不確定度為

2.4 苯甲酸標準溶液引入的相對標準測量不確定度

由標準物質證書得到苯甲酸標準溶液的相對擴展測量不確定度為1%（包含因子k=2），則苯甲酸標準溶液產生的相對標準測量不確定度為

2.5 苯甲酸標準系列溶液配制引入的相對標準測量不確定度

在苯甲酸標準系列溶液的配制過程中，用10 mL A級移液管移取苯甲酸標準溶液，用50 mL A級容量瓶對標準溶液稀釋定容得到200 μg·mL-1苯甲酸中間液；用1、5 mL A級分度移液管分別移取苯甲酸中間液獲得不同濃度的苯甲酸標準系列溶液，用10 mL A級容量瓶對系列溶液定容。

（1）10 mL移液管產生的相對標準測量不確定度。移取苯甲酸標準溶液的量具為10 mL分度移液管（A級），查得容量允差為±0.05 mL，按三角分布計算該量具體積校正產生的標準測量不確定度為

操作溫度與量具體積校正溫度溫差為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，按均勻分布計算溫差產生的標準測量不確定度為

綜合以上，得到10 mL移液管產生的相對標準測量不確定度為

（2）50 mL容量瓶產生的相對標準測量不確定度。稀釋定容使用的量具為50 mL容量瓶（A級），查得容量允差為±0.05 mL，按三角分布計算該量具體積校正產生的標準測量不確定度為

操作溫度與量具體積校正溫度溫差為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，按均勻分布計算溫差產生的標準測量不確定度為

綜合以上，得到50 mL容量瓶產生的相對標準測量不確定度為

（3）1 mL移液管產生的相對標準測量不確定度。移取苯甲酸中間液的量具為1 mL分度移液管（A級），查得容量允差為±0.008 mL，按三角分布計算該量具體積校正產生的標準測量不確定度為

操作溫度與量具體積校正溫度溫差為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，按均勻分布計算溫差產生的標準測量不確定度為

綜合以上，得到1 mL移液管產生的相對標準測量不確定度為

（4）5 mL移液管產生的相對標準測量不確定度。移取苯甲酸中間液的量具為5 mL分度移液管（A級），查得容量允許差為±0.025 mL，按三角分布計算該量具體積校正產生的標準測量不確定度為

操作溫度與量具體積校正溫度溫差為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，按均勻分布計算溫差產生的標準測量不確定度為

綜合以上，得到5 mL移液管產生的相對標準測量不確定度為

（5）10 mL容量瓶產生的相對標準測量不確定度。稀釋定容使用的量具為10 mL容量瓶（A級），查得容量允差為±0.020 mL，按三角分布計算該量具體積校正產生的標準測量不確定度為

操作溫度與量具體積校正溫度溫差為±5 ℃，水的膨脹系數為2.1×10-4 ℃-1，按均勻分布計算溫差產生的標準測量不確定度為

綜合以上，得到10 mL容量瓶產生的相對標準測量不確定為

則將上述5項合成得到制備苯甲酸標準曲線系列溶液產生的相對標準測量不確定度為

2.6 工作曲線擬合引入的相對標準測量不確定度

用高效液相色譜儀測定采用1.2.1方法配制的標準系列工作溶液的峰面積，每個濃度重復測定3次，得到相應的平均峰面積，結果見表1。用最小二乘法擬合可得校準曲線為A=bC+a，斜率b=31 364.3，截距a=-21 832.8，r2=0.999。

對醬油樣品連續測定7次，經標準曲線校準得到苯甲酸平均質量濃度C0=15.7 μg·mL-1工作曲線擬合產生的標準測量不確定度計算公式為

（2）

（3）

式中：n為苯甲酸標準溶液總測定次數（n=11×3=33）；p為樣品溶液測定次數（p=7）；Ci為苯甲酸各標準溶液的濃度，μg·mL-1；為標準溶液苯甲酸濃度的平均值，36.3 μg·mL-1；Ai為標準溶液的平均峰面積。

經計算得標準溶液峰面積殘余標準偏差S=17 807.8，u（C）=0.245 μg·mL-1，則工作曲線擬合產生的相對標準測量不確定度為

2.7 分析儀器引入的相對標準測量不確定度

由高效液相色譜儀檢定證書可獲得其相對擴展不確定度為4.6%，置信因子k=2，則高效液相色譜儀產生的相對標準測量不確定度為

2.8 重復性測定試樣引入的相對標準測量不確定度

按照1.2.2步驟對醬油樣品重復測定7次，測定值分別為0.387、0.382、0.385、0.387、0.385、0.387 g·kg-1和0.383 g·kg-1，測量平均值為0.385 g·kg-1。通常服從A類不確定度評定重復性測定產生的不確定度，則試樣重復測定產生的相對標準測量不確定度為

2.9 合成標準測量不確定度及擴展測量不確定度

醬油中苯甲酸含量的合成相對標準測量不確定度為

則合成標準測量不確定度為

取95%置信水平，包含因子k=2，則醬油中苯甲酸含量的擴展測量不確定度為

則醬油樣品中苯甲酸含量的檢測結果為（0.385±0.022 0）g·kg-1，k=2。

3 結論

本文采用高效液相色譜法檢測醬油中苯甲酸含量，分析醬油中苯甲酸含量測量不確定度的貢獻。結果表明，該方法測量不確定度主要貢獻為分析儀器、工作曲線擬合、苯甲酸標準溶液和制備苯甲酸標準系列溶液。因此，在工作中檢驗人員應重視儀器的維護和保養，保證儀器的穩定性和可靠性；優先選用檢定合格、精度高的量具制備工作曲線；適當增加標準系列溶液的測定次數，以減少工作曲線擬合產生的不確定度；同時加強自身的操作熟練度和規范性，減少人為因素對不確定度的影響，提高實驗結果準確度。

參考文獻

[1]鄒志飛.食品添加劑的毒性研究概覽[C]//第四屆第二次中國毒理學會食品毒理學專業委會與營養食品所毒理室聯合召開學術會議論文集.北京：中國毒理學會食品毒理學專業委員會，2008：81-102.

[2]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.食品安全國家標準 食品添加劑使用標準：GB 2760—2014[S].北京：中國標準出版社，2014.

[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會，國家食品藥品監督管理總局.食品安全國家標準 食品中苯甲酸、山梨酸和苯甲酸的測定：GB 5009.28—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[4]中國合格評定國家認可委員會.化學分析中不確定度的評估指南：CNAS—CL06：2019[S].北京：中國計量出版社，2019.

[5]國家質量監督檢驗檢疫總局.測量不確定度評定與表示：JF 1059.1—2012[S].北京：中國質檢出版社，2012.

[6]國家質量監督檢驗檢疫總局.常用玻璃量器：JJG 196—2006[S].北京：中國計量出版社，2006.

作者簡介：嚴開芹（1991—），女，湖北潛江人，碩士，工程師。研究方向：食品質量與安全。