IDH1-R132H突變體通過調節HIF-1α通路抑制膠質瘤U87細胞惡性進展

【摘要】 目的 探究異檸檬酸脫氫酶1（IDH1）-R132H突變體通過調節低氧誘導因子-1α（HIF-1α）通路抑制膠質瘤U87細胞惡性進展。方法 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）和蛋白免疫印跡法檢測膠質瘤組織和細胞IDH1 mRNA和蛋白表達水平。將U87細胞分為對照組、Vector組、IDH1 wt組、IDH1-R132H組，qRT-PCR和Western Blot檢測IDH1 wt、IDH1-R132H轉染效率，噻唑藍（MTT）和克隆形成實驗檢測細胞增殖，Transwell檢測細胞遷移，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western Blot檢測IDH1、PCNA、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、Bcl-2相關X蛋白（Bax）、B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、血管內皮生長因子（VEGF）、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達。結果 與癌旁組織和正常膠質細胞NHAs相比，膠質瘤組織和人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87中IDH1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。qRT-PCR和Western Blot結果表明，IDH1 wt、IDH1-R132H 轉染成功；與對照組或Vector組比較，IDH1-R132H組細胞活性、PCNA、MMP-2、Bcl-2蛋白表達明顯降低，VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達明顯升高，且 IDH1-R132H 組克隆細胞數和遷移細胞數減少，細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯增加（P＜0.05）；但對照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結論 IDH1-R132H突變體可能通過調節HIF-1α通路抑制膠質瘤U87細胞增殖和遷移，并誘導細胞凋亡。

【關鍵詞】 IDH1-R132H突變體；HIF-1α通路；膠質瘤；細胞增殖；細胞遷移；細胞凋亡

【中圖分類號】 R739.41" 【文獻標志碼】 A" 【文章編號】 1672-7770（2024）06-0654-06

The IDH1-R132H mutant inhibits malignant progression of glioma U87 cells by regulating the HIF-1α pathway FANG Song， TANG Guoqiang， YE Youzhong， LI Mingsong， CHEN Jiabei.Department of Neurosurgery， Chenzhou First Peoples Hospital， Chenzhou 423000， China

Corresponding Author： CHEN Jiabei

Abstract：" Objective To investigate the inhibition of malignant progression of glioma U87 cells by the regulation of hypoxic-induced-factor-1α（HIF-1α） pathway by mutant isocitrate dehydrogenase 1 R132H（IDH1-R132H）. Methods Real-time quantitative fluorescent polymerase chain reaction（qRT-PCR） and Western Blot were used to detect IDH1 mRNA and protein expression levels in glioma tissues and cells. U87 cells were divided into control group， Vector group， IDH1-wt group and IDH1-R132H group. The transfection efficiency of IDH1-wt and IDH1-R132H were detected by qRT-PCR and Western Blot， and cell proliferation was detected by MTT and clonal formation experiments. Cell migration was detected by Transwell， apoptosis was detected by flow cytometry， Western Blot analysis of IDH1， PCNA， matrix metalloproteinase-2（MMP-2）， Bcl-2 associated X protein（Bax）， B-cell lymphoma/leukemia-2（Bcl-2）， vascular endothelial growth factor（VEGF）， HIF-1α， HIF-2α protein expression. Results The expression levels of IDH1 mRNA and protein in glioma tissues and human glioblastoma cells T98G， U138， U87 were significantly lower than those in para-cancerous tissues and normal glioblastoma cells（Plt;0.05）. qRT-PCR and Western Blot proved successful transfection of IDH1-wt and IDH1-R132H. Compared with control group or Vector group， IDH1-R132H group significantly decreased cell activity， PCNA，"MMP-2 and Bcl-2 protein expression， significantly increased VEGF， HIF-1α and HIF-2α protein expression， decreased the number of cloned cells and migrated cells， and significantly increased apoptosis rate and Bax protein expression， and the number of cloned cells and migrated cells in IDH1-R132H group were decreased， while the apoptosis rate and Bax protein expression were significantly increased（Plt;0.05）. However， pairwise comparison of the above indicators in control group， Vector group and IDH1-wt group showed no statistical significance（Pgt;0.05）. Conclusions The IDH1-R132H mutant may inhibit the proliferation and migration of glioma U87 cells and induce apoptosis by regulating the HIF-1α pathway.

Key words： IDH1-R132H mutant; HIF-1α pathway; glioma; cell proliferation; cell migration; apoptosis

膠質瘤是神經外科常見顱內腫瘤，始于神經膠質細胞，占原發腦腫瘤60%以上，可嚴重影響患者神經系統癥狀，多數患者術后易復發，膠質母細胞瘤5年生存率未超過10%^［1］。近幾年雖然膠質瘤綜合治療已獲得重大突破，但治療效果不甚理想。2008年，有研究通過高通量測序首次發現，膠質瘤中存在異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）基因點突變，多項研究顯示，約80%～90%世界衛生組織Ⅱ/Ⅲ級膠質瘤患者、繼發膠質瘤患者存在IDH1/2基因突變，這一項新發現為膠質瘤診療帶來新的希望^［24］。研究證實，IDH1基因突變在膠質瘤中常見突變類型為在第132位的精氨酸（R）轉換為組氨酸（H），約占90%以上，IDH1基因突變有望成為膠質瘤輔助診斷和預后評估潛在生物標記物^［5］。基礎研究發現，IDH1-R132H突變可抑制膠質瘤細胞增殖和遷移^［6］。缺氧是腫瘤常見特征，缺氧環境下可激活腫瘤轉移和侵襲，引起低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）表達上調，HIF-1α是缺氧應答過程中重要轉錄因子，在哺乳動物體內高表達，可介導參與腫瘤進展，是腫瘤治療的潛在作用靶點^［7］。關于IDH1-R132H突變體通過調控HIF-1α通路對膠質瘤細胞惡性進展的研究較少見，本研究主要探討IDH1-R132H突變體通過調節HIF-1α通路對膠質瘤細胞增殖、凋亡和遷移等影響。

1 資料與方法

1.1 主要細胞與試劑 人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87和正常膠質細胞NHAs購于美國ATCC公司；胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、RPMI-1640培養基、逆轉錄試劑盒、SYBR Premix試劑盒購于美國賽默飛世爾科技公司；Lipofectamine 3000試劑盒、TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen；質粒及引物購于上海吉瑪公司；MTT試劑盒、凋亡試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell購于美國Corning公司；IDH1抗體、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體、基質金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase 2，MMP-2）抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、HIF-1α抗體、HIF-2α抗體購于英國Abcam公司。

1.2 樣本收集 選取2020年3月—2021年3月于郴州市第一人民醫院神經外科收治的36例膠質瘤患者，術中收集患者膠質瘤組織、癌旁組織（距腫瘤邊緣≥3 cm），其中男26例，女10例；年齡35～65歲，平均（52.27±8.11）歲；部位額葉22例，顳葉9例，其他5例；腫瘤直徑lt;3 cm 19例，≥3 cm 17例；ⅠⅡ級21例，ⅢⅣ級15例。納入標準：（1）均符合膠質瘤診斷標準^［8］，經病理組織學專家確診；（2）均為首次確診，入組前未接受放化療等治療。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤；（2）預計生存期＜6個月；（3）免疫缺陷疾病；（4）其他中樞神經系統疾病；（5）傳染性疾病；（6）既往存在顱內手術史或家族腦病史。

1.3 培養細胞與分組 正常膠質細胞NHAs、人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87常規復蘇后，細胞置于10% FBS、100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM培養基內，37 ℃、5%CO2飽和濕度下培養細胞，細胞生長鋪至90%～95%時，棄舊培養基，加胰酶消化傳代培養。

取對數生長期U87細胞，1×104個/孔鋪至6孔板，培養24 h保證細胞生長至80%，用Lipo 3000試劑轉染空載體Vector、過表達IDH1 wt質粒、過表達IDH1-R132H質粒，記為Vector組、IDH1 wt組、IDH1-R132H組，將未經任何處理的U87細胞作為對照組。

1.4 qRT-PCR檢測IDH1 mRNA表達 取膠質瘤組織、癌旁組織、正常膠質細胞NHAs、人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87及培養24 h的各組U87細胞，Trizol法抽提總RNA后，使用紫外分光光度計測定RNA濃度，保證A260/A280值處于1.8～2.0之間。反轉錄試劑盒合成cDNA，配置PCR擴增反應體系進行擴增反應。2^-ΔΔCt法計算IDH1 mRNA表達。

1.5 MTT和克隆形成實驗檢測細胞增殖 各組U87細胞以2 000個/孔接種96孔板中，培養48 h后每孔內添加20 μL MTT溶液，置于培養箱繼續培養4 h其培養基，加入150 μL二甲基亞砜，置于酶標儀490 nm測定A值，計算細胞活性（%）。

克隆形成實驗：各組U87細胞使用胰酶消化吹打，細胞懸液以2×105個接種6孔板內，置于培養箱中培養2周，肉眼可見有團落形成，其培養基，加入4%多聚甲醛固定、結晶紫染色，漂洗4次晾干后，用顯微鏡觀察細胞克隆數目。

1.6 Transwell檢測細胞遷移 各組U87細胞用不含血清培養基饑餓處理24 h，調整成密度為1×105個/mL，在Transwell上室加入100 μL懸液，下室加500 μL含血清培養，培養24 h，拿棉簽擦掉未穿膜細胞，4%多聚甲醛固定、結晶紫染色，漂洗4次晾干后，用顯微鏡觀察細胞遷移數目。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡 各組U87細胞用預冷磷酸鹽緩沖處理，調整細胞懸液為1×105個/mL，24 h后加入500 μL Binding Buffer，參考凋亡試劑盒說明書，先后加入5 μL Annexin VFITC、5 μL PI，遮光孵育15 min，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.8 Western Blot檢測蛋白表達 收集膠質瘤組織、癌旁組織、正常膠質細胞NHAs、人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87及培養24 h的各組U87細胞，加100 uL細胞裂解液，置于4 ℃搖床上30 min，將細胞液轉移至EP管內，12 000 rpm/min離心20 min取上清液，BCA法測定蛋白濃度，蛋白樣品、5×上樣緩沖液以4∶1混合，沸水變性5 min，經10%凝膠電泳處理后，轉膜、封閉培養2 h，加入相應一抗4 ℃過夜孵育，37 ℃加HRP標記的二抗稀釋液孵育2 h，加顯色試劑顯影后、拍照，采用Image J分析各條帶灰度值。

1.9 統計學分析 用SPSS 25.0軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（x-±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析。以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 在膠質瘤組織和細胞中IDH1表達水平 與癌旁組織相比，膠質瘤組織中IDH1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）；與正常膠質細胞NHAs相比，人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87中IDH1 mRNA和蛋白表達水平明顯降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 IDH1質粒轉染效率驗證 為驗證IDH1-R132H、IDH1 wt質粒轉染效率，在U87細胞中轉染24 h后RT-qPCR結果顯示，與對照組或Vector組比較，IDH1 wt組、IDH1-R132H組中IDH1 mRNA表達升高（P＜0.05）。在U87細胞轉染24 h后提取蛋白，Flag抗體進行Western Blot，結果顯示，IDH1 wt組、IDH1-R132H組細胞均表達帶有Flag標簽IDH1，證明轉染IDH1-R132H及IDH1 wt轉染成功。見圖2。

2.3 IDH1-R132H突變體對膠質瘤細胞增殖和遷移的影響 與對照組或Vector組比較，IDH1-R132H組細胞活性、PCNA、MMP-2蛋白表達明顯降低，克隆細胞數和遷移細胞數減少（P＜0.05），但對照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表1、圖3。

2.4 IDH1-R132H突變體對膠質瘤細胞凋亡的影響與對照組或Vector組比較，IDH1-R132H組細胞凋亡率、Bax蛋白表達明顯增加，Bcl-2蛋白表達顯著降低（P＜0.05），但對照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表2、圖4。

2.5 IDH1-R132H突變體對膠質瘤細胞HIF-1α通路相關蛋白的影響 與對照組或Vector組比較，IDH1-R132H組VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達明顯升高（P＜0.05），但對照組、Vector組、IDH1 wt組上述指標兩兩比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3、圖5。

3 討 論

IDH是三羧酸循環中關鍵限速酶，可催化異檸檬酸氧化生成草酰琥珀酸，進一步氧化脫羧促進α-酮戊二酸，在細胞能量生成和合成中具有重要作用^［9］。據報道顯示，IDH基因分為IDH1、IDH2、IDH3，根據輔酶不同分為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）依賴性、NAD+依賴性，其中IDH1、IDH2屬于前者，IDH3屬于后者^［10］。有報道顯示，與膠質瘤關系最為密切的是IDH1，主要由細胞質和過氧化物酶分泌，位于染色體2q33.3區域，對細胞抗氧化有重要作用，IDH1突變類型包括R132H、R132L、R132G、R132S、R132C、R132Q，其中突變體R132H類型最為常見^［11］。IDH1-R132H突變不僅改變IDH1催化活性，還可降低α-酮戊二酸和NADP+，從而改變細胞正常代謝過程^［12］。

有研究報道顯示，IDH1在膠質瘤細胞中表達降低，免疫組化法和WB法顯示，IDH1-R132H突變率為51.4%，且與患者臨床分期、病理類型、Ki-67陽性密切相關，證明了IDH1-R132H可影響膠質瘤發生發展^［13］。Li等^［14］發現，過表達IDH1-R132H可抑制膠質瘤細胞增殖和誘導凋亡，并抑制細胞遷移和侵襲，體內小鼠實驗證實，過表達IDH1-R132H也可抑制小鼠移植瘤小鼠生長。Cui等^［15］的研究顯示，IDH1-R132H突變體可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲，并阻礙膠質母細胞瘤干細胞神經球形成。本研究發現，在膠質瘤組織中IDH1 mRNA和蛋白表達低于癌旁組織，在人神經膠質母細胞瘤細胞T98G、U138、U87中IDH1 mRNA和蛋白表達低于正常膠質細胞NHAs，這與杜寧等的研究一致^［13］。由于IDH1 mRNA和蛋白表達水平在U87細胞中表達最低，故選擇其進行后續實驗。將空載體、過表達IDH1-R132H、IDH1 wt質粒轉染U87細胞中，qRT-PCR和Western Blot證明其IDH1 wt、IDH1-R132H轉染成功。

PCNA、MMP-2是細胞增殖和遷移標志物，在膠質瘤中表達升高，可誘導膠質瘤細胞增殖和遷移^［16］。本研究發現，過表達IDH1-R132H可降低細胞活性、PCNA、MMP-2蛋白表達，并減少克隆細胞數和遷移細胞數，但過表達IDH1 wt無明顯變化，可見過表達IDH1-R132H可抑制膠質瘤U87細胞增殖和遷移。Bax和Bcl-2是凋亡常見標志物，可拮抗共同促進腫瘤細胞凋亡^［17］。本研究中，過表達IDH1-R132H增加細胞凋亡率、Bax蛋白表達，降低Bcl-2蛋白表達，但過表達IDH1 wt無明顯變化，可見過表達IDH1-R132H可誘導膠質瘤U87細胞凋亡。

腫瘤細胞處于缺氧狀態，可促進細胞增殖速度，加快腫瘤惡性進展，導致血供不足，故腫瘤內部常處于缺氧狀態，導致HIF-1表達上調^［18］。大量研究發現，HIF-1通過調節多種上下游因子參與信號轉導途徑，進而參與腫瘤細胞增殖、遷移、糖酵解和凋亡等過程^［1920］。HIF-1激活后可刺激VEGF基因與缺氧反應元件序列結合，通過轉錄后調控增加VEGF表達水平，進而促進腫瘤血管生成^［21］。有研究報道顯示，胃復方可通過抑制HIF-1α/VEGF通路從而發揮抗腫瘤效應^［22］，但其在膠質瘤細胞中研究報道較少。本研究中過表達IDH1-R132H可增加VEGF、HIF-1α、HIF-2α蛋白表達，但過表達IDH1 wt無明顯變化，可見過表達IDH1-R132H對膠質瘤U87細胞的惡性進展可能與HIF-1α/VEGF通路有關，但具體作用機制尚不清楚，需要進一步探究。

綜上所述，過表達IDH1-R132H抑制膠質瘤U87細胞增殖和遷移，并誘導細胞凋亡，可能與調節HIF-1α通路有關，但具體作用機制有待考究，需要后續實驗探究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：方松負責設計研究方案；唐國強、葉友忠負責實驗操作；李明松負責論文修改；陳加貝負責文獻查找及數據分析。

［參" 考"" 文"" 獻］

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基金項目：2020年湘南學院校級科學研究項目（2020XJ133）；2024年湘南學院校級科學研究項目（2024XJ124）

通信作者：陳加貝