基于轉(zhuǎn)錄組序列的萬壽菊SSR標記開發(fā)及應用

摘要：萬壽菊（Tagetes erecta）是國內(nèi)外廣泛栽植的一年生草本花卉，具有重要的觀賞、藥用和經(jīng)濟價值。基于轉(zhuǎn)錄組測序結果挖掘萬壽菊簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）位點信息，并對萬壽菊屬的2個品種、24個品系進行遺傳多樣性分析和聚類分析。結果表明，轉(zhuǎn)錄組測序共挖掘到10 182 個SSR位點，出現(xiàn)頻率為16.07%，平均6.15 kb出現(xiàn)1個SSR位點。SSR位點共出現(xiàn)259種基序重復類型，其中三核苷酸是主要重復類型（48.51%），其次是二核苷酸（27.05%），二核苷酸、三核苷酸的優(yōu)勢重復基元分別為AG/CT（37.22%）、ATC/ATG（28.63%）。篩選出10個多態(tài)性位點用于萬壽菊資源的遺傳多樣性分析，平均期望雜合度（He）、多態(tài)性信息含量（PIC）分別為0.361、0.364。26份萬壽菊材料的平均Shannon息指數(shù)（I）、期望雜合度（He）分別為0.642、0.475，遺傳距離介于0.027～0.913之間，表明供試材料的遺傳多樣性較豐富。非加權配對算數(shù)平均法（UPGMA）聚類分析結果表明，26份萬壽菊材料在相似系數(shù)0.69處可分為兩大類，其中花色相同的萬壽菊屬品種（系）聚為一類。綜上，萬壽菊轉(zhuǎn)錄組中SSR的出現(xiàn)頻率較高、類型豐富、多態(tài)性高，為萬壽菊種質(zhì)資源鑒別與利用、遺傳圖譜構建和分子標記輔助選擇等提供了備用分子標記，研究結果為今后萬壽菊核心種質(zhì)的選擇、新品種的選育奠定了理論基礎。

關鍵詞：萬壽菊；簡單重復序列（SSR）；多態(tài)性引物；遺傳多樣性

中圖分類號：S682.1⁺10.32""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0023-08

萬壽菊（Tagetes erecta）為菊科萬壽菊屬一年生草本植物，因其具有花色艷麗、花大、花期長、適應性強等優(yōu)點而被廣泛應用于園林景觀布置中。萬壽菊花朵富含葉黃素，是食用色素及保健品的天然植物來源^［1-3］。此外，萬壽菊的根部富含噻吩類化合物，可用于生產(chǎn)生物殺蟲劑、替代化學藥劑，有顯著的生態(tài)效益^［4］。

分子標記是進行植物遺傳多樣性研究及品種鑒定的有效工具之一。簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）為共顯性標記，具有數(shù)量多、特異性好、多態(tài)性信息豐富、易于檢測、可重復性好等優(yōu)點，被廣泛應用于種質(zhì)資源遺傳多樣性研究、遺傳關系與遺傳結構分析、遺傳圖譜構建、分子標記輔助育種等方面^［5］。在萬壽菊屬植物分子標記開發(fā)與利用方面的研究取各了很多成果。例如，何燕紅利用（簡單序列重復區(qū)間擴增多態(tài)性（ISSR）、相關序列擴增多態(tài)性（SRAP）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）標記結合混合分組分析法（BSA）技術，篩選得到與萬壽菊雄性不育基因緊密連鎖的1個SRAP標記和4個AFLP標記^［6］。牟丹利用ISSR、隨機擴增多態(tài)性（RAPD）、SRAP標記篩選出與萬壽菊雄性不育相關的分子標記，并轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的特定序列擴增（SCAR）標記用于萬壽菊雄性不育、雄性可育植株的苗期鑒定^［7］。侯志強等利用開發(fā)的萬壽菊SRAP標記對70份萬壽菊雜交后代優(yōu)選株系進行遺傳多樣性和家系分析，為育種親本選配提供信息^［8］。Panwar等利用ISSR、通用引物（URP）標記分析了22個萬壽菊基因型的遺傳多樣性^［9］。張華麗等進行了菊花（Chrysanthemum morifolium）表達序列標簽SSR（EST-SSR）標記的開發(fā)及其對萬壽菊的可轉(zhuǎn)移性分析，結果表明，14對有效引物中有8對可以在萬壽菊中擴增出清晰穩(wěn)定的條帶，可轉(zhuǎn)移率為57.14%^［10］。Majumder等利用ISSR分子標記對誘變獲得的萬壽菊突變體進行變異分析^［11］。汪歡笑基于表型性狀、SSR標記分析了萬壽菊種質(zhì)的遺傳多樣性，構建了當前的萬壽菊初級核心種質(zhì)^［12］。

筆者所在課題組前期利用8對SSR引物對9個萬壽菊雄性不育兩用系材料進行了遺傳多樣性分析^［13］。楊潔利用4對SSR引物構建了6個萬壽菊屬品種（系）的指紋圖譜，為萬壽菊屬品系的特異性、真實性鑒定奠定了理論基礎^［14］。但是，目前關于萬壽菊SSR標記開發(fā)與利用的報道還相對較少。因此，本研究以筆者所在課題組前期工作中對萬壽菊雄性不育兩用系2-2可育、不育花蕾的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，開發(fā)SSR標記并對26份萬壽菊種質(zhì)資源進行遺傳多樣性分析，以期為萬壽菊核心種質(zhì)的選擇、新品種的選育提供理論依據(jù)。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

本研究于2023年3—12月在青海大學高原花卉研究中心分子實驗室進行，以該中心提供的26份萬壽菊品種（系）為材料，其中高稈品系10份，中稈品種2份，矮稈品（種）系14份（表1）。其中，雪域3號、雪域1號為品種，D-1×C-19、D-1×C-21、YS、G10為雜交后代，C-19、C-21、C-13、B-4為常規(guī)品系，其余16份材料為雄性不育兩用系。各品種（系）于盛花期隨機選取3個單株（雄性不育兩用系取可育單株）的幼嫩葉片，用液氮冷凍后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2"DNA提取及質(zhì)量檢測

采用改良十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取供試材料的植物基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳、核酸蛋白儀檢測DNA的質(zhì)量與濃度，將樣品于-20 ℃ "冰箱中保存?zhèn)溆?sup>［15］。

1.3"SSR位點的鑒別

筆者所在課題組前期委托廣州基迪奧生物科技有限公司對萬壽菊雄性不育兩用系2-2的可育株、不育株花蕾進行二代轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)組裝^［16］。使用MISA程序查找SSR位點，查找標準如下：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復次數(shù)分別≥7、≥5、4、4、4次。

1.4"引物設計與篩選

用Primer Premier 5.0設計引物，具體標準如下：引物長度為18～25 bp，GC含量為40%～60%，退火溫度（Tm）為51～59 ℃，預計產(chǎn)物長度為200～300 bp。隨機選取60對SSR引物，以萬壽菊雄性不育兩用系2-2基因組DNA為模板進行PCR擴增。擴增體系及反應程序參照楊潔等的方法^［14］，總量為25 μL的體系中包含12.5 μL 2×Taq PCR Master Mix、1 μL模板DNA、各1 μL上下游引物、9.5 μL滅菌雙蒸水。反應程序如下：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，51～60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，38個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃ 保存^［14］。首先用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，初步篩選出條帶清晰、明亮且擴增產(chǎn)物符合預期大小的引物用于多態(tài)性引物篩選。

1.5"多態(tài)性引物的篩選及數(shù)據(jù)分析

利用初篩獲得的SSR引物對26份萬壽菊供試材料進行PCR擴增，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行引物的多態(tài)性分析，在220 V電壓條件下電泳90 min，用硝酸銀染色法顯色后觀察結果并拍照記錄。

計算SSR發(fā)生頻率（包含SSR位點的序列數(shù)/序列總數(shù)）、SSR出現(xiàn)頻率（識別的SSR位點數(shù)/序列總數(shù)）和平均分布距離（總堿基數(shù)/識別的SSR位點數(shù)）。用軟件Popgene 1.32計算有效等位基因數(shù)（Na）、香農(nóng)信息指數(shù)（I）、觀察雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、多態(tài)信息含量（PIC）、遺傳距離。用軟件NTSYS-pc 2.2進行UPGMA聚類分析。

2"結果與分析

2.1"萬壽菊轉(zhuǎn)錄組中SSR位點的分布與特點

萬壽菊雄性不育兩用系轉(zhuǎn)錄組的總長度為

在10 182個SSR位點中，三核苷酸為主要重復類型，共有4 939個，占總SSR位點的48.51%，其次分別是二核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸，分別占總SSR位點的27.05%、11.57%、6.71%、6.17%。從重復次數(shù)看，以5次重復的SSR位點最多，共3 213個，占SSR位點總數(shù)的31.56%，其次分別是6、4、7次重復，分別占25.50%、17.87%、12.60%，20次以上重復的SSR位點只有52個，占0.51%（表2）。

2.2"萬壽菊SSR基序重復類型及頻率特征

10 182個SSR位點中包含259種基序重復類型，其中二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸的重復類型分別有3、10、30、66、150 種。二核苷酸重復基序主要有AC/GT、AG/CT、AT/AT等3種（圖1），其中AG/CT重復類型最多，有1 025個，占二核苷酸重復總數(shù)的37.22%，占SSR位點總數(shù)的10.06%。三核苷酸中出現(xiàn)最多的重復類型是ATC/ATG（1 414個），占三核苷酸總數(shù)的28.63%，占SSR位點總數(shù)的13.89%。四核苷酸中出現(xiàn)最多的重復類型為ACAT/ATGT（205個），占四核苷酸重復總數(shù)的17.40%，占SSR位點總數(shù)的2.01%。五核苷酸重復類型中，每種重復基序類型的數(shù)量均低于100個，其中出現(xiàn)最多的重復類型是AATTC/AATTG（75個）， 占五核苷酸重復總數(shù)10.98%， 占SSR位點總數(shù)的0.74%。六核苷酸重復基元中出現(xiàn)最多的是AAGATG/ATCTTC（39個），占六核苷酸重復總數(shù)的6.21%，占SSR位點總數(shù)的0.38%。

2.3"萬壽菊SSR標記篩選及多態(tài)性分析

引物初篩結果表明，60對引物中有41對可以擴增出清晰明亮的條帶。用這41對引物對26份萬壽菊屬品種（系）基因組DNA進行PCR擴增，結果表明，編號為U104、U113、U203、U335、U461、U1205、U1203、U1757、U2041、U2261的10個SSR標記能穩(wěn)定擴增出目標條帶且具有多態(tài)性（圖2），多態(tài)性位點比例為24.39%。

10個SSR多態(tài)性標記在26份萬壽菊材料中的有效基因數(shù)平均1.614個，有效等位基因數(shù)最少的為1.122個（U1205），最多的為1.997個（U335）。Shannon’s多樣性指數(shù)（I）的分布范圍為0.221～0.692，平均為0.539；觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）的變化范圍分別為0.039～0.654、0.109～0.499，平均分別為0.273、0.361；多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.114～0.503，平均為0.364，其中U335的多態(tài)性信息含量大于0.5（表3）。

2.4"基于SSR標記的萬壽菊遺傳多樣性分析

26份萬壽菊屬品種（系）的有效等位基因數(shù)（Ne）范圍為1.600～2.000個，平均值為1.841個；Shannon^，s多樣性指數(shù)（I）的范圍為0.562～0.693，平均值為0.642；期望雜合度（He）在0.395～0.526之間，平均值為0.475（表4）。上述結果說明，26份萬壽菊供試材料的遺傳多樣性豐富。遺傳距離介于0.027～0.913之間（表5），其中D-1和5-2間的遺傳距離最大（0.913），C-16與B-4、C-13間的遺傳距離最小（0.027），說明D-1和5-2間的親緣關系最遠，C-16與B-4、C-13這2個品系間的親緣關系最近。

UPGMA聚類分析結果表明，當相似系數(shù)為0.69時，26份萬壽菊材料可分為兩大類（圖3）。結合表型性狀可知，這兩大類的劃分與花色具有相關性，其中第一大類（A）由15個品種（系）組成，花色以淺黃色為主，第二大類（B）由11個品種（系）組成，花色以橙黃色為主。當相似系數(shù)為0.77時，第一大類可進一步分為2個亞類，其中第1亞類（A1）由12個品系組成，大部分為矮稈，第二亞類（A2）包括3個品系，均為高稈。第二大類（B）進一步也可分為2個亞類，第1亞類（B1）包括9個品種（系），第2亞類（B2）僅包含C-20、2-2等2個品系。

3"結論與討論

萬壽菊有重要的觀賞、藥用和經(jīng)濟價值，是國內(nèi)外廣泛栽植的一年生草本花卉。本研究從萬壽菊轉(zhuǎn)錄組中挖掘到10 182個SSR位點，其出現(xiàn)頻率為16.07%。在已有報道中，不同植物材料中SSR的出現(xiàn)頻率相差較大，張華麗等從萬壽菊雄性不育系S-121中挖掘出13 849個SSR位點，出現(xiàn)頻率為28.29%；盛文濤等在甜葉菊（Stevia rebaudiana）的5 646個unigenes中挖掘出88個SSR位點，出現(xiàn)頻率僅為1.60%。上述結果說明，SSR的出現(xiàn)頻率可能與物種本身基因組有關，也可能受到挖掘SSR位點的方式及篩選標準的影響^［17-20］。

本研究挖掘的SSR位點中包含259種基序重復類型，其中主導重復類型為二核苷酸、三核苷酸，分別占SSR位點總數(shù)的27.05%、48.51%。AG/CT、ATC/ATG在二核苷酸、三核苷酸重復類型總數(shù)中的占比最大，分別為37.22%、28.63%，這與張華麗等的研究結果^［17］一致。此外，金雞菊（Coreopsis lanceolata）、向日葵（Helianthus annuus）、黃纓菊（Xanthopappus subacaulis）、黃花蒿（Artemisia annua）中開發(fā)的SSR位點也表現(xiàn)出相同的主導重復類型^［21-24］。在乒乓菊（Dendranthema morifolium cv. pompon）、非洲菊（Gerbera jamesonii）的SSR位點中，單核苷酸為主要重復類型，并且A/T占比最大，與萬壽菊基序重復類型存在較大差異^［25-26］。由此可以看出，同科植物的SSR重復類型沒有表現(xiàn)出明顯相同的規(guī)律，但二核苷酸、三核苷酸是最常見的SSR重復類型^［27］。

本研究從隨機選取的60個SSR標記中篩選出10個（24.39%）多態(tài)性標記，PIC平均值為0.361。當0.25lt;PIClt;0.5時，表示標記具有中度多態(tài)性，本研究選擇的5個標記（U203、U335、U1757、U2041、U2261）的PIC值高于平均值，表明其變異程度高、多態(tài)性好，可以在萬壽菊種質(zhì)資源評價和品種鑒定等研究中作為重點標記加以應用^［28］。利用10個多態(tài)性標記對26份萬壽菊屬品種（系）進行遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)供試材料具有豐富的遺傳多樣性， 其Shannon^，s信息指數(shù)（I）、 期望雜合度（He）的平均值分別為0.642、0.475，高于張華麗等報道的20份萬壽菊自交系的Shannon^，s信息指數(shù)（0.408）、期望雜合度（0.275）^［17］。UPGMA聚類結果顯示，當相似系數(shù)為0.69時，26份供試材料可分為花色不同的兩大類，這與風信子（Hyacinthus orientalis）的研究結果^［29］一致。總體來看，萬壽菊轉(zhuǎn)錄組中SSR出現(xiàn)頻率較高、類型豐富且多態(tài)性高，為萬壽菊種質(zhì)資源鑒別與利用、遺傳圖譜構建和分子標記輔助選擇等提供了候選分子標記，遺傳多樣性分析為今后萬壽菊的新品種選育奠定了重要的理論基礎。

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